珍珠水解液對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞活力及肝竇毛細(xì)血管化的干預(yù)作用

彭岳　楊妙　林江　趙鐵建　劉鵬　劉茜玉　郭偉倩

摘要：目的 探討珍珠水解液對(duì)肝纖維化時(shí)肝竇毛細(xì)血管化病變的干預(yù)作用及機(jī)制。方法 合浦珍珠水解液與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（HSEC）和肝星狀細(xì)胞（HSC-LX2）共同孵育，采用MTT比色法測(cè)定HSEC和HSC-LX2的細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HSC-LX2的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，透射電鏡觀察HSEC的窗孔及基底膜等微結(jié)構(gòu)的變化情況。結(jié)果 瘦素激活后，HSC-LX2細(xì)胞活性顯著增高（P=0.041），HSEC則出現(xiàn)細(xì)胞活性顯著降低（P=0.004）、窗孔數(shù)量減少、窗孔直徑下降、連續(xù)基底膜形成等肝竇毛細(xì)血管化現(xiàn)象。瘦素干預(yù)后給予低、中、高不同濃度珍珠水解液治療，各濃度組均可使縮小及消失了的HSEC窗孔發(fā)生增多和擴(kuò)大（低濃度組：P=0.020；中濃度組：P=0.028；高濃度組：P=0.032），使HSEC外成片的基膜變得稀薄甚至消失（低濃度組：P=0.020；中濃度組：P=0.028；高濃度組：P=0.032）；使活化的HSC-LX2活力下降（低濃度組：P=0.018；中濃度組：P=0.013；高濃度組：P=0.009），并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡（低濃度組：P=0.012；中濃度組：P=0.006；高濃度組：P=0.005）。隨著珍珠水解液給藥濃度上升，干預(yù)肝竇毛細(xì)血管化的效果有梯度增高，具有劑量依賴(lài)性（低濃度組：P=0.020；中濃度組：P=0.028；高濃度組：P=0.032）。高濃度珍珠水解液干預(yù)肝竇毛細(xì)血管化的效果強(qiáng)于治療劑量的秋水仙堿（P=0.034）和丹參酚酸B（P=0.038）。結(jié)論 合浦珍珠水解液可使HSEC細(xì)胞的活性增加、窗孔面積恢復(fù)、基底膜消失，使激活的HSC-LX2細(xì)胞喪失活力并發(fā)生凋亡，具有針對(duì)HSEC及HSC-LX2的顯著的抗肝竇毛細(xì)血管化藥理學(xué)作用。

關(guān)鍵詞：珍珠水解液；抗肝纖維化；肝竇毛細(xì)血管化；窗孔；基底膜

中圖分類(lèi)號(hào)： R333.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1000-503X（2023）02-0185-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15204

Effects of Pearl Hydrolysate on Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell Viability and Capillarization in Liver Fibrosis

PENG Yue YANG Miao LIN Jiang ZHAO Tiejian LIU Peng4，LIU Qianyu GUO Weiqian2

ABSTRACT：Objective To study the effect and mechanism of pearl hydrolysate on hepatic sinusoidal capillarization in liver fibrosis.Methods Hepatic sinusoidal endothelial cells （HSEC） and hepatic stellate cells （HSC-LX2） were incubated with Hepu pearl hydrolysate.The proliferation of HSEC and HSC-LX2 was examined by MTT colorimetry.The cell cycle and apoptosis of HSC-LX2 were measured by flow cytometry.The changes of the microstructures such as fenestra and basement membrane of HSEC were observed by transmission electron microscopy.Results The intervention with leptin increased the viability of HSC-LX2 （P=0.041），decreased the viability of HSEC （P=0.004），and caused capillarization signs such as decreased number and diameter of fenestrae and formation of continuous basement membrane.The treatment with pearl hydrolysate at different doses increased and expanded the fenestrae of HSEC （low dose：P=0.020；medium dose：P=0.028；high dose：P=0.032），disintegrated the extracellular basement membrane of HSEC （low dose：P=0.020；medium dose：P=0.028；high dose：P=0.032），decreased the viability of HSC-LX2 （low dose：P=0.018；medium dose：P=0.013；high dose：P=0.009），and induced the apoptosis of HSC-LX2 （low dose：P=0.012；medium dose：P=0.006；high dose：P=0.005）.Pearl hydrolysate exerted therapeutic effect on capillarization in a dose-dependent manner （low dose：P=0.020；medium dose：P=0.028；high dose：P=0.032）.Moreover，high-dose pearl hydrolysate showed stronger effect on capillarization of hepatic sinuses than colchicine （P=0.034） and salvianolic acid B （P=0.038）.Conclusion Hepu pearl hydrolysate can increase the viability of HSEC，restore the area of fenestrae，disintegrate the basement membrane，and decrease the viability and induce the apoptosis of HSC-LX2，demonstrating significant pharmacological effects on the capillarization of HSEC and HSC-LX2.

