外源菌劑對(duì)稻稈腐解及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

邵社剛， 李婷， 柳勇， 林蘭穩(wěn)， 張東， 倪棟， 李俊杰， 朱立安*

（1.交通運(yùn)輸部公路科學(xué)研究院，公路交通環(huán)境保護(hù)技術(shù)交通運(yùn)輸行業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088；2.廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，華南土壤污染控制與修復(fù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650）

中國(guó)是世界秸稈生產(chǎn)大國(guó)，2014—2018 年僅谷類秸稈年均產(chǎn)量為6.5×108t，其中稻谷秸稈年均產(chǎn)量2.1×108t，占谷類秸稈年均產(chǎn)量的32.3%[1]。作物秸稈具有較高的氮、磷、鉀等養(yǎng)分，其肥料化利用具有直接替代化肥的潛力，其產(chǎn)量可分別直接替代中國(guó)2019 年農(nóng)用氮、磷、鉀肥施用量的22.5%、20.2%、142%[2]。作物秸稈還田可降低土壤容重、穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)[3]，增加土壤有機(jī)碳含量，促進(jìn)土壤無(wú)機(jī)氮的生物固定[4]，提高土壤總磷脂脂肪酸及細(xì)菌、放線菌生物量[5]，從而改善土壤物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)，促進(jìn)作物生長(zhǎng)并提高產(chǎn)量[3]。但我國(guó)作物秸稈還田比例低于發(fā)達(dá)國(guó)家，還田成本高且缺乏高效還田技術(shù)[6]，極大地限制了秸稈還田在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

作物秸稈主要由32%～47%纖維素、19%～27%半纖維素和5%～24%木質(zhì)素組成[7]。與直接還田、燃燒還田、過(guò)腹還田等方式相比，秸稈腐熟還田不僅可有效緩解其他還田方式帶來(lái)的養(yǎng)分供應(yīng)不及時(shí)、資源浪費(fèi)、環(huán)境污染等問(wèn)題[8]，還可加快還田秸稈腐熟下沉，利于下茬農(nóng)作物的播種和定植，實(shí)現(xiàn)秸稈的高效利用。秸稈腐解主要靠微生物的分解作用，是秸稈本身有機(jī)碳礦化、養(yǎng)分釋放與土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分再平衡的過(guò)程[9]。促腐菌劑一般為微生物菌劑，可加速秸稈等有機(jī)廢棄物的腐解[10]，而其對(duì)秸稈腐解的促進(jìn)作用受本身特性[11]和腐解原料[12]的影響，可改變堆體理化性質(zhì)[13]和微生物群落結(jié)構(gòu)[14-15]，而理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)相互關(guān)聯(lián)，也影響堆體腐解?；诖?，為進(jìn)一步闡明外源微生物對(duì)秸稈腐解所產(chǎn)生的影響，本研究將0.5%促腐菌劑接種到水稻秸稈堆肥中，通過(guò)測(cè)定理化性質(zhì)指標(biāo)并利用高通量測(cè)序技術(shù)，分析促腐菌劑對(duì)水稻秸稈腐解過(guò)程中理化參數(shù)和微生物群落結(jié)構(gòu)演替的影響，以明確水稻秸稈堆肥過(guò)程對(duì)促腐菌劑的響應(yīng)，為提高水稻秸稈還田利用率提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻秸稈來(lái)自廣東省中山市沙溪鎮(zhèn)聚龍圍農(nóng)場(chǎng)，水洗烘干后粉碎過(guò)5 mm 篩，其基本理化性質(zhì)為：含水率7.5%，總有機(jī)碳40.8%，全氮0.8%，全磷0.1%，碳氮比(C/N) 54.1。供試促腐菌劑由佛山金葵子植物營(yíng)養(yǎng)有限公司提供，主要成分是多粘類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短短芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，均屬于厚壁菌門，有效活菌數(shù)量≥0.5×108cfu·g-1。供試氮肥、磷肥分別為尿素、過(guò)磷酸鈣，均為分析純?cè)噭８庠囼?yàn)所用容器為380 mm×280 mm×160 mm泡沫箱。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

