荷斯坦牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離鑒定及分化研究

宗俊霖， 王亞芹， 劉彥辰， 許龍， 關(guān)偉軍*

（1.佳木斯大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有增殖能力、多譜系分化能力和免疫調(diào)節(jié)特性而成為具有吸引力的細(xì)胞[1]。MSCs 首次從骨髓組織中分離鑒定出來，并一直被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)的良好種質(zhì)資源[2]。與骨髓干細(xì)胞不同，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord MSCs，UCMSCs）具有無痛的收集程序和更快的自我更新特性，不同的衍生方案可能提供不同數(shù)量的干細(xì)胞，同時在臍帶的不同組織（如華通膠、周圍血管）中可以分離出干細(xì)胞；與胚胎干細(xì)胞相比，具有更小的倫理道德爭議和更大的安全性。臍帶血來源的造血干細(xì)胞被稱為“珍貴的生命備份”[3]，臍帶血的生物銀行業(yè)務(wù)在世界范圍內(nèi)很常見，包括公共和私人服務(wù)[4]。MSCs 已經(jīng)被證實可用于治療部分疾病，如在腦缺血大鼠模型中，人類臍帶間質(zhì)干細(xì)胞（human UCMSCs，hUCMSCs）可以分化、移植并成功獲得功能,其還對帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、多發(fā)性硬化癥、視網(wǎng)膜疾病、1 型和2 型糖尿病以及肌源性疾病等具有一定的治療效果[5]。在干細(xì)胞的移植治療中，免疫反應(yīng)一直是危險因素之一，而UCMSCs 具有低免疫和免疫調(diào)節(jié)作用，可以增加移植細(xì)胞的存活率，降低移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）的風(fēng)險[6]。

近幾十年來，關(guān)于畜禽干細(xì)胞系資源的研究進(jìn)展較為緩慢，豬(Sus scrofa)[7]、山羊(Capra hircus)[8]、綿羊(Ovis aries)[9]和雞(Gallus gallus)[10]的部分胚胎干細(xì)胞研究近些年才獲得初步進(jìn)展。牛來源的MSCs 因其同樣存在再生潛力和可塑性，同時，MSCs 在分離培養(yǎng)或復(fù)蘇培養(yǎng)后仍具有抗炎促進(jìn)再生的能力，使得異體來源的干細(xì)胞治療在臨床上更具吸引力[11]。而牛MSCs 可從子宮、臍帶、骨髓、脂肪組織、胎盤和羊水等多種機(jī)體組織中分離出來，研究證實其對牛乳腺炎、糖尿病和卵巢營養(yǎng)不良導(dǎo)致的生育問題都有一定的治療效果[12-14]。本研究以3 月齡荷斯坦牛臍帶為材料進(jìn)行原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化潛能研究，不僅可以為今后研究UCMSCs 提供試驗材料，還可以為再生醫(yī)學(xué)提供新細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗動物 3 月齡健康荷斯坦牛胚胎由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平基地提供，實驗動物倫理審查編號為IAS2023-2。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白酶（trypsin）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基、多聚甲醛固定液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）購自塞維爾公司；膠原酶Ⅳ購自Sigma公司；DAPI、封閉用山羊血清、FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CD29、CD44、CD90、CD166 一抗購自美國Abcam 公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×ESTaqMasterMix 和ddH2O 購自TaKaRa 公司；表皮細(xì)胞生長因子 (epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維生長因子（bFGF）均購自英國Perotech 公司；Giemsa 染色液、油紅O、阿利辛藍(lán)染色液和茜素紅染色液購自索萊寶公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器 TE-2000-E 共聚焦顯微鏡，日本Nikon；TH4-200 倒置生物學(xué)顯微鏡和DP-12 圖像采集系統(tǒng)、BB160UV/BB5060UV CO2 培養(yǎng)箱，德國Heraeus；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡；無菌超凈工作臺，哈爾濱哈東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；細(xì)胞過濾器（80 μm 尼龍網(wǎng)），美國BD 獵鷹；蛋白分析儀，BioDrop；LA Taq儀器，日本TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 UCMCs 的分離培養(yǎng) 在無菌條件下用眼用剪刀切開牛胚胎絨毛膜，將整個臍帶組織分離出來，并放置在裝有PBS 的無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行清洗。剪斷華通膠和血管并將其切碎，用0.1%的Ⅰ型膠原酶在37 ℃下消化45 min。消化后懸浮液使用細(xì)胞過濾器過濾，1 200 r·min-1離心15 min，添加細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F 12、12%胎牛血清、10 ng·mL-1bFGF、10 ng·mL-1EGF、100 mg·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1鏈霉素），在細(xì)胞培養(yǎng)箱（溫度37 ℃、CO2含量5%）中培育。使用共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%～90%時，棄去舊培養(yǎng)基，用1 mL 0.25% 的胰蛋白酶（含0.01%EDTA）消化細(xì)胞2 min，再使用1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。由于上皮細(xì)胞對胰蛋白酶不敏感，在第4代（P4）后，細(xì)胞一般被純化。