Key words：pearl hydrolysate；anti-hepatic fibrosis；hepatic sinusoidal capillarization；fenestrae；basement membrane

Acta Acad Med Sin，2023，45（2）：185-192

肝纖維化時(shí)，肝臟受到各種理化因素持續(xù)性損傷刺激，肝臟產(chǎn)生慢性炎癥，肝細(xì)胞變性壞死。同時(shí)，肝細(xì)胞也在發(fā)生自我修復(fù)，肝組織不規(guī)則地重建及增生，形態(tài)紊亂，造成肝臟內(nèi)血液循環(huán)被顯著改變。肝纖維化階段有兩個(gè)特點(diǎn)：（1）各類(lèi)型慢性肝病發(fā)展中后期的共同病變和共同歸途；（2）其早期階段具有較確切的可干預(yù)性、可逆性［1］。研究顯示發(fā)生肝纖維化時(shí)，血液與肝細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換的關(guān)鍵屏障—肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（hepatic sinusoidal endothelial cell，HSEC）的特征性結(jié)構(gòu)窗孔數(shù)量發(fā)生減少、直徑顯著縮??；HSES與肝細(xì)胞之間則出現(xiàn)連續(xù)成片的基底膜［2］。窗孔的縮小或消失、連續(xù)性基底膜形成如果合并 肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化增殖，三者合稱(chēng)為肝竇毛細(xì)血管化，是肝纖維化和肝硬化疾病過(guò)程中較獨(dú)特的、標(biāo)志性的病理變化過(guò)程［3］；該病變可導(dǎo)致肝臟的血液循環(huán)進(jìn)一步受阻惡化，肝臟與血液之間的物質(zhì)交換不利，加速肝纖維化的進(jìn)程［4］。

珍珠性寒，味甘、咸，歸心、肝經(jīng)。是治療心經(jīng)、肝經(jīng)疾病的常用中藥。珍珠具有平肝潛陽(yáng)、清肝明目、清熱化瘀、寧心安神、美容養(yǎng)顏的臨床療效［5］。其中以南珠粒大、珠圓、珠層厚、色粉，嫩而晶瑩，藥用價(jià)值高。我國(guó)北部灣一帶所產(chǎn)的珍珠就屬于南珠范疇，以合浦珍珠最負(fù)盛名，是南珠的優(yōu)質(zhì)代表［6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，合浦珍珠水解液可對(duì)肝纖維化病變的核心細(xì)胞—HSC的增殖活力產(chǎn)生顯著抑制，并可誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生早期、晚期凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生抑制肝臟纖維結(jié)締組織增生與變質(zhì)，改善組織微循環(huán)障礙的作用［7］。本研究對(duì)廣西合浦珍珠水解液的抗肝纖維化作用、改善肝臟微循環(huán)作用及其機(jī)制進(jìn)行探索，旨在了解合浦珍珠是否具有抑制肝竇毛細(xì)血管化的病變過(guò)程，進(jìn)而干預(yù)肝纖維化發(fā)展的作用。

材料和方法

材料 細(xì)胞株：人HSC-LX2細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所徐列明教授提供，大鼠HSEC細(xì)胞株（批號(hào)：MIC-iCell-d019）為上海賽百慷生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：MCO-15AC）為日本SANYO公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡（型號(hào)：ECLIPSE Ts2）為日本Nikon公司產(chǎn)品，低速離心機(jī)（型號(hào)：5702R）為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀（型號(hào)：CxtoFLEX）為美國(guó)BECKMAN公司產(chǎn)品，透射電子顯微鏡（型號(hào)：H-7650）為日本HITACHI公司產(chǎn)品，數(shù)碼相機(jī)（型號(hào)：5D mark2）為日本Canon公司產(chǎn)品。試劑：秋水仙堿（批號(hào)：191003）為西雙版納藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，丹參酚酸B（批號(hào)：20191220）為西安金綠生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品，四甲基噻唑藍(lán)（批號(hào)：191M2466W）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素、碘化丙啶雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡測(cè)試盒（批號(hào)：E-CK-A211）為Elabscience公司產(chǎn)品。

合浦珍珠水解液的制備 合浦珍珠水解原液由北海市寶珠林海洋科技有限公司提供，按《中國(guó)藥品專(zhuān)利》的配制方法以生物酶低溫水解珍珠技術(shù)生產(chǎn)［8］，原液經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析教研室鑒定，100 g中含鈣64.2 mg、鋅2.1 mg。原液以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基將濃度為1 g/L的60 ml珍珠水解液稀釋定容至100 ml，制備得100 ml（600 mg/L）的珍珠水解液，過(guò)濾除菌后備用。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組的藥物濃度設(shè)計(jì)，將水解液稀釋為相應(yīng)的工作液。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組 將HSC-LX2、HSEC各自混勻至含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，分別接種入培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好、密度至培養(yǎng)瓶底80％左右、貼壁狀況佳（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）時(shí)，以0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化，制成單細(xì)胞懸液，新鮮培養(yǎng)液將其重新懸浮，按檢測(cè)項(xiàng)目需要，將細(xì)胞懸液接種入6孔或96孔培養(yǎng)板。置入CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h（細(xì)胞完全貼壁），以培養(yǎng)板的孔為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。