腐解試驗(yàn)于2019 年5—6 月在廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以1 000 g（干質(zhì)量）水稻秸稈為腐解原料，加入尿素、過(guò)磷酸鈣、去離子水，調(diào)節(jié)初始C/N、碳磷比（C/P）、含水量，使其分別為25、120、70%。試驗(yàn)設(shè)置2 個(gè)處理：添加0.5%促腐菌劑處理（JF）和未添加促腐菌劑對(duì)照（CK），每處理重復(fù)3 次。水稻秸稈腐解最佳初始C/N、C/P、含水量和最佳促腐菌劑施用量由課題組前期研究所得[8]。將上述材料在泡沫箱內(nèi)混合均勻并放置在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行腐解，箱蓋上均勻設(shè)有數(shù)個(gè)10 mm×10 mm 的通氣小孔，保持室內(nèi)空氣流通。腐解過(guò)程中分別在培養(yǎng)的第0、3、8、14、28 天進(jìn)行取樣，采用多點(diǎn)取樣法分次取樣并混合均勻，將樣品均分為2 份，分別用于理化性質(zhì)和生物信息學(xué)分析。

1.3 理化性狀測(cè)定

采用溫度計(jì)于每日9∶00和16∶00測(cè)定堆體溫度和環(huán)境溫度，分別求取平均值作為當(dāng)天的堆體溫度和環(huán)境溫度。腐解率采用稱重法測(cè)定，參照姚云柯等[16]方法計(jì)算。pH 采用去離子水浸提（土液質(zhì)量體積比為1∶10），用Sartorius PB-10 型酸度計(jì)和Sartorius pH/ATC 復(fù)合電極測(cè)定[17]?？傆袡C(jī)碳（total organic carbon，TOC）采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化法測(cè)定[17]。全氮、全磷均通過(guò)H2SO4-H2O2消煮，分別用擴(kuò)散法、鉬銻抗比色法測(cè)定[18]。水溶性有機(jī)碳采用去離子水（質(zhì)量體積比為1∶10）浸提,用Shimadzu TOC-V CPH 型總有機(jī)碳分析儀測(cè)定，其紫外-可見光譜參數(shù)采用北京普析TU-1950 型紫外-可見光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定[8]。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮采用2 mol·L-1氯化鉀（質(zhì)量體積比為1∶10）浸提，SKALAR San++型連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定[19]。有效磷采用0.5 mol·L-1碳酸氫鈉（pH 8.5，質(zhì)量體積比為1∶20）浸提，鉬銻抗比色法測(cè)定[17]。

1.4 生物信息學(xué)分析

樣品生物信息分析工作由上海派諾森生物科技股份有限公司完成。細(xì)菌16S rRNA 基因（v3～v4 區(qū)）使用通用引物序列為338F （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），真菌18S rRNA 基因使用通用引物序列為ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。樣品采用MP Biomedicals FastDNAR Spin試劑盒提取總DNA，使用Illumina MiSeq 平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端（paired-end）測(cè)序，通過(guò)Vsearch方法進(jìn)行序列操作分類單元 （operational taxonomic units, OTUs）聚類，然后對(duì)每個(gè)去重序列（amplicon sequence variants, ASVs）的特征序列或每個(gè)OTU 的代表序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。依據(jù)物種分類學(xué)注釋產(chǎn)生的ASV/OTU 豐度，利用QIIME2 （2019.4）、R 語(yǔ)言ggplot2 軟件包等，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中的微生物群落在各分類水平的具體組成表，計(jì)算并選取各樣品在門、屬分類水平上相對(duì)豐度排名前10 的物種生成堆積柱狀圖，以直觀查看、比較各樣品在不同分類水平上相對(duì)豐度較高的物種及優(yōu)勢(shì)微生物群落。利用QIIME2（2019.4）進(jìn)行Alpha 多樣性分析，計(jì)算各樣品微生物群落的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、覆蓋率指數(shù)，比較、檢驗(yàn)各樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度，其中Chao1 指數(shù)（C）、Shannon 指數(shù)（S）、覆蓋率指數(shù)（G）的計(jì)算公式如下。