1.2.2 UCMSCs 克隆能力和細(xì)胞生長曲線繪制取第5（P5）、第10（P10）、第15（P15）代細(xì)胞消化計數(shù)后，分別稀釋至100 cell·mL-1，各取1 mL懸液接種在60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)10 d 后。使用4%多聚甲醛固定15 min，后用Giemsa染色30 min，并在熒光倒置顯微鏡明場條件下拍照。取第5、第10和第15代細(xì)胞以104cell·mL-1接種于24孔微孔板中。每天隨機(jī)選取3 個孔計數(shù)細(xì)胞，以每天計數(shù)平均值繪制生長曲線，并計算種群倍增時間（population doubling time，PDT）。

式中，t0為對數(shù)生長開始時間，t為對數(shù)生長結(jié)束時的時間，N0為對數(shù)生長開始時的細(xì)胞數(shù)，Nt為對數(shù)生長結(jié)束時的細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 免疫熒光染色分析 培養(yǎng)的細(xì)胞在室溫下除去舊培養(yǎng)基，用1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3 次，加入1 mL 0.2% TritonX-100 裂解15 min 后吸除裂解液，PBS 洗滌1 次，用1 mL 10%正常山羊血清封閉1 h 后將細(xì)胞與BSA 稀釋的一抗在避光的冰箱中（BAS∶抗體=100∶1）過夜。然后將樣品與山羊抗兔FITC 標(biāo)記的二抗偶聯(lián)，在室溫下避光孵育1 h，然后參照說明書用DAPI 染色15 min。使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 使用Trizol 試劑裂解第5 代UCMSCs 和誘導(dǎo)后的細(xì)胞，加入10 μL DEPC 水溶解總RNA。用蛋白分析儀在260 nm 處的吸光度測定RNA 含量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對1 mg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載CD29、CD73、

CD90、CD166、CD45、LPL、PPAR-γ、COL-Ⅰ、OPN、ACAN、SOX9基因序列并設(shè)計引物（表1），以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為：2×ESTaqMasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 補至50 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 min，72 ℃延伸30 s，25 個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)情況。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.2.5 體外成骨誘導(dǎo) 取第5 代長勢良好的UCMSCs 在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM/F 12 培養(yǎng)基，10%胎牛血清、0.5 mmol·L-1地塞米松、10 mol·L-1甘油磷酸鹽和50 mmol·L-1維生素C）中培養(yǎng)。每4 d 更換1 次成骨培養(yǎng)基，21 d 后使用移液槍去除培養(yǎng)基，參照說明書用1 mL茜素紅液染色15 min，顯微鏡明場條件觀察是否有紅色骨結(jié)節(jié)出現(xiàn)。對誘導(dǎo)后細(xì)胞以RT-PCR，檢測OPN和COL-I基因以確定是否誘導(dǎo)成功。

1.2.6 體外成脂肪誘導(dǎo) 將第5 代長勢良好、匯合度在70% 的細(xì)胞置于成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM/F 12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中添加10%胎牛血清，0.5 mmol·L-1吲哚美辛，10 mmol·L-1胰島素，1 mmol·L-1地塞米松和IBMX）中培養(yǎng)，每4 d 換液1 次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)12 d 后吸除舊培養(yǎng)基，參照說明書采用油紅O 染液1 mL 染色15 min,顯微鏡明場下觀察是否有紅色脂滴。對誘導(dǎo)后細(xì)胞RTPCR，檢測LPL和PPAR-γ基因以確定是否被誘導(dǎo)成功。

1.2.7 體外成軟骨誘導(dǎo) 將第5 代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞置于軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM/F12 培養(yǎng)基，2.5% 胎牛血清，1% ITS，50 μg·mL-1脯氨酸，0.9 mmol·L-1丙酮酸鈉，10 μg·mL-1TGF-β3,50 μg·mL-1抗壞血酸）中培養(yǎng)，每4 d 更換1 次培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后吸除舊培養(yǎng)基，參照說明書用阿利辛藍(lán)1 mL 染液染色15 min，顯微鏡明場條件下觀察是否有藍(lán)色多糖團(tuán)的形成，對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，檢測ACAN和SOX9基因以確定是否成功誘導(dǎo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UCMSCs的形態(tài)分析