將HSC-LX2、HSEC細(xì)胞分別按下述方法分為7組：（1）空白對(duì)照組：標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，不添加干預(yù)因素；（2）瘦素激活對(duì)照組：培養(yǎng)液中滴加終濃度為100 μg/L的瘦素，病理激活細(xì)胞；（3）珍珠水解液低濃度組：先以瘦素激活細(xì)胞，再滴加終濃度為30 mg/L的珍珠水解液進(jìn)行干預(yù)；（4）珍珠水解液中濃度組：先以瘦素激活細(xì)胞，再滴加終濃度為60 mg/L的珍珠水解液進(jìn)行干預(yù)；（5）珍珠水解液高濃度組：先以瘦素激活細(xì)胞，再滴加終濃度為120 mg/L的珍珠水解液進(jìn)行干預(yù)；（6）秋水仙堿干預(yù)對(duì)照組：先以瘦素激活細(xì)胞，再滴加終濃度6.25 μg/ml的秋水仙堿進(jìn)行干預(yù)；（7）丹參酚酸B干預(yù)對(duì)照組：先以瘦素激活細(xì)胞，再滴加終濃度為1×10-6 mmol/L的丹參酚酸B進(jìn)行干預(yù)。

每項(xiàng)檢測(cè)重復(fù)3次。

MTT比色法檢測(cè)HSC-LX2、HSEC的增殖抑制率 用0.25%胰蛋白酶液消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-LX2、HSEC，以DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，分別制備成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。向96孔培養(yǎng)板的每孔內(nèi)滴加細(xì)胞懸液200 μl，置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細(xì)胞貼壁狀況良好后，將96孔培養(yǎng)板以孔為單位分成7組，每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。棄舊培養(yǎng)液后，分別按兩種細(xì)胞的7個(gè)組的相應(yīng)給藥要求，在每組細(xì)胞的每個(gè)孔內(nèi)滴加對(duì)應(yīng)的工作液200 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔滴加200 μl的MTT試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h；棄舊培養(yǎng)液后，每孔滴加二甲基亞砜 200 μl，超聲振蕩器搖勻2 min。酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞的吸光值。參數(shù)調(diào)節(jié)：波長(zhǎng)570 nm，參比波長(zhǎng)450 nm。細(xì)胞增殖抑制率=（1-藥物吸光值/對(duì)照吸光值）×100%

流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V-FITC/PI雙染色法）檢測(cè)HSC-LX2凋亡 用0.25%胰蛋白酶液消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-LX2，以DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，制備成5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。向6孔培養(yǎng)板的每孔內(nèi)滴加細(xì)胞懸液1.5 ml，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，細(xì)胞貼壁狀況良好后，將6孔培養(yǎng)板以孔為單位分成7組。棄舊培養(yǎng)液后，分別按兩種細(xì)胞的7個(gè)組的相應(yīng)給藥要求，在每組細(xì)胞的每個(gè)孔內(nèi)滴加相應(yīng)的工作液2 ml；培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶將細(xì)胞消化并收集于離心管中，1000 r/min（r=7.7 cm）離心5 min；以500 μl的1倍濃度結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/ml。取細(xì)胞懸液100 μl滴入離心管。滴加5 μl的異硫氰酸熒光素入離心管，室溫孵育5 min。滴加5 μl的碘化丙啶入離心管，室溫孵育15 min。滴加500 μl的1倍濃度結(jié)合緩沖液，混勻。離心管置入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。參數(shù)調(diào)節(jié)：氬離子氣體激光器波長(zhǎng)488 nm，阻斷濾片用530 nm長(zhǎng)波通濾片。