式中，Sobs是實(shí)際測(cè)得的OTUs 數(shù)量，F(xiàn)1和F2分別為只含1 條序列和2 條序列的OTU 數(shù)量，s是實(shí)際測(cè)得的OTU 數(shù)量，pi是OTUi所代表物種的比例，N是個(gè)體總數(shù)（所有OTU的豐度總和）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，運(yùn)用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布和方差齊次，則對(duì)同一處理不同腐解時(shí)間的差異進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，使用Tukey檢驗(yàn)，反之則使用韋爾奇方差（Welch’s ANOVA）分析，使用Games-Howell 檢驗(yàn)；對(duì)同一腐解時(shí)間不同處理的差異進(jìn)行2 個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（t-test），P＜0.05 表示差異顯著。使用Canoco 5.0對(duì)理化性質(zhì)和細(xì)菌、真菌在前15 個(gè)屬分類水平上通過(guò)去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（detrending correspondence analysis, DCA）判別排序模型，梯度長(zhǎng)度（lengths of gradient）大于4，選用典型對(duì)應(yīng)模型（canonical correspondence analysis,CCA）進(jìn)行排序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源促腐菌劑對(duì)稻稈腐解過(guò)程中理化性質(zhì)的影響

2.1.1 溫度變化 稻稈腐解過(guò)程中，堆體溫度在CK、JF 處理下均表現(xiàn)為先升高后降低，并逐漸與環(huán)境溫度持平（圖1）。2個(gè)處理均在腐解第4天達(dá)到最高溫度，第15 天降至環(huán)境溫度水平，均不存在持續(xù)升溫過(guò)程，在腐解的第0～4天為升溫期，第5～14天為冷卻期，第15～28天為成熟期。其中，JF處理的堆體溫度在取樣的第3、8 和28 天大于CK處理。

2.1.2 理化性質(zhì)變化 稻稈腐解過(guò)程中，各處理下堆體腐解率和pH 動(dòng)態(tài)變化見圖2。堆體腐解率在2 個(gè)處理下均隨腐解時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，在第0～8 天堆體腐解率表現(xiàn)為CK＞JF，第14～28 天表現(xiàn)為JF＞CK，第28 天CK、JF 堆體腐解率分別為61.1%、61.9%。2個(gè)處理下堆體pH 在腐解過(guò)程中均整體呈上升趨勢(shì)，第0～8 天CK、JF 處理間pH 差異顯著（P＜0.05）；CK 處理的pH 由第0 天的6.01 顯著（P＜0.05）增加至第28 天的8.13，增幅為35.2%；JF 處理的pH 在第3 天達(dá)到最大值，為8.29，隨后下降再上升，第28 天為8.16，較第0 天的5.92顯著（P＜0.05）增加37.8%。

稻稈腐解過(guò)程中堆體理化性質(zhì)和碳氮比、氮磷比隨腐解時(shí)間的變化見表1、表2。腐解第8天，JF處理下有機(jī)碳含量較第0天顯著（P＜0.05）下降6.6%，但CK 處理下無(wú)顯著差異。腐解第28 天，CK、JF 處理下堆體有機(jī)碳含量較第0 天分別顯著（P＜0.05）下降13.4%、17.6%，表明添加促腐菌劑可在一定程度上促進(jìn)堆體有機(jī)碳的降解。腐解第28 天，CK、JF 處理下堆體全氮含量較第0 天分別顯著（P＜0.05）增加55.4%、48.1%，但CK、JF 處理間無(wú)顯著差異，表明添加促腐菌劑不能增加腐解產(chǎn)物全氮含量。腐解第28 天，JF 處理下堆體全磷含量較CK 顯著（P＜0.05）增加8.4%，且CK、JF 處理下堆體全磷含量較第0 天分別顯著（P＜0.05）增加79.3%、87.5%。此外，腐解第3 和第14～28 天，堆體全磷含量表現(xiàn)為JF＞CK，且差異顯著（P＜0.05），表明添加促腐菌劑可以增加稻稈腐解產(chǎn)物全磷含量。腐解第28 天，CK、JF 處理下堆體C/N 較第0 天分別顯著（P＜0.05）下降44.4%、44.3%，堆體C/P 分別顯著（P＜0.05）下降51.7%和56.0%，且JF 處理下堆體C/P較CK 處理顯著（P＜0.05）降低9.1%，表明添加促腐菌劑可以降低腐解產(chǎn)物C/P。