從圖1 可以看出，實質(zhì)分離的細(xì)胞（P1）呈長梭形緊密排列粘附在培養(yǎng)皿上，并與一些菱形的上皮樣細(xì)胞混合。第10代（P10）時菱形狀上皮樣細(xì)胞消失，并獲得了1 個全部為長梭形貼壁的細(xì)胞群。在后代中，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)差異。然而，第30代（P30）細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)出萎縮、細(xì)胞間間隙變大、空泡化等一系列衰老特征。

2.2 克隆形成和生長能力分析

從圖2可以看出，3代細(xì)胞的生長曲線均為典型的“S”形，經(jīng)過2 d緩慢增長時期，第3天進(jìn)入對數(shù)生長期，在第5天進(jìn)入數(shù)量穩(wěn)定時期。通過計算，其種群倍增時間各不相同，第5代（P5）細(xì)胞群體倍增時間最短，隨著代次升高群體倍增時間升高。

圖2 荷斯坦牛UCMSCs生長曲線和群體倍增時間Fig. 2 Growth curves and population doubling time of Holstein cattle UCMSCs.

顯微鏡下觀察到Giemsa染色的3個代次具有不同大小的紫色細(xì)胞團(tuán)（圖3），可知UCMSCs具有克隆團(tuán)形成潛力，第5（P5）、第10（P10）和第15 代（P15）都具有形成細(xì)胞克隆團(tuán)的能力?？寺F(tuán)內(nèi)的細(xì)胞也成漩渦狀排列，直徑和密集度隨著細(xì)胞代次升高而減小。

圖3 荷斯坦牛UCMSCs克隆團(tuán)形態(tài)Fig. 3 Clone group morphology of Helstein cattle UCMSCs

2.3 UCMSCs免疫熒光分析

免疫熒光檢測結(jié)果（圖4）顯示，UCMSCs 特異性標(biāo)記基因CD29、CD44、CD90和CD166均呈陽性表達(dá)，綠色熒光顯示細(xì)胞形態(tài)清晰邊緣明顯，DAPI顯示細(xì)胞核清晰可見。原始造血祖細(xì)胞標(biāo)志物CD45為陰性,符合UCMSCs表面標(biāo)志物的特性，表明從荷斯坦牛臍帶中成功分離出UCMSCs。

圖4 免疫熒光檢測荷斯坦牛UCMSCs表面標(biāo)志物Fig. 4 UCMSCs markers detection by immunofluorescence staining in Holstein cattle

2.4 多能性相關(guān)基因RT-PCR表達(dá)分析

RT-PCR 結(jié)果（圖5）顯示，UCMSCs 特異性標(biāo)記基因CD29、CD73、CD90、CD166和內(nèi)參GAPDH均陽性表達(dá)，而造血干細(xì)胞特異性標(biāo)記基因CD45陰性表達(dá)。與免疫熒光的結(jié)果對應(yīng)，同時也符合國際細(xì)胞治療協(xié)會（International Society for Cellular Therap，ISCT）對于MSCs 表面標(biāo)志物的規(guī)定[27]。

圖5 RT-PCR檢測標(biāo)記基因的表達(dá)Fig. 5 Marker genes expression by RT-PCR

2.5 UCMSCs體外多向誘導(dǎo)分化能力分析

2.5.1 誘導(dǎo)成骨能力分析 成骨誘導(dǎo)21 d后使用茜素紅染色（圖6），細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎噙呅?，可見?xì)胞間散落分布沉積的塊狀鈣鹽結(jié)節(jié)被染成紅色。RT-PCR 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)骨細(xì)胞關(guān)鍵基因COL-I和OPN。

圖6 荷斯坦牛UCMSCs分化成骨染色和RT-PCR結(jié)果Fig. 6 Osteoblast differentiation of Helstein UCMSCs and RT-PCR result

2.5.2 誘導(dǎo)成脂肪能力分析 成脂誘導(dǎo)12 d后使用油紅O試劑盒染色（圖7），誘導(dǎo)后的細(xì)胞由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形和扁圓型，細(xì)胞漿內(nèi)可見橘紅色不透明圓形油滴。RT-PCR 的結(jié)果顯示脂肪細(xì)胞脂蛋白脂酶（LPL）和過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPAR-γ）基因均表達(dá)。

圖7 荷斯坦牛UCMSCs分化成脂染色和RT-PCR結(jié)果Fig. 7 Adipogentic differentiation of Helstein UCMSCs and RT-PCR result

2.5.3 誘導(dǎo)成軟骨能力分析 成軟骨誘導(dǎo)21 d后使用阿利新蘭染色液染色（圖8），誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長，向被染成藍(lán)色的黏多糖的軟骨結(jié)節(jié)聚集成軟骨關(guān)鍵基因ACAN和SOX9均表達(dá)。

圖8 荷斯坦牛UCMSCs分化成軟骨染色和RT-PCR結(jié)果Fig. 8 Chondrocyte differentiation of Helstein UCMSCs and RT-PCR result

