苓桂術甘湯調控自噬對多柔比星抗非酒精性脂肪肝病相關肝細胞癌的增效作用Δ

曹慧敏，孔 亮，隋國媛，吳 瑾，賈連群#（.遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟象理論及應用教育部重點實驗室，沈陽 0847；2.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 6600）

據國際癌癥研究機構最新發(fā)布的《2020全球癌癥報告》，肝癌是全球第六大常見癌癥，也是導致癌癥相關死亡的第三大常見原因[1]。原發(fā)性肝癌主要有兩種類型——肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內膽管癌，HCC占全世界原發(fā)性肝癌的80%以上。隨著肥胖和糖尿病的流行，非酒精性脂肪肝病相關肝細胞癌（non-alcoholic fatty liver disease-hepatocellular carcinoma，NAFLD-HCC）發(fā)病率不斷攀升，非酒精性脂肪肝病已成為全球HCC發(fā)病和死亡增長最快的病因。相比病毒相關的HCC，NAFLD-HCC 缺乏有效的治療手段，手術根治率低，患者病死率高、生存期更短[2]。目前，進行腫瘤切除后化療已成為大多數癌癥治療的主要策略。多柔比星（doxorubicin，DOX）是一線化療藥物，也是肝癌患者全身化療的有效藥物之一，通過抑制腫瘤細胞核酸的合成發(fā)揮抗腫瘤活性[3]。雖然DOX的作用機制明確、療效顯著，但其具有一定的毒性及耐藥性[4]，因此，降低DOX使用劑量，提高化療敏感性，是目前亟須解決的問題。中藥復方具有多種作用成分，可通過多靶點、多途徑產生抗腫瘤作用，配合放化療，在腫瘤治療過程中可實現增效減毒效果[5]。

自噬參與機體的許多病理生理過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療有著密切的聯系。誘導腫瘤細胞凋亡，一直以來是各類腫瘤治療的根本目標。凋亡耐受是產生腫瘤耐藥的重要機制，自噬性細胞死亡是凋亡耐受腫瘤細胞的一種死亡方式。但是，細胞自噬又可防止抗腫瘤藥物誘導的凋亡，促進腫瘤耐藥。因此，自噬在腫瘤化療耐藥性中發(fā)揮著促進或抑制耐藥的雙重作用[6]。從細胞自噬角度探索中醫(yī)藥治療腫瘤、降低化療藥物耐藥性的新靶點，具有重要的臨床意義和廣泛的應用前景。

苓桂術甘湯（Linggui zhugan decoction，LGZG）出自《傷寒雜病論》，為健脾溫陽化濁的代表方，本課題組前期研究表明LGZG 可抑制NAFLD-HCC 的發(fā)生發(fā)展[7]。但是，LGZG對DOX治療NAFLD-HCC耐藥的影響及分子機制尚不清楚。本研究擬以自噬為切入點，深入探討LGZG對DOX治療NAFLD-HCC效果的影響及機制，以期為提高DOX治療NAFLD-HCC敏感性提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SpectraMaxi3 型多功能全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司），ASP 6025型高性能組織脫水機、RM2235 型手動石蠟切片機、EG1150H型包埋機（德國Leica公司），M8型數字掃描顯微成像系統(tǒng)（德國PreciPoint 公司），1658001 型Mini-PROTEAN Tetra垂直板電泳裝置、1704150型Trans-Blot SD型半干轉印儀（美國Bio Rad公司），5200型全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

茯苓（批號230301）、桂枝（批號230201CP0494）、白術（批號2301）、甘草（批號230301）均購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，全部飲片經遼寧中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為真品，且質量均符合2020年版《中國藥典》（一部）的相關要求。

二乙基亞硝胺（批號D0516）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鹽酸多柔比星（批號MB1087）購自大連美侖生物技術有限公司；蘇木素染液（批號C0105S）購自上海碧云天生物技術有限公司；改良Masson三色染色試劑盒（批號G1346）購自北京索萊寶科技有限公司；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）（批號分別為F2632-A、F2630-A）均購自上?？婆d生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（批號分別為20210806、20210809、20210806、20210809）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated proteins 1A and 1B，LC3）、芐氯素1（Beclin1）、選擇性自噬接頭蛋白P62、B 細胞淋巴瘤2 相關X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、增殖標志物Ki-67蛋白多克隆抗體和鼠源B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號分別為14600-1-AP、11306-1-AP、18420-1-AP、50599-2-Ig、60004-1-Ig、28074-1-AP、68103-1-Ig）均購自武漢Proteintech公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗（批號分別為CW0103、CW0102）均購自江蘇康為世紀生物科技有限公司。

