• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于RNA-seq分析Eha調(diào)控遲緩愛德華菌抵抗酸化的作用

    2017-08-01 00:14:43李玉紅鄭恩金高大慶陸承平
    中國人獸共患病學(xué)報 2017年7期
    關(guān)鍵詞:酸化酸性測序

    劉 念,李玉紅,2,鄭恩金,高大慶,陸承平

    ?

    基于RNA-seq分析Eha調(diào)控遲緩愛德華菌抵抗酸化的作用

    劉 念1,李玉紅1,2,鄭恩金1,高大慶1,陸承平3

    目的 Eha是一個影響遲緩愛德華菌(Et)胞內(nèi)生存的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,本研究有助于揭示其調(diào)控Et抵御酸的分子機制。方法 用ATPase 抑制劑洛霉素A1抑制巨噬細胞的酸化,菌落計數(shù)法比較酸化對野生株和eha基因缺失株胞內(nèi)存活數(shù)目的影響;比較兩種細菌在酸性應(yīng)激實驗中存活率的差異;構(gòu)建pMP220-PehaLacZ質(zhì)粒,采用β-半乳糖苷酶實驗檢測eha基因的啟動子在不同酸性pH值下和不同培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)錄活性;選擇Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的一個酸性pH值和培養(yǎng)時間,分別提取兩種細菌RNA,進行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR驗證其結(jié)果。結(jié)果 野生株ET13在巨噬細胞內(nèi)和不同pH酸環(huán)境中的存活率明顯高于缺失株,阻止酸化胞內(nèi)菌數(shù)明顯高于未阻止酸化的胞內(nèi)菌數(shù)(P<0.05)。對數(shù)期細菌pH6.3培養(yǎng)基生長2 h,RNA-Sequencing結(jié)果表明:eha基因缺失株轉(zhuǎn)錄水平和野生株相比,147個差異顯著表達的基因(DEGs)(|log2 Ratio|≥1),其中113個上調(diào),34個基因下調(diào),qRT-PCR隨機抽樣,和RNA-Sequencing 表達趨勢呈強相關(guān)。147個基因采用GO數(shù)據(jù)庫進行功能聚類,分成25類,主要涉及細菌加工、定位、代謝、結(jié)合、催化、運輸、細胞成份;基于KEGG通路的富集分析,有130個可以富集到55條通路中,包括與氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)代謝及鐵的轉(zhuǎn)運等路徑,涉及基因較多的有雙組分系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、不同環(huán)境中的微生物代謝和次級代謝產(chǎn)物等路徑。結(jié)論 在酸性生存環(huán)境,Eha對Et的轉(zhuǎn)錄組呈多途徑、多基因的適應(yīng)性的全局性調(diào)控。

    eha基因;RNA-sequencing;E.tarda;酸化

    遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda,簡稱Et)屬于腸桿菌科愛德華菌屬,該菌能夠感染多種魚類,是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原體[1]。Et也可感染人,引起人的胃腸炎、腹膜炎、敗血癥和腦膜炎等疾病[2]。Et溶血調(diào)控基因(Et haemolysin activator gene,簡稱eha)是Et一個重要的毒力調(diào)控基因[3-4],Et菌能夠抵抗巨噬細胞吞噬體內(nèi)氧化和酸化的殺菌而生存繁殖,是其致病的關(guān)鍵[5],eha基因缺失引起Et 在巨噬細胞內(nèi)繁殖率降低的機制[6],尚未完全研究清楚。高通量測序技術(shù),具有測序通量高、成本低、速度快等特點,廣泛應(yīng)用于動植物及微生物的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域的研究。

    近年來,隨著新一代高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing technology)的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-Seq)技術(shù)已成為測序技術(shù)的重要手段。本研究首先分析Eha在調(diào)控細菌抵御巨噬細胞酸化殺菌的作用,采用RNA-Seq比較在酸性條件下,ET-13野生株和eha基因缺失株轉(zhuǎn)錄組表達差異的基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),通過生物信息學(xué)對其數(shù)據(jù)進行定性定量的分析,旨在分子水平識別DEGs的功能及其代謝通路,并利用熒光定量PCR隨機抽樣,驗證DEGs表達趨勢,初步探索Eha在調(diào)控Et抵御巨噬細胞酸化殺菌的分子機制。