表2 腐解過(guò)程中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和特征紫外吸光度的變化Table 2 Changes of -N， -N， Olsen-P and SUVA254 during the decomposing process

表2 腐解過(guò)程中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和特征紫外吸光度的變化Table 2 Changes of -N， -N， Olsen-P and SUVA254 during the decomposing process

注：同列不同英文字母表示相同處理不同腐解時(shí)間間差異在P＜0.05水平顯著， 同列不同希臘字母表示相同腐解時(shí)間不同處理間差異在P＜0.05水平顯著。Note：Different English letters in same column indicate significant differences at P＜0.05 level among different decomposing times under same treatment，different Greek letters indicate significant differences at P＜0.05 level among different treatments under same decomposing time.

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腐解第8 天，CK、JF 處理下堆體硝態(tài)氮含量均顯著（P＜0.05）增加；第28 天，2 個(gè)處理下堆體硝態(tài)氮含量差異顯著（P＜0.05），較第0 天分別顯著（P＜0.05）增加60.1%、38.8%。CK、JF 處理下堆體銨態(tài)氮含量在腐解第3 天顯著（P＜0.05）增加，第8～28 天又顯著（P＜0.05）下降，且第8～28 天堆體銨態(tài)氮含量均表現(xiàn)為JF＞CK，且差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明添加促腐菌劑可以增加腐解產(chǎn)物銨態(tài)氮含量。腐解第28 天，CK、JF 處理下堆體有效磷含量較第0 天分別顯著（P＜0.05）降低82.9%、82.3%，兩處理間差異不顯著。腐解過(guò)程中,特征紫外吸光度（SUVA254）值呈先降后升趨勢(shì),第 0～3 天JF 處理的SUVA254值顯著（P＜0.05）高于CK 處理，表明JF 處理能增加堆體升溫期SUVA254值。

2.2 外源促腐菌劑對(duì)稻稈腐解過(guò)程中微生物群落的影響

2.2.1 外源促腐菌劑對(duì)微生物群落豐度和多樣性的影響 稻稈腐解過(guò)程中細(xì)菌、真菌群落Alpha指數(shù)變化見表3，細(xì)菌、真菌樣品覆蓋率變化范圍分別為99.1%～99.7%、99.9%～100%，表明微生物群落檢測(cè)較為完全。Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)可分別指示群落的豐度和多樣性。CK處理下細(xì)菌、真菌Chao1 指數(shù)最大值出現(xiàn)在腐解第8 天，JF 處理下細(xì)菌、真菌Chao1 指數(shù)最大值出現(xiàn)在腐解第3 天，2 個(gè)處理細(xì)菌和真菌Shannon 指數(shù)最大值均出現(xiàn)在腐解第3 天，隨后呈下降趨勢(shì)，在腐解第28 天，細(xì)菌、真菌Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均有所增加，表明細(xì)菌、真菌群落不同腐解時(shí)期表現(xiàn)出不同的豐度和多樣性。

表3 腐解過(guò)程中細(xì)菌、真菌群落豐富度與多樣性的變化Table 3 Changes of bacterial and fungal community diversity and richness indices during the decomposing process