1.3 實驗動物與飼料

3周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠50只，體重（10±2）g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（遼）2021-0001。小鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，自由飲水進食。實驗符合遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會標準（倫理批準號21000042022042）。高脂飼料（10%豬油、5%蔗糖、1%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%甲基硫氧嘧啶、83.3%普通飼料）購自小黍有泰（北京）生物科技有限公司，批號為200426012。

2 方法

2.1 LGZG水提液的制備

取茯苓25 g、桂枝25 g、白術15 g、甘草10 g，混合后加入10倍量水浸泡1 h后，加熱回流提取2 h；過濾，回收溶劑，再加入10 倍量水繼續(xù)回流提取2 h；合并2 次濾液，濃縮成質量濃度為1 g/mL 的溶液（以生藥量計），于4 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

2.2 動物分組干預及取材

50只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數字表法分為空白組、NAFLD-HCC 組、LGZG 組、DOX 組、DOX+LGZG 組，每組10 只。除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射二乙基亞硝胺溶液（50 mg/kg），每周1 次，連續(xù)8周[8]。小鼠在給予二乙基亞硝胺溶液4 周后，再同時以高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)12 周，建立NAFLD-HCC 小鼠模型[7]；空白組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。建模后，按人與小鼠體表面積比換算給藥等效劑量，各給藥組小鼠分別灌胃LGZG 水提液（20 g/kg[7]）和/或腹腔注射DOX 溶液（8 mg/kg[7]），空白組、NAFLD-HCC組小鼠灌胃等量生理鹽水，每日1 次，干預4 周。藥物干預結束后，小鼠眼球取血后靜置2 h，以3 000 r/min離心20 min，取上清液，—80 ℃保存。取一半小鼠的肝臟組織用4%多聚甲醛固定，另一半小鼠的肝臟組織凍存于—80 ℃冰箱，備用。

2.3 小鼠的一般情況、體重、肝重及肝臟系數的比較

在模型建立及藥物干預期間，對小鼠的飲食、毛色和狀態(tài)等一般情況進行監(jiān)測；藥物干預結束后，眼球采血前稱量小鼠體重，取材時，快速取出肝臟，肉眼觀察小鼠肝臟形態(tài)并稱重，每組隨機選取6只小鼠計算肝臟系數。肝臟系數＝肝重（g）/體重（g）×100%。

2.4 小鼠肝臟組織病理形態(tài)學觀察

采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠肝臟組織病理形態(tài)。每組隨機選取固定在4%多聚甲醛中的3只小鼠肝臟組織，經乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，進行石蠟包埋和切片；取部分石蠟切片按HE 染色常規(guī)方法進行染色（剩余部分用于后續(xù)Masson 染色及免疫組化染色），然后采用數字掃描顯微成像系統(tǒng)觀察肝臟組織病理形態(tài)。

2.5 小鼠肝臟組織纖維化程度檢測

采用Masson染色法檢測小鼠肝臟組織中膠原纖維含量的變化情況以明確小鼠肝臟組織纖維化程度。取“2.4”項下各組小鼠肝臟組織石蠟切片，按Masson 染色常規(guī)方法進行染色，切片經脫蠟、染色、分化、復染、脫水、透明后封固，以數字掃描顯微成像系統(tǒng)觀察。每張切片隨機選取3個不重復視野，采用Image J軟件計算肝臟膠原面積百分比以表示膠原纖維含量。肝臟膠原面積百分比（%）＝肝臟膠原面積/所測視野面積×100%。

2.6 小鼠血脂水平及血清中腫瘤標記物AFP、CEA 含量檢測

隨機選取6 只小鼠的血清，采用微板法檢測小鼠血脂水平（TG、TC、LDL-C和HDL-C水平），采用ELISA法檢測小鼠血清中AFP、CEA 含量，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.7 小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白及凋亡標志蛋白表達水平檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.4”項下各組小鼠（每組3只）肝臟組織石蠟切片，經熱抗原修復、滅活內源酶、封閉后，滴加Ki-67 和凋亡標志蛋白（Bax、Bcl-2）一抗（稀釋比均為1∶200）孵育1 h；PBS 清洗后加入二抗（稀釋比為1∶100）孵育30 min；以PBS 清洗后進行DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、脫水、封片和觀察。利用Image Pro plus 6.0 軟件進行免疫組化結果分析，以平均光密度值表示蛋白表達水平。