    1 材料與方法

    1.1 Et毒力株 ET13為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陸承平教授惠贈;ET13的eha基因缺失株為本室保存;鼠源巨噬細胞RAW264.7為上海獸醫(yī)研究所王少輝博士惠贈;pMP220-PehalacZ質(zhì)粒東南大學(xué)毛曉華教授惠贈。細菌培養(yǎng)基(Luria Broth,LB):細胞培養(yǎng)液(Dulbecco’s Minimum Essential Medium,DMEM),胎牛血清(Fetal Bovine Serum,F(xiàn)BS)均購自Gibco公司。

    1.2 抑制酸化對細菌胞內(nèi)存活的影響 方法參考文獻[6],實驗組用含1 μmol/L ATPase 抑制劑洛霉素(Bafilomycin,BAF)A1的培養(yǎng)液處理細胞30 min,以阻止細胞吞噬體酸化,對照組用正常細胞培養(yǎng)液。對數(shù)期ET13野生株和eha缺失株以10∶1的感染復(fù)數(shù) (Multiplicity Of Infection,MOI)分別加入24孔單層細胞。共孵育1 h后,再用含慶大霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)液殺胞外的細菌1 h,此時定為0 h;換用含慶大霉素(10 μg/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0 h,2 h,4 h 或 6 h。在預(yù)定時間點,加入1 mL 1% Triton X-100裂解細胞10 min,將裂解產(chǎn)物經(jīng)稀釋,涂平板,培養(yǎng),菌落記數(shù)。以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標(biāo),活菌數(shù)(CFU/mL)為縱坐標(biāo),繪制細菌胞內(nèi)細菌數(shù)目和時間曲線。

    1.3 酸性環(huán)境的應(yīng)激實驗 方法參考文獻[6],對數(shù)期的菌體用PBS(pH7.2)漂洗2次后,菌液 OD600調(diào)節(jié)為0.5。菌液分為兩等份,一組為實驗組,經(jīng)不同pH(7.2,6.3,5.5,4.8,4.3)LB處理2 h,另一組作為對照組,正常培養(yǎng)。然后進行兩組培養(yǎng)液系列稀釋,涂平板,計數(shù)菌落。菌液濃度=平板菌落數(shù)/mL×稀釋倍數(shù),細菌存活率=實驗組菌液濃度(CFU/mL)/對照組菌液濃度(CFU/mL)×100%。

    1.4 構(gòu)建eha基因的啟動子和LacZ融合質(zhì)粒及β-半乳糖苷酶實驗 以ET13基因組DNA為模板,擴增eha的啟動子區(qū)域,將該片段插入 pMP220-LacZ載體中,構(gòu)建了eha基因的啟動子探針載體pMP220-PehaLacZ,然后將該載體電極導(dǎo)入eha基因缺失株中,檢測eha基因的啟動子在不同酸性pH值下和不同培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)錄活性,選擇Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的一個酸性pH值和培養(yǎng)時間。

    1.5 提取細菌的RNA 野生株與eha基因缺失株分別在pH值7.2的LB培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD值0.8),再在pH值6.3的LB培養(yǎng)2 h。分別提取兩種細菌的RNA,并檢測其濃度(μg/μL)和純度(OD260/OD280,OD260/OD230),及RNA完整性計數(shù)(RNA Integrity Number,RIN)。

    1.6 cDNA文庫的構(gòu)建與Illumina測序儀測序 根據(jù)細菌mRNA純化試劑盒的說明書提供的方法,將提取的總RNA中16S rRNA 與23S rRNA 除去,用帶有Oligo T(dT)的磁珠對mRNA進行富集純化。mRNA打斷成100-500 nt短片段后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,3′末端加polyA并連接測序接頭,連接產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增得到測序文庫,上機進行 Illumina Hi Seq 2000 測序(深圳華大基因公司完成)。

    1.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 測序所得的原始數(shù)據(jù)稱為原始標(biāo)簽(raw read),再進行過濾得到凈標(biāo)簽(clean read),用于后續(xù)分析。該序列信息已提交至NCBI Sequence Read Achieve數(shù)據(jù)庫,登錄號:SRX 1898774。

    1.8 差異表達基因分析 利用短reads比對軟件SOAPaligner/SOAP2 軟件,將測序數(shù)據(jù)與E.tarda菌ATCC15947參考基因組序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/)進行比對,統(tǒng)計clean reads 參考基因組及基因序列上的分布情況及覆蓋度;利用 RPKM(Reads Per Kb per Million)法計算基因的表達量,用于比較兩樣品間基因的差異表達情況,以p-value做多重假設(shè)檢驗校正,通過控制錯誤發(fā)生率(false discovery rate,F(xiàn)DR)來決定P閾值;采用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(http://www. genome. jp/kegg/)進行差異表達基因的功能聚類和生物學(xué)功能分析。