2.2.2 外源促腐菌劑對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響分別選取在細(xì)菌、真菌門（Phylum）和屬（Genus）分類水平上平均豐度排名前10 的物種生成堆積柱狀圖，分析各處理之間細(xì)菌、真菌群落優(yōu)勢(shì)物種的差異。在門分類水平上，相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌群落分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）（圖3A），其相對(duì)豐度之和占細(xì)菌16S rRNA 基因序列總數(shù)的91.4%～99.8%。其中，Proteobacteria 是整體上最占優(yōu)勢(shì)的門，CK、JF處理的Proteobacteria 豐度在第0～8 天呈上升趨勢(shì)，第8天達(dá)到峰值，豐度分別為71.1%、76.4%，JF處理的Proteobacteria 豐度在第0～8 天較CK 高1.1%～5.2%，表明JF 可促進(jìn)堆體第0～8 天Proteobacteria 繁殖。Firmicutes 豐度在升溫期后迅速降低，JF 對(duì)Firmicutes 的生長(zhǎng)繁殖無(wú)促進(jìn)作用。Bacteroidetes 和Actinobacteria 豐度在腐解過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)，第3 天豐度最小，冷卻期和成熟期豐度較高，JF 處理的Bacteroidetes 豐度在第28 天較CK 高1.4%，Actinobacteria 豐度在第8～28 天較CK 高9.9%～15.6%，表明JF 可促進(jìn)堆體成熟期Bacteroidetes和Actinobacteria的生長(zhǎng)繁殖。

圖3 細(xì)菌、真菌群落在門和屬分類水平的分布特征變化Fig. 3 Analysis of distribution characteristics of bacterial and fungal communities at phylum and genus level

在屬分類水平上，相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的前6 個(gè)細(xì) 菌 群 落 分 別 為 假 黃 單 胞 菌 屬（Pseudoxanthomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、克羅諾桿菌屬（Cronobacter）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（ 圖3B），Bacillus和Paenibacillus屬 Firmicutes 門 ，其 余 屬 于Proteobacteria 門 。 CK、 JF 處 理 下Pseudoxanthomonas豐度在第8 天劇烈增加，達(dá)到峰值，分別為40.6%、34.2%，隨后豐度下降；Escherichia-Shigella豐度峰值出現(xiàn)在第0 天，豐度分別為14.1%、18.6%，第3 天豐度分別為14.0%、14.2%，JF 處理下其豐度在升溫期較CK 高0.3%～4.5%。Cronobacter豐度主要在0～3 d 占優(yōu)勢(shì)，隨后豐度急劇下降，JF 處理的Cronobacter豐度在升溫期較CK高1.3%～3.1%。Cellvibrio豐度在冷卻期和成熟期呈上升趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在第28天，CK、JF處理下豐度分別為15.7%、15.2%，JF對(duì)Cellvibrio的生長(zhǎng)繁殖無(wú)促進(jìn)作用。Bacillus和Paenibacillus豐度分別在第0和3天達(dá)到峰值，隨后豐度呈下降趨勢(shì)，JF 對(duì)堆體Bacillus和Paenibacillus的生長(zhǎng)繁殖無(wú)促進(jìn)作用。

門分類水平上相對(duì)豐富度占優(yōu)勢(shì)的真菌群落為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和未確認(rèn)真菌門（Unclassified Fungi），（圖3C）。CK、JF 處理的Basidiomycota 豐度在第0天分別為25.4%、27.9%,第14天分別劇烈增加至99.5%、96.5%，隨后豐度降低，JF 處理下堆體升溫期Basidiomycota 豐度較CK 高0.6%～2.5%，但隨著腐解的進(jìn)行，JF 對(duì)其生長(zhǎng)繁殖無(wú)促進(jìn)作用。CK、JF處理的Ascomycota在第8天豐度分別為30.7%、86.6%，第14 天分別降至0.5%、3.4%，JF 處理下冷卻期Ascomycota 豐度較CK 高2.9%～56.1%。Unclassified Fungi 豐度在第28 天劇烈增加，CK、JF 處理下豐度分別為52.6%、97.3%，JF 處理下成熟期Unclassified Fungi 豐度較CK 高0.1%～44.7%,表明JF 可促進(jìn)成熟期Unclassified Fungi 的生長(zhǎng)繁殖。