透射電鏡觀察HSEC細(xì)胞的窗孔及基底膜等微結(jié)構(gòu) 以DMEM培養(yǎng)液將HSEC制備為細(xì)胞濃懸液（1.5×106個(gè)/ml），以1%四氧化鋨進(jìn)行細(xì)胞固定（20 min，4 ℃），用不同濃度丙酮溶液按50%濃度1次、70%濃度1次、90%濃度2次、100%濃度3次的順序?qū)⒓?xì)胞脫色（每次10 min）。細(xì)胞標(biāo)本浸泡并封裝、過(guò)夜，制成細(xì)胞薄膜。先后用蘇木精-伊紅染色、電子染色和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡上機(jī)觀察并拍照。從每組細(xì)胞中隨機(jī)選擇3張透射電鏡照片，在每張照片的細(xì)胞中隨機(jī)選擇10個(gè)有意義的觀察視野，得到黑白圖像。為了能最大排除每張照片的拍攝光線明暗度不同對(duì)觀察者造成的干擾，能更直觀確定每張照片中HSEC內(nèi)窗孔區(qū)（透亮區(qū)域）和深色區(qū)域（篩板區(qū)、細(xì)胞內(nèi)容物區(qū)）的所占比例，以aoi圖像軟件系統(tǒng)對(duì)每張黑白圖像進(jìn)行灰度值分析。軟件有0～255級(jí)灰度等級(jí)（0級(jí)為最暗的黑色：HSEC中不通透的篩板區(qū)域?yàn)楹谏?55級(jí)為最亮的白色：HSEC中交換旺盛的窗孔區(qū)域?yàn)榘咨?。將各組細(xì)胞所得灰度值進(jìn)行比較，可直觀判斷每組細(xì)胞的窗孔數(shù)量和窗孔面積（淺色區(qū)域）及不利于通透物質(zhì)的篩板區(qū)（深色區(qū)域）的大小。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組別樣本均數(shù)比較采用方差分析（F檢驗(yàn)），如果涉及多重比較，采用方差分析中的Newman-Keuls檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

細(xì)胞增殖抑制率

HSC-LX2增殖抑制情況：與空白對(duì)照組（增殖抑制率0.08%）相比，瘦素激活對(duì)照組（增殖抑制率0.01%）的增殖活力顯著增強(qiáng)（P=0.041）。與瘦素激活對(duì)照組相比，珍珠水解液低濃度組（增殖抑制率13.50%，P=0.018）、珍珠水解液中濃度組（增殖抑制率18.40%，P=0.013）、珍珠水解液高濃度組（增殖抑制率23.60%，P=0.009）、秋水仙堿干預(yù)對(duì)照組（增殖抑制率40.60%，P=0.006）、丹參酚酸B干預(yù)對(duì)照組（增殖抑制率39.20%，P=0.008）的增殖活力均發(fā)生顯著抑制。同時(shí)，HSC-LX2的增殖活性隨著珍珠水解液的藥物濃度升高而降低（珍珠水解液低濃度組比珍珠水解液中濃度組：P=0.025；珍珠水解液中濃度組比珍珠水解液高濃度組：P=0.030）。

HSEC增殖抑制情況：與空白對(duì)照組（增殖抑制率0.05%）相比，瘦素激活對(duì)照組（增殖抑制率24.20%）的增殖活力顯著減弱（P=0.004）。與瘦素激活對(duì)照組的高增殖抑制率相比，珍珠水解液各濃度組對(duì)HSEC的增殖活力均有明顯恢復(fù)作用（低濃度組增殖抑制率19.30%，P=0.038；中濃度組增殖抑制率15.50%，P=0.027；高濃度組增殖抑制率12.60%，P=0.021）。同時(shí)，HSEC的增殖抑制率隨著藥物濃度升高而降低（珍珠水解液低濃度組比珍珠水解液中濃度組：P=0.021，珍珠水解液中濃度組比珍珠水解液高濃度組：P=0.028）。高濃度珍珠水解液的HSEC細(xì)胞增殖抑制率顯著強(qiáng)于秋水仙堿干預(yù)對(duì)照組（增殖抑制率20.50%，P=0.022）和丹參酚酸B干預(yù)對(duì)照組（增殖抑制率19.10%，P=0.028）。

細(xì)胞凋亡 二維散點(diǎn)圖檢測(cè)結(jié)果顯示，與瘦素激活對(duì)照組的總體凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）相比，各濃度珍珠水解液組的HSC-LX2的總體凋亡率均有明顯升高（低濃度組：P=0.012；中濃度組：P=0.006；高濃度組：P=0.005）。且隨著珍珠水解液藥物濃度的升高，細(xì)胞的總體凋亡率均顯著上升（珍珠水解液低濃度組比珍珠水解液中濃度組：P=0.031，珍珠水解液中濃度組比珍珠水解液高濃度組：P=0.044）。并且高濃度珍珠水解液的誘導(dǎo)HSC-LX2發(fā)生凋亡的能力比秋水仙堿（P=0.029）和丹參酚酸B（P=0.036）更強(qiáng)（表1、圖1）。