2.8 小鼠肝臟組織中自噬相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法進行檢測。每組隨機選取3 只小鼠的肝臟組織，每只取0.1 g，加入1 mL RIPA裂解液，充分勻漿并置于冰上裂解30 min，離心后取上清液；采用BCA 試劑盒檢測各組蛋白濃度，混合蛋白樣品和上樣緩沖液，在95 ℃條件下加熱5 min，以充分變性蛋白。以50 μg蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜；加 入LC3、Beclin1、P62 及GAPDH一抗（稀釋比分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃封閉過夜；以TBST 洗滌3 次，每次15 min，加入相應二抗（稀釋比為1∶10 000）室溫孵育1 h；經曝光、顯影后，應用化學發(fā)光成像系統(tǒng)觀察，利用AlphaView 凝膠圖像分析軟件進行圖像處理，以GAPDH作為內參蛋白，計算目標蛋白與內參蛋白的灰度值比值，以表示蛋白表達水平。LC3 在細胞中以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值表示LC3 蛋白的表達水平。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，多組間數據比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 小鼠一般情況、體重、肝重及肝臟系數的比較結果

在模型建立及藥物干預期間各組小鼠的飲食、活動均無明顯異常，NAFLD-HCC 組小鼠隨著給藥時間延長活動逐漸減少，精神萎靡，毛發(fā)蓬亂無光澤；給藥組小鼠整體情況均有改善。實驗結束時，與空白組比較，NAFLD-HCC組小鼠體重顯著降低（P＜0.05），肝重有上升趨勢，肝臟系數顯著增加（P＜0.05）；與NAFLD-HCC組比較，DOX組、LGZG組、DOX+LGZG組小鼠肝重和肝臟系數均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組小鼠體重、肝重和肝臟系數結果（±s，n＝6）

表1 各組小鼠體重、肝重和肝臟系數結果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與NAFLD-HCC組比較，P＜0.05。

組別空白組NAFLD-HCC組DOX組LGZG組DOX+LGZG組體重/g 26.99±1.72 20.38±2.90a 18.64±2.96 23.47±1.39 21.73±1.64肝重/g 1.30±0.05 1.43±0.12 1.02±0.23b 1.14±0.05b 1.01±0.11b肝臟系數/%0.048±0.00 0.071±0.01a 0.054±0.01b 0.049±0.00b 0.047±0.01b

3.2 小鼠肝臟組織病理形態(tài)學觀察結果

肉眼觀察結果顯示，空白組小鼠肝臟大小正常，表面光滑，顏色紅潤，質地柔軟；NAFLD-HCC組小鼠肝臟腫大，邊緣鈍而厚，表面粗糙，觸之有油膩感，仔細觀察有灰白色腫瘤結節(jié)；LGZG組小鼠肝臟表面顏色稍微改善，腫瘤結節(jié)數目較干預前減少；DOX組改善效果不明顯；DOX+LGZG 組小鼠肝臟表面顏色較干預前有較大改善，腫瘤結節(jié)數目明顯減少。結果見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織形態(tài)圖及HE染色圖

HE染色結果顯示，空白組小鼠肝小葉結構清晰、完整，細胞排列整齊，無脂肪變性，未見炎癥細胞浸潤；NAFLD-HCC 組小鼠肝細胞體積增大，有大量的空泡狀細胞，炎癥細胞大量浸潤，脂肪變性明顯，部分細胞出現氣球樣變、細胞密度增大、小細胞性增生的病變；LGZG組小鼠肝臟細胞質內可見細小空泡，炎癥細胞浸潤減輕；DOX組小鼠肝臟空泡樣變及炎癥細胞浸潤有改善效果但不明顯，DOX+LGZG組小鼠肝小葉結構恢復明顯，空泡樣變及炎癥細胞浸潤明顯減輕。結果見圖1。