在屬分類水平上，相對(duì)豐富度占優(yōu)勢(shì)的前5個(gè)真菌群落分別為擬鬼傘屬（Coprinopsis）、曲霉屬（Aspergillus）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、黑果菌屬（Melanocarpus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（圖3D）。其中，Coprinopsis、Wallemia屬于Basidiomycota門，Aspergillus、Melanocarpus、Thermomyces屬于Ascomycota 門。Coprinopsis豐度在第14 天劇烈增加，CK、JF 處理下豐度分別為99.4%、96.4%，隨后豐度降低；Aspergillus豐度在腐解過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，JF處理對(duì)Coprinopsis、Aspergillus豐度無(wú)促進(jìn)作用。Wallemia豐度隨著腐解進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，第0 天為最大值，CK、JF 處理下豐度分別為20.4%、24.9%，第3 天分別降至9.6%、13.5%，JF 處理下堆體升溫期Wallemia豐度較CK 高3.9%～4.5%。CK、JF 處理下，堆體Melanocarpus、Thermomyces豐度在第8 天劇烈增加，分別為1.5%、40.7% 和0.3%、39.4%，與CK 處理相比，JF 處理下堆體第8 天Melanocarpus、Thermomyces豐度較CK 高39.2%、39.1%。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

通過(guò)典型對(duì)應(yīng)分析，分析了pH、全氮、全磷、溫度、有效磷等理化參數(shù)與前15 個(gè)屬分類水平上細(xì)菌、真菌群落之間的相關(guān)性（圖4）。就細(xì)菌而言，第1、第2 軸可分別解釋其變異率的45.5%、26.1%，其中全氮（解釋總方差的43.2%，P=0.002）、銨態(tài)氮（26.3%，P=0.002）、全磷（12.6%，P=0.002）、pH（3.6%，P=0.002）、有效磷（3.4%，P=0.002）、SUVA254（3.1%，P=0.004）與細(xì)菌群落的豐度和多樣性顯著相關(guān)，可共同解釋細(xì)菌群落與環(huán)境積累變化率的92.2%。就真菌而言，第1、第2軸可分別解釋其變異率的27.6%、22.7%，其中有效磷（26.7%，P=0.002）、SUVA254（11.5%，P=0.002）、C/N 比（9.5%，P=0.004）與真菌群落的豐度和多樣性顯著相關(guān)，可共同解釋真菌群落與環(huán)境積累變化率的47.7%。腐解第8、第14、第28 天細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定相似性，真菌群落結(jié)構(gòu)在腐解過(guò)程中差異較大。

圖4 屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的CCA分析Fig. 4 Analysis of RDA of microbial community structure and physical and chemical properties at genus level

3 討論

在堆肥過(guò)程中，溫度、pH、C/N、有機(jī)碳等參數(shù)的變化常用來(lái)檢測(cè)堆肥的成熟度和質(zhì)量[20]。本試驗(yàn)條件下，促腐菌劑可有效增加堆體全磷含量，這與李榮華等[21]研究結(jié)果一致。可歸因于磷本身不易分解轉(zhuǎn)化及“濃度效應(yīng)”[21-22]使堆體全磷含量顯著增加。促腐菌劑有助于促進(jìn)堆體有機(jī)碳的降解，但未及顯著程度，這與Wang 等[23]研究類似。有機(jī)碳作為微生物生長(zhǎng)、活動(dòng)的主要能量源，在堆體腐解過(guò)程中，其代謝、分解過(guò)程使大部分有機(jī)碳分解轉(zhuǎn)化為CO2和H2O，從而造成碳損失[20]。堆體全磷含量顯著增加而有機(jī)碳含量下降，這共同解釋了堆體C/P 顯著下降的原因。研究表明，SUVA254越高，有機(jī)質(zhì)芳香度越高，可指示堆體有機(jī)物分子復(fù)雜程度和腐殖化程度[24]。促腐菌劑可顯著增加堆體升溫期SUVA254值，與唐朱睿等[25]研究結(jié)果具有相似性，表明促腐菌劑能較好促進(jìn)稻稈腐解升溫期非腐殖質(zhì)類物質(zhì)向腐殖質(zhì)類物質(zhì)轉(zhuǎn)化[26]，這可能是由于稻稈腐解升溫期溶解性有機(jī)質(zhì)豐富，有機(jī)質(zhì)聚合作用使其芳香度增加[25]。