細(xì)胞窗孔及基底膜的變化情況 透射電鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組的HSEC內(nèi)密布淺色通透的窗孔區(qū)域，窗孔數(shù)量多、面積大，細(xì)胞膜為單層的薄層狀，細(xì)胞外無(wú)基底膜結(jié)構(gòu)存在（圖2A）。瘦素激活對(duì)照組的HSEC細(xì)胞與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)成片的深色無(wú)通透區(qū)域，窗孔區(qū)閉合、消失，細(xì)胞膜增厚，呈現(xiàn)2、3層的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，細(xì)胞外缺乏基底膜的區(qū)域，有膜狀物形成，著色深，并連接成片（圖2B）。珍珠水解液低濃度組與瘦素激活對(duì)照組相比，HSEC內(nèi)出現(xiàn)一定的淺色通透區(qū)域，窗孔數(shù)量、面積有所恢復(fù)，而較多的細(xì)胞中仍可觀察到明顯的兩層細(xì)胞膜，細(xì)胞外缺乏基底膜的區(qū)域，有膜狀物沉積，著色變淺（圖2C）。珍珠水解液中濃度組與瘦素激活對(duì)照組相比，HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域出現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)大，窗孔數(shù)量和面積明顯增高，部分細(xì)胞仍可看到兩層細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基底膜區(qū)域的膜狀物著色進(jìn)一步變淺，不明顯，膜狀物連接成片情況消失（圖2D）。珍珠水解液高濃度組與瘦素激活對(duì)照組相比，HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域面積顯著擴(kuò)大，窗孔空洞密集、直徑大，細(xì)胞膜恢復(fù)為薄層結(jié)構(gòu)（單層），細(xì)胞外區(qū)域、基底膜結(jié)構(gòu)基本消失（圖2E）。秋水仙堿干預(yù)對(duì)照組、丹參酚酸B干預(yù)對(duì)照組與瘦素激活對(duì)照組相比，可見(jiàn)HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域均出現(xiàn)顯著擴(kuò)大，窗孔數(shù)量和面積均有明顯的恢復(fù)，部分細(xì)胞仍可觀察到兩層細(xì)胞膜，部分細(xì)胞外的基底膜區(qū)域仍可見(jiàn)淺色的膜狀物，膜狀物連接成片情況基本消失。與珍珠水解液高濃度組相比，秋水仙堿干預(yù)對(duì)照組、丹參酚酸B干預(yù)對(duì)照組的HSEC內(nèi)的淺色通透區(qū)域數(shù)量較少，面積較?。ㄐ⌒痛翱?、中型窗孔為主），細(xì)胞膜較厚，分層情況更為明顯，細(xì)胞外的基底膜著色更深、分布范圍更廣（圖2）。將各組HSEC細(xì)胞圖像灰度值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示瘦素激活對(duì)照組（85.25±9.52）與空白對(duì)照組（142.46±17.27）相比，灰度值明顯降低，即瘦素激活對(duì)照組細(xì)胞的窗孔區(qū)域發(fā)生明顯縮小，篩板區(qū)明顯增大（P=0.008）；與瘦素激活對(duì)照組相比，珍珠水解液低濃度組（101.64±20.37，P=0.032）、珍珠水解液中濃度組（112.37±21.16，P=0.028）、珍珠水解液高濃度組（129.90±15.89，P=0.020）灰度值均顯著上升，即各組珍珠水解液均能使HSEC的窗孔區(qū)域重新開(kāi)放，使篩板區(qū)發(fā)生縮小。

討論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病共同具有的病理變化過(guò)程，不是一種獨(dú)立的疾病，這個(gè)過(guò)程中肝臟組織結(jié)構(gòu)、肝臟功能和肝臟微循環(huán)均發(fā)生顯著變化［9］。肝竇是血液與肝細(xì)胞之間發(fā)生物質(zhì)交換的關(guān)鍵屏障，在實(shí)現(xiàn)肝臟生化功能、維持肝臟正常血液循環(huán)中發(fā)揮重要作用。HSEC是肝竇最主要的細(xì)胞，其有兩個(gè)異于普通血管內(nèi)皮細(xì)胞的顯著結(jié)構(gòu)特征，一是細(xì)胞表面有大量呈篩狀排列的窗孔，窗孔面積占細(xì)胞面積達(dá)6%～8%；二是細(xì)胞膜外無(wú)阻擋物，缺乏一般內(nèi)皮細(xì)胞具有的基膜結(jié)構(gòu)［10］。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)特征使眾多物質(zhì)得以順暢高速地通過(guò)HSEC的竇周隙，在血液與肝細(xì)胞之間進(jìn)行高效交換［11］。而肝纖維化時(shí)可出現(xiàn)明顯的肝竇毛細(xì)血管化病變［12］，造成肝臟的血液流通、物質(zhì)交換不順暢，嚴(yán)重影響肝臟功能和微循環(huán)狀況，成為加速肝纖維化病變發(fā)展的重要一環(huán)；而基底膜形成后又可儲(chǔ)存、結(jié)合大量的致纖維化細(xì)胞因子，間接促進(jìn)肝纖維化的核心細(xì)胞—HSC-LX2的增殖活化過(guò)程，進(jìn)一步促進(jìn)肝臟纖維化的病程發(fā)展［13-15］。Majumder等［16］證實(shí)肝纖維化發(fā)生前大多都有肝竇毛細(xì)血管化改變，該改變可以顯著加速肝纖維化病程。另有研究指出HSEC的結(jié)構(gòu)改變是激發(fā)HSC-LX2活化的必須條件及關(guān)鍵因素，去除肝竇毛細(xì)血管化病因后，部分纖維化病變可自行減輕［15，17］。因此，如何干預(yù)肝竇毛細(xì)血管化進(jìn)程、恢復(fù)肝臟正常的微循環(huán)，對(duì)肝纖維化的防治具有重要意義。