3 討論

臍帶是將胚胎附著于胎盤之上的器官，本身存在著血管（包括2條臍帶動脈和1條臍帶靜脈），保證懷孕期間胚胎的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)輸送，是造血干細(xì)胞的重要來源器官[15]。臍帶MSCs可以從整個臍帶組織中獲得，如羊膜上皮膜(amnion，AM)、臍帶內(nèi)膜(subamnion，SA)、華通氏膠(Wharton’s jelly，WJ)和臍血管周圍區(qū)域(perivascular,PV)[16]。目前對臍帶內(nèi)細(xì)胞分離主要采用組織塊貼壁法和酶消化法，組織塊貼壁法是將臍帶整個組織剪碎貼壁后再加入培養(yǎng)基的方法。相比于酶消法，組織塊貼壁法受影響的因素存在不確定性，組織塊的大小、部位都可能影響細(xì)胞生長，而酶消法能夠更加穩(wěn)定獲得所需MSCs。在對細(xì)胞傳代培養(yǎng)時，原代細(xì)胞會混雜一些血管內(nèi)皮樣細(xì)胞和血細(xì)胞，傳代培養(yǎng)后細(xì)胞被純化，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的克隆形成能力開始下降，群體倍增時間開始增加，說明隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，細(xì)胞衰老程度開始增長。

本試驗分離培養(yǎng)出的UCMSCs 符合ISCT 的最低標(biāo)準(zhǔn)，即在標(biāo)準(zhǔn)條件下貼壁生長，特異性抗原陽性，而造血干細(xì)胞抗原呈陰性并且同時具有三向誘導(dǎo)分化的能力。表面標(biāo)志物的熒光鑒定是干細(xì)胞鑒定的關(guān)鍵部分，不同物種分離的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物無明顯差異，都表達(dá)CD29、CD90、CD73和CD105，不表達(dá)CD45[17-18]。其中，CD45為白細(xì)胞的共同抗原，不存在于間充質(zhì)干細(xì)胞中，CD105是內(nèi)皮糖蛋白，是一種位于細(xì)胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）受體復(fù)合物之一。CD105 是調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)化生長因子、骨形成蛋白2（BMP-2）和骨形成蛋白7（BMP-7）結(jié)合相關(guān)的反應(yīng)，此外，它還參與血管生成的調(diào)節(jié)，表達(dá)于多種細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、分化細(xì)胞和癌細(xì)胞,參與細(xì)胞間相互作用[19]。

在體外不同培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化也是鑒別間充質(zhì)干細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)，本研究表明，UCMSCs 能夠在體外分化為脂肪、軟骨、骨3 種中胚層細(xì)胞，說明其具有良好的分化能力。骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記蛋白包括Collage type Ⅰ和OPN。Collage type Ⅰ是膠原蛋白家族的一員,廣泛存在于各種器官的軟骨組織中,占骨主要成分的80%[20]；OPN 標(biāo)志著向骨細(xì)胞分化的成熟早期[21]，誘導(dǎo)成脂肪的標(biāo)志物包括LPL 和PPAR-γ， PPAR-γ 屬于配體激活轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，作為誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的主要標(biāo)志因子[22]。軟骨基因標(biāo)志物ACAN 控制軟骨主要成分蛋白聚糖的合成，SOX9作為一種主轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控一系列控制軟骨形成下游因子[23]。MSCs 的體外三向誘導(dǎo)分化能力因其組織來源的不同而存在差異，Karahuseyinoglu 等[24]證明，臍帶來源的MSCs 向脂肪分化的能力低于骨髓來源的MSCs,而向軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分化的能力高于骨髓來源的MSCs。其還有向內(nèi)外胚層衍生細(xì)胞如胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞分化分化的潛能，Zheng 等[25]通過修改肝源性分化方案發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞分化組細(xì)胞具有肝細(xì)胞功能。CHAO 等[26]使用神經(jīng)條件培養(yǎng)基逐步培養(yǎng)UCMSCs，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞不僅表達(dá)胰島β 細(xì)胞的特異性基因，同時在移植到糖尿病大鼠模型中能夠釋放胰島素?？赡苡捎谌鄙袤w內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)，在體外誘導(dǎo)成的不同細(xì)胞會受到誘導(dǎo)條件和細(xì)胞來源影響，因此本試驗中誘導(dǎo)分化獲得細(xì)胞尚需更詳盡的方案來評價其多方面的功能。

綜上，本研究成功從3月齡荷斯坦牛胚胎臍帶組織中分離，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，并保持了好的增殖能力，具有向脂肪、骨和軟骨樣細(xì)胞分化,具有較高的分化潛能。有望在細(xì)胞治療方面發(fā)揮潛力,為組織工程學(xué)提供新的種子細(xì)胞。