3.3 小鼠肝臟組織纖維化程度的結果

Masson染色結果（見圖2）顯示，空白組小鼠肝臟組織無明顯染色；與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織癌細胞周圍纖維化，視野內有廣泛致密的藍色膠原沉積，藍染纖維間隔形成，膠原面積百分比顯著增加（P＜0.05），膠原纖維含量增多，纖維化程度加重；與NAFLD-HCC 組比較，LGZG 組、DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織纖維化范圍均有所減輕，尤其以DOX+LGZG 組小鼠改善最為顯著，膠原面積百分比顯著降低（P＜0.05），膠原纖維含量減少，纖維化程度減輕；與DOX 組比較，DOX+LGZG 組小鼠膠原面積百分比顯著降低（P＜0.05），肝臟纖維化程度減輕。

圖2 各組小鼠肝臟組織Masson染色圖及膠原面積百分比柱狀圖（n＝3）

3.4 小鼠血脂水平及血清中AFP、CEA含量的檢測結果

與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平及AFP、CEA 含量均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與NAFLD-HCC組比較，DOX組小鼠血清中CEA 含量顯著降低，LGZG 組、DOX+LGZG 組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平及AFP、CEA含量均顯著降低（P＜0.05），DOX+LGZG 組小鼠血清中HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠血脂水平及血清中AFP、CEA含量的檢測結果（±s，n＝6）

表2 各組小鼠血脂水平及血清中AFP、CEA含量的檢測結果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與NAFLD-HCC組比較，P＜0.05。

組別空白組NAFLD-HCC組DOX組LGZG組DOX+LGZG組TC/（μmol/mg）1.59±0.47 3.53±0.74a 3.16±0.82 2.35±0.26b 2.38±0.89b TG/（μmol/mg）0.63±0.24 2.68±0.27a 2.44±0.66 1.25±0.10b 1.24±0.20b LDL-C/（μmol/mg）0.99±0.24 4.79±0.55a 3.98±0.53 3.23±0.75b 3.26±0.46b HDL-C/（μmol/mg）11.01±4.50 3.06±1.87a 5.24±3.16 8.50±2.32 9.16±4.35b CEA/（ng/L）1.49±0.29 2.90±0.34a 2.35±0.33b 2.05±0.12b 1.98±0.16b AFP/（μg/L）100.39±33.62 259.03±53.50a 222.21±23.18 202.51±20.44b 187.97±15.42b

3.5 小鼠肝臟組織中Ki-67蛋白表達水平的檢測結果

與空白組比較，NAFLD-HCC組小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與NAFLD-HCC組比較，LGZG組、DOX+LGZG組小鼠肝臟組織中Ki-67蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與DOX 組比較，DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表3和圖3。

表3 各組小鼠肝臟組織中Ki-67、Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表3 各組小鼠肝臟組織中Ki-67、Bax、Bcl-2 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與NAFLD-HCC組比較，P＜0.05；c：與DOX組比較，P＜0.05。

Bcl-2平均光密度0.050±0.006 0.105±0.014a 0.087±0.003 0.070±0.007b 0.055±0.006bc組別空白組NAFLD-HCC組DOX組LGZG組DOX+LGZG組Ki-67平均光密度0.030±0.00 0.054±0.004a 0.048±0.002 0.041±0.002b 0.036±0.002bc Bax平均光密度0.059±0.003 0.041±0.002 0.069±0.005b 0.078±0.008b 0.125±0.008bc

圖3 各組小鼠肝臟組織中Ki-67蛋白免疫組化染色圖

3.6 小鼠肝臟組織中凋亡標志蛋白表達水平的檢測結果

與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織中Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NAFLD-HCC 組比較，DOX 組、LGZG 組、DOX+LGZG組小鼠肝臟組織中Bcl-2 蛋白表達水平均顯著降低（DOX 組除外），Bax 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與DOX 組比較，DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結果見表3和圖4。

圖4 各組小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2蛋白免疫組化染色圖

3.7 小鼠肝臟組織中自噬相關蛋白表達水平的檢測結果

與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織中Beclin1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，P62蛋白表達水平升高，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與NAFLD-HCC 組比較，DOX 組、LGZG組及DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織中Beclin1 蛋白表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，P62 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與DOX 組比較，DOX+LGZG組小鼠肝臟組織中Beclin1蛋白表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，P62 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖5。