珍珠歷代皆被譽(yù)為國(guó)寶，自秦漢時(shí)期即為皇家貢品，名揚(yáng)天下。珍珠在我國(guó)入藥已有2000年歷史，是中醫(yī)治療心經(jīng)、肝經(jīng)疾病的常用藥物。珍珠主要分為東珠、西珠、南珠，歷來(lái)有“西珠不如東珠、東珠不如南珠”［18］的說(shuō)法；南珠中，廣西合浦盛產(chǎn)的珍珠作為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品最負(fù)盛名，具有良好的活血散瘀、治療肝經(jīng)疾病的藥用價(jià)值［19］。其性寒，味甘、咸，歸心、肝經(jīng)；主產(chǎn)于廣西、廣東、海南［20］；《名醫(yī)別錄》《本草經(jīng)集》《雷公藥性賦》等醫(yī)藥古籍都對(duì)珍珠的療效有明確的記載?！侗静菥V目》云：“珍珠，安神定魄、養(yǎng)顏、活血散瘀、點(diǎn)目去翳、塞耳去聾、去腐生肌、催生死胎”“入厥陰肝經(jīng)”?！侗静輩R言》：“珍珠鎮(zhèn)心，定志，安魂，解結(jié)毒，化惡瘡，收內(nèi)潰破爛”。以上認(rèn)識(shí)，對(duì)合浦珍珠干預(yù)肝竇毛細(xì)血管化進(jìn)程、治療肝纖維化疾病提供了強(qiáng)有力的中醫(yī)理論依據(jù)［21-24］。

有報(bào)道瘦素可以病理性刺激HSEC和HSC-LX2顯著促進(jìn)HSC-LX2的活化［25］，同時(shí)抑制HSEC細(xì)胞增殖，并誘發(fā)其發(fā)生凋亡［26］，對(duì)肝纖維化病理變化可起到很好的模擬效果。本研究以MTT法檢測(cè)HSEC細(xì)胞的增殖活力，結(jié)果顯示瘦素病理激活后，HSEC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制情況，可見(jiàn)肝纖維化病變可降低HSEC的細(xì)胞增殖活力，使肝臟的物質(zhì)交換和微循環(huán)狀況惡化，從而進(jìn)一步加快肝纖維化病程發(fā)展。而合浦珍珠水解液干預(yù)后HSEC細(xì)胞的增殖活力恢復(fù)，呈現(xiàn)顯著的HSEC保護(hù)作用。以MTT法檢測(cè)肝纖維化的核心細(xì)胞—HSC-LX2細(xì)胞的增殖活力，結(jié)果顯示合浦珍珠水解液對(duì)HSC-LX2具有明顯的增殖抑制作用，出現(xiàn)較強(qiáng)的細(xì)胞毒性；隨著給藥濃度升高，細(xì)胞增殖活性明顯下降，且珍珠的細(xì)胞毒性具有劑量依賴(lài)性。推測(cè)合浦珍珠水解液干預(yù)肝纖維化的藥理作用與其能夠抑制HSC-LX2增殖活力的能力有關(guān)。

細(xì)胞生物學(xué)理論指出，某種細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度積聚，是由于細(xì)胞增殖增加和/或凋亡減少。本研究肝纖維化時(shí)HSC-LX2的數(shù)量和活性異常上升的原因，除了由細(xì)胞活化增殖過(guò)度引起，細(xì)胞凋亡的不足也不可排除。研究表明誘導(dǎo)已經(jīng)病理激活的HSC-LX2發(fā)生凋亡，不失為一種阻止HSC-LX2激活的方法，可以干預(yù)肝纖維化病程發(fā)展［27］。Friedman ［28］認(rèn)為HSC-LX2發(fā)生病理活化后，很難再被逆轉(zhuǎn)回到靜息狀態(tài)，而從基因?qū)用嬲T導(dǎo)HSC-LX2發(fā)生凋亡，成為干預(yù)肝纖維化進(jìn)程的良好方法［29］。本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-LX2的凋亡狀況，結(jié)果顯示珍珠水解液可使HSC-LX2的早、晚期凋亡百分比明顯升高，而將給藥濃度上調(diào)后，HSC-LX2的凋亡率也隨之上升，表明珍珠水解液誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力具有顯著的劑量依賴(lài)性。同時(shí)，研究顯示高濃度的珍珠水解液誘導(dǎo)HSC-LX2發(fā)生凋亡的能力明顯高于秋水仙堿和丹參酚酸B。推測(cè)珍珠水解液的抗肝纖維化作用與其抗HSC-LX2活化增殖的能力有關(guān)，并且該能力通過(guò)誘導(dǎo)HSC-LX2發(fā)生凋亡達(dá)到。