Alpha多樣性指數(shù)中Chao1和Shannon指數(shù)可表征微生物群落多樣性和豐富度，Chao1 指數(shù)越高表明微生物群落豐富度越高，Shannon 指數(shù)越高表明微生物群落多樣性和異質(zhì)性越高[27]。促腐菌劑處理的細(xì)菌、真菌Chao1和Shannon指數(shù)最大值均出現(xiàn)在第3 天，表明該階段細(xì)菌、真菌群落最復(fù)雜。門分類水平上細(xì)菌群落Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes 和Actinobacteria 相對(duì)豐度之和占細(xì)菌16S rRNA 基因序列總數(shù)的91.4%～99.8%，與Feng 等[27]在稻稈堆肥中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門類似。Proteobacteria 是相對(duì)豐度整體最占優(yōu)勢(shì)的門，研究表明，Proteobacteria 相對(duì)于其他微生物組分在秸稈分解中占主導(dǎo)地位[9]，夏金利等[28]研究促腐菌劑對(duì)園林廢棄物堆肥中微生物群落變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)Proteobacteria 豐度最高，與本試驗(yàn)結(jié)果具有一致性。此外，促腐菌劑有助于堆體第0～8 天Proteobacteria 的生長(zhǎng)繁殖，研究表明，Proteobacteria 在碳、氮循環(huán)及有機(jī)質(zhì)礦化中發(fā)揮重要作用，表明該細(xì)菌群落對(duì)稻稈腐解具有關(guān)鍵作用[29-30]。Firmicutes 豐度在升溫期后迅速降低，Liu 等[29]研究表明，F(xiàn)irmicutes 豐度在堆肥早期最高，但隨著堆肥成熟度增加其豐度逐漸降低，與本研究結(jié)果具有一致性。究其原因在于Firmicutes為嗜熱細(xì)菌[27]，多在中高溫階段占據(jù)主導(dǎo)地位[30]，通常高溫階段結(jié)束后不會(huì)存留在堆肥中[31]。Bacteroidetes 和Actinobacteria 豐度在冷卻期和成熟期較高，研究表明，Bacteroidetes和Actinobacteria對(duì)高溫敏感，其豐度在嗜熱期呈下降趨勢(shì)，在冷卻期和成熟期呈上升趨勢(shì)[23]，這與本研究Bacteroidetes和Actinobacteria 的豐度趨勢(shì)具有一致性。且促腐菌劑可促進(jìn)成熟期Bacteroidetes 和Actinobacteria的生長(zhǎng)繁殖，其中Bacteroidetes 被證實(shí)是專門降解高分子量化合物的細(xì)菌群落[29]，而Actinobacteria 是重要的木質(zhì)纖維素降解菌[32]，可以通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生木質(zhì)纖維素水解酶對(duì)木質(zhì)纖維素的降解產(chǎn)生積極影響[28]，表明促腐菌劑通過(guò)促進(jìn)Bacteroidetes和Actinobacteria繁殖，有助于稻稈成熟期腐解效率的提高。本試驗(yàn)條件下，Bacillus和Paenibacillus豐度均在升溫期達(dá)到峰值，可能由于其均屬芽孢桿菌科 （Bacillaceae），研究表明，屬于芽孢桿菌科的物種與較高的溫度顯著相關(guān)[27]，故Bacillus和Paenibacillus豐度在高溫階段后大幅下降。促腐菌劑使堆體升溫期Escherichia-Shigella和Cronobacter豐度均高于對(duì)照，Escherichia-Shigella、Cronobacter屬于Proteobacteria 門，有助于堆體碳、氮循環(huán)及有機(jī)質(zhì)礦化。