圖5 各組小鼠肝臟組織中自噬相關蛋白的表達結果

4 討論

NAFLD-HCC 發(fā)病較為隱匿，多數患者確診時已是中晚期，喪失手術治療的時機，因此治療上以化療為主。雖然化療可以殺滅肝癌細胞，但其特異性差，長時間的化療有很大毒性，易損傷脾胃運化功能。因此，脾虛亦是肝癌化療后的重要病機，NAFLD-HCC 治療應采取扶正兼顧祛邪的原則。中藥聯合化療，能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、提高機體對化療的耐受力、延長生存期[9]。LGZG為健脾溫陽化濁的代表方，其中茯苓為君藥，健脾以化痰濕；桂枝為臣藥，溫通陽氣；白術為佐藥，健脾燥濕，又可補益脾陽；甘草為使藥，補中益氣，調和諸藥；四藥合用可使脾氣健運。故應用LGZG 作為NAFLDHCC治療或輔助化療用藥，符合中醫(yī)治病求本的治則。

本研究造模后肉眼觀察發(fā)現，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟有灰白色腫瘤結節(jié)。病理形態(tài)學染色可見肝組織細胞體積增大、脂肪變性，炎癥細胞大量浸潤，部分細胞出現氣球樣變，有小細胞性增生；肝臟組織中可見大量藍色膠原纖維表達。AFP與肝癌細胞的增殖密切相關，是原發(fā)性肝癌特異性最高的腫瘤標志物，CEA是一種廣譜性的腫瘤標志物，AFP、CEA 的聯合檢測是診斷原發(fā)性肝癌的重要指標[10]。本研究檢測發(fā)現，NAFLD-HCC組小鼠血清中AFP和CEA含量明顯升高。Ki-67又稱為核增殖抗原，是細胞增生指數的一種標志，其陽性表達率越高，腫瘤惡性程度越高[11]。本研究免疫組化結果顯示，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白表達水平明顯升高。上述結果均提示NAFLD-HCC 模型建立成功。本文對DOX、LGZG 及LGZG 聯合DOX 干預NAFLD-HCC 效果的影響進行了研究，結果顯示，以DOX、LGZG 及LGZG 聯合DOX 干預后，小鼠上述指標均有不同程度的改善，且LGZG 聯合DOX 的改善作用更明顯。然而，LGZG聯合DOX化療的增效減毒作用機制仍有待進一步探討。

化療藥物可通過誘導細胞凋亡而殺傷腫瘤細胞，腫瘤細胞對化療耐藥的實質是藥物不能活化其凋亡途徑，因此，凋亡耐受的腫瘤細胞是多種化療藥物產生耐藥性的主要原因[12]。研究發(fā)現，自噬介導的細胞死亡可增強NAFLD-HCC 化療敏感性[13]。因此，自噬可能是LGZG增效減毒、逆轉DOX腫瘤耐藥性的重要靶點。

Beclin1 是自噬體形成啟動復合物Class Ⅲ PI3K 的關鍵組分，在自噬的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[14]。LC3 是自噬過程的標志物，主要參與了自噬小體的形成，其合成后立即被自噬相關基因4剪切掉羧基端，形成胞漿型LC3 即LC3Ⅰ；隨后LC3Ⅰ會酶解掉一小段多肽，偶聯磷脂酰乙醇胺形成膜型LC3Ⅱ，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在一定程度上反映了自噬的程度[15]。自噬體形成過程中，P62 作為鏈接LC3 和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶降解，P62 蛋白的表達量與自噬活性呈負相關[16]。本研究發(fā)現，與DOX 組比較，DOX 聯合LGZG干預可以顯著誘導Beclin1蛋白表達上調和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62 蛋白表達下調，激活肝臟自噬發(fā)生。Beclin1 不僅參與自噬的起始階段，還可與抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用，抑制其抗凋亡作用，從而抑制腫瘤的增殖[17]。本研究發(fā)現，與DOX組比較，DOX聯合LGZG干預可使小鼠肝臟組織中Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低，Bax 蛋白表達水平明顯升高，促進肝癌細胞凋亡，增強NAFLD-HCC化療敏感性。

綜上所述，LGZG聯合DOX能夠協(xié)同促進肝臟腫瘤細胞的凋亡，增強NAFLD-HCC 化療敏感性，有效減緩原發(fā)性HCC 的發(fā)生發(fā)展，其機制可能與調節(jié)腫瘤細胞自噬的發(fā)生有關。