本研究針對(duì)肝竇毛細(xì)血管化中的各項(xiàng)微結(jié)構(gòu)的改變［30］進(jìn)行深入研究，以透射電鏡觀察各組HSEC的情況，結(jié)果顯示被瘦素病理激活后，HSEC窗孔的數(shù)量發(fā)生明顯減少，窗孔的直徑明顯縮小，細(xì)胞外出現(xiàn)連接成片的基膜結(jié)構(gòu)。結(jié)合本研究觀察到的HSC-LX2活化現(xiàn)象，推測(cè)肝纖維化病變時(shí)有明顯的肝竇毛細(xì)血管化發(fā)生，使肝臟的物質(zhì)交換和微循環(huán)狀況惡化，加快肝纖維化病程發(fā)展。進(jìn)行合浦珍珠水解液干預(yù)后，HSEC關(guān)閉了的窗孔被重新開(kāi)放，窗孔的直徑出現(xiàn)顯著擴(kuò)大。細(xì)胞外連接成片的基膜結(jié)構(gòu)變得稀薄甚至消失。結(jié)合HSC-LX2活力下降及發(fā)生凋亡，可確證合浦珍珠水解液具有針對(duì)HSEC及HSC-LX2的顯著的抗肝竇毛細(xì)血管化藥理學(xué)作用，且隨著給藥濃度升高，HSEC細(xì)胞的窗孔面積恢復(fù)、基膜消失、抑制HSC-LX2細(xì)胞活力的作用明顯增強(qiáng)，表明珍珠水解液的抗肝竇毛細(xì)血管化作用具有劑量依賴(lài)性。

綜上，珍珠水解液的活血化瘀、干預(yù)肝纖維化作用與其顯著的抗肝竇毛細(xì)血管化、恢復(fù)HSEC增殖活力的藥理學(xué)作用密切相關(guān)。本研究對(duì)認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)廣西道地藥材合浦珍珠用于防治肝纖維化、血瘀型肝臟疾病具有重要的價(jià)值及意義。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］Shahrouz G，Rohan V，Tyler R，et al.Platelet TGF-β1 deficiency decreases liver fibrosis in a mouse model of liver injury[J].Blood Adv，2018，2（5）：470-480.DOI：10.1182/bloodadvances.2017010868.

［2］蔡欣池，崔萬(wàn)麗.肝纖維化發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2021，42（2）：141-143.DOI：10.13845/j.cnki.issn1673-2995.2021.02.026.

［3］Chen Y，F(xiàn)an Y，Guo DY，et al.Study on the relationship between hepatic fibrosis and epithelial-mesenchymal transition in intrahepatic cells[J].Biomed Pharmacother，2020，129：110413.DOI：10.1016/j.biopha.2020.110413.

［4］張冰冰，梁健，鄧鑫，等.中醫(yī)藥抗肝纖維化作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志，2021，37（8）：191-193.DOI：10.16808/j.cnki.issn1003-7705.2021.08.062.

［5］唐何娜，楊磊，萬(wàn)婷婷，等.珍珠加工工藝的研究進(jìn)展[J].山東化工，2016，45（3）：43-46.DOI：10.19319/j.cnki.issn.1008-021x.2016.03.021.

［6］林江，蘭太進(jìn)，林湧，等.合浦珍珠“解毒生肌”藥效機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究[Z/OL].（2019-07-08）[2022-02-13].https.//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？dbname=SNAD&filename=SNAD000001898352.

［7］Peng Y，F(xiàn)eng Q，Lin J，et al.Effects of guangxi hepu pearl hydrolysate on proliferation activity and apoptosis of human hepatic stellate cells[J].Plant Diseases Pests，2021，12（3）：29-33.DOI：10.19579/j.cnki.plant-d.p.2021.03.007.

［8］林江，林涌，林海.溶解珍珠的方法及用該方法獲取的珍珠蜂蜜液：CN1121418[P].1996-05-01.

［9］郭悅承，陸倫根.肝纖維化臨床診斷與治療研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志，2022，25（3）：305-308.DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2022.

［10］卿哲，曾仲.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控肝竇微環(huán)境促進(jìn)肝再生的作用及其研究進(jìn)展[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2022，29（7）：958-964.DOI：10.7507/1007-9424.202110002

［11］Xiaobo C，Zhenghong L，Qidi Z，et al.CXCL6-EGFR-induced Kupffer cells secrete TGF-β1 promoting hepatic stellate cell activation via the SMAD2/BRD4/C-MYC/EZH2 pathway in liver fibrosis[J].Cell Mol Med，2018，22（10）：5050-5061.DOI：10.1111/jcmm.13787.