門分類水平上相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的真菌群落為Basidiomycota、Ascomycota、Unclassified Fungi，與Wang 等[33]在稻草豬糞共堆肥中報(bào)道的優(yōu)勢(shì)真菌門具有相似性。促腐菌劑可促進(jìn)堆體升溫期Basidiomycota 和冷卻期Ascomycota 的生長(zhǎng)繁殖，與Tian 等[34]在中草藥殘留物堆肥中報(bào)道的Basidiomycota、Ascomycota 豐度變化具有相似性。Wang 等[33]研究表明，Ascomycota 可促進(jìn)多種纖維素酶和半纖維素酶的分泌，與Basidiomycota 是堆肥過(guò)程中主要的木質(zhì)纖維素降解菌，表明促腐菌劑通過(guò)提高Basidiomycota、Ascomycota 的豐度增強(qiáng)升溫期和冷卻期堆體木質(zhì)纖維素的降解。另外，腐解第14 天Basidiomycota 豐度劇烈增加而Ascomycota 豐度迅速減少，可歸因于受堆肥溫度、腐殖物質(zhì)和分解的有機(jī)物的影響，使Basidiomycota 和Ascomycota 群落演替出現(xiàn)較大波動(dòng)[35]。Aspergillus可促進(jìn)有機(jī)物的降解，為嗜熱真菌屬[36]，Aspergillus豐度在腐解過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，符合其嗜熱特性。Melanocarpus、Thermomyces屬于Ascomycota 門，可以產(chǎn)生木聚糖酶降解半纖維素[27]，Thermomyces可以降解堆肥中的原生秸稈，是木質(zhì)纖維素的重要降解物[35]，促腐菌劑可促進(jìn)堆體升溫期Wallemia豐度和冷卻期Melanocarpus、Thermomyces的生長(zhǎng)繁殖，提高升溫期和冷卻期堆體木質(zhì)纖維素的降解效率。

堆體腐解過(guò)程亦為微生物群落結(jié)構(gòu)的演替過(guò)程，理化參數(shù)的變化對(duì)微生物的活性有直接和間接的影響，可影響微生物群落結(jié)構(gòu)。典型對(duì)應(yīng)分析表明，全氮是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子，與Yun 等[37]研究具有一致性，在一定程度上歸因于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化受制于氮源的質(zhì)量和數(shù)量[38]。有效磷、SUVA254對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，已有研究表明，核苷酸和磷脂中磷的代謝與真菌群落的發(fā)育密切相關(guān)[39]。SUVA254可指示堆體有機(jī)質(zhì)的芳香程度，而真菌群落在堆肥過(guò)程中對(duì)有機(jī)質(zhì)降解和碳循環(huán)起著關(guān)鍵作用[40]，這在一定程度上解釋了SUVA254對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于其他理化參數(shù)的原因。

綜上所述，本試驗(yàn)條件下，添加促腐菌劑可降低稻稈腐解產(chǎn)物C/P，增加全磷含量，影響稻稈腐解成熟度指標(biāo)；促進(jìn)堆體不同腐解時(shí)期優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria）、屬（Escherichia-Shigella、Cronobacter）和 優(yōu) 勢(shì) 真菌門（Basidiomycota、Ascomycota）、屬（Wallemia、Melanocarpus、Thermomyces）的生長(zhǎng)繁殖，從而促進(jìn)稻稈腐解。理化性狀對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)影響的相關(guān)性存在差異，全氮、有效磷分別是影響細(xì)菌、真菌群落最重要的環(huán)境指標(biāo)。