［12］Erica N，Stefania C，Elisabetta M，et al.Hepatic myofibroblasts and fibrogenic progression of chronic liver diseases[J].Histol Histopathol，2015，30（9）：1011-1032.DOI：10.14670/HH-11-623.

［13］Cheng B，Zhu Q，Lin W，et al.MicroRNA-122 inhibits epithelial-mesenchymal transition of hepatic stellate cells induced by the TGF-β1/Smad signaling pathway[J].Exp Ther Med，2019，17（1）：284-290.DOI：10.3892/etm.2018.6962.

［14］Yao Q，Lin Y，Li X，et al.Curcumin ameliorates intrahepatic angiogenesis and capillarization of the sinusoids in carbon tetrachloride-induced rat liver fibrosis[J].Toxicol Lett，2013，222（1）：72-82.DOI：10.1016/j.toxlet.2013.06.240.

［15］Hiroyuki O，Kosuke K，Norihisa N，et al.Lenvatinib prevents liver fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation and sinusoidal capillarization in experimental liver fibrosis[J].J Cell Mol Med，2021，25（8）：4001-4013.DOI：10.1111/jcmm.16363.

［16］Majumder S，Piguet AC，Dufour JF，et al.Study of the cellular mechanism of sunitinib mediated inactivation of activated hepatic stellate cells and its implications in angiogenesis[J].Eur J Pharmacol，2013，705（1-3）：86-95.DOI：10.1016/j.ejphar.2013.02.026.

［17］de Oliveira da Silva B，Ramos LF，Moraes KCM.Molecular interplays in hepatic stellate cells：apoptosis，senescence，and phenotype reversion as cellular connections that modulate liver fibrosis[J].Cell Biol Int，2017，41（9）：946-959.DOI：10.1002/cbin.10790.

［18］張婷，林江.合浦珍珠生產(chǎn)保護(hù)性發(fā)展探討[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2014，23（2）：30-31.

［19］Liu HL，Lv J，Zhao ZM，et al.Fuzhenghuayu decoction ameliorates hepatic fibrosis by attenuating experimental sinusoidal capillarization and liver angiogenesis[J].Sci Rep，2019，9（1）：18719.DOI：10.1038/s41598-019-54663-4.

［20］黃青萍，盤(pán)紅梅.珍珠的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000（6）：564-565.DOI：10.3969/j.issn.1008-0805.2000.06.093.

［21］張碩旭.基于醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展的中醫(yī)藥抗肝纖維化的進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2022，53（5）：760.

［22］黃麗玲，吳春城，唐金模，等.肝纖維化中醫(yī)辨證論治研究現(xiàn)狀[J].醫(yī)學(xué)信息，2022，35（7）：19-21.DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2022.07.005.

［23］徐列明.肝纖維化或肝硬化“正虛血瘀”中醫(yī)病機(jī)的臨床觀察和研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（9）：1465-1470.DOI：10.11842/wst.2016.09.006.

［24］劉梅，張斌.從瘀論治肝纖維化[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2018，26（3）：310-314.DOI：10.3969/j.issn.1671-038X.2018.03.21.

［25］潘傳芳，劉成海.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)消化系統(tǒng)疾病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，2004.

［26］張燕軍，張靜，羅慶鋒.科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展—中國(guó)科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

［27］羅雨欣，郭金波，尹鳳榮，等.體外高表達(dá)腫瘤壞死樣因子配體1A的巨噬細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞活化與增殖的影響[J].中華肝臟病雜志，2018，26（5）：347-352.DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2018.05.007.

［28］Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury[J].J Biol Chem，2000，275（4）：2247-2250.DOI：10.1074/jbc.275.4.2247.

［29］閆慧芳.數(shù)據(jù)挖掘探究肝-腎-肺纖維化的關(guān)鍵基因[J/OL].生物信息學(xué)，2022，20（4）：235-246.[2022-11-18].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/23.1513.Q.20220331.1023.002.html.

［30］劉聰，萬(wàn)思哲，朱萱.肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2020，51（3）：183-186.DOI：10.3969/j.issn.0559-7765.2020.03.006.

（收稿日期：2022-07-13）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81960761、82060825、81960751）、廣西自然科學(xué)基金（2020GXNSFAA297119）、中醫(yī)學(xué)廣西一流學(xué)科（桂教科研〔2022〕1號(hào)）、廣西名中醫(yī)林江傳承工作室（桂中醫(yī)藥科教發(fā)〔2021〕6號(hào)）、廣西一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（2018XK020）、廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSZ2022002）和依托廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目；第一、二位作者對(duì)本文貢獻(xiàn)一致