    1.9 實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR) 分別提取野生株與eha基因缺失株的RNA,隨機選取RNA-seq差異顯著15個基因,根據(jù)表1設(shè)計引物,操作按試劑盒說明書,反應(yīng)在ABI7300型熒光定量PCR儀上進行,以16S rRNA基因的表達量作為內(nèi)標(biāo)參照,采用2-ΔΔct法計算eha基因缺失株的基因轉(zhuǎn)錄水平相對野生株的倍數(shù),這些基因的表達趨勢和RNA-seq表達的基因趨勢做相關(guān)性分析。

    表1 qRT-PCR引物序列,產(chǎn)物大小和變性溫度

    Tab.1 Primer sequence product size and annealing temperature for RT-qPCR

    GenePrimersequence(5′→3′)Productsize/bpAnnealingtemperature/℃UpregulatedETATCC_RS01560GCCAGCACAGGTGATCTCGGCGAGGATACGGACATGAGCC13459.50ETATCC_RS01555TGGAGCCATTATCACTTTCGCGATCTGCGCTAATACCTCC15457.45ETATCC_RS05005TGGGCGTCGGTGCCTTCTTCGCCATCGCCAACAGGAATAG16657.55ETATCC_RS11570CTATCGCCAAACCCATTACCTCGTCACCGACTACAAACCA14155.40ETATCC_RS13205TTCCTGCGGCACAGTTGAAGGCATTGGCTGATTGGTTG19058.00ETATCC_RS14200TCTTCCAGCAGGGATTCGGGCTGGTCTTGGCTACCGTCA14759.50ETATCC_RS11220GGTGGACGAGGCGTTCCTTCAATAGCGGCAGCGACAGC17262.00ETATCC_RS10525CATTGGTGCGCCTGGAAGAACACGCCGATGGTGAACGT16860.00ETATCC_RS09485TGGCGCTAGTGCAAGAACATACGGCATGGATGCTGACC15558.00ETATCC_RS14205GCCATCTGGATCGGTAACTTCATCTCCTGCACATTGACGT16855.40DownregulatedETATCC_RS16120TAGCTGATCCAGCGTCCTGGCGTTTGAAGCCGTTAGAG14558.00ETATCC_RS06155ACTTTGCCGTGTTTGTCGCGCAGGGTTGAACAGCAGGA12458.00ETATCC_RS11420TTGGATCTGGAGAAGGGTGCTGCAATGTTGTCGAGGAGT14258.00ETATCC_RS00925TGACCGTGCGTGGTAATCCGCGGCTGTAGTGCTTCTGG18660.00ETATCC_RS10185AACTTGGTCGGTTGGGATGGCTGTGACGGGAGTTAGGC12059.45

    1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR基因的表達趨勢和RNA-seq表達的基因趨勢,用R2做相關(guān)性分析,R2>0.75表示強相關(guān)性,0.75>R2>0.45表示中等相關(guān)性,R2<0.45表示弱相關(guān)性。

    2 結(jié) 果

    2.1 比較抑制酸化對ET13野生株和eha基因缺失株在胞內(nèi)存活的影響 從圖1中可以看出,先用ATPase 抑制劑洛霉素A1處理巨噬細胞,以阻止酸化,再用野生株和eha基因缺失株分別感染RAW264.7細胞1 h,慶大霉素殺胞外菌1 h,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 或6 h時,它們胞內(nèi)CFU/mL明顯高于各自未阻止酸化的胞內(nèi)CFU/mL(P<0.05),表明巨噬細胞的酸化在抑制Et胞內(nèi)繁殖中起了很大作用,但酸化對野生株和缺失株各自抑制程度明顯不同。繼續(xù)培養(yǎng)6 h時,未阻止酸化野生株胞內(nèi)CFU/mL和未阻止酸化eha基因缺失株胞內(nèi)CFU/mL差異明顯(P<0.05),這說明eha基因在調(diào)控細菌抵御巨噬細胞酸化殺菌中起了重要作用,但同時,阻止酸化野生株胞內(nèi)CFU/mL和阻止酸化eha基因缺失株胞內(nèi)CFU/mL差異也明顯(P<0.05),這也說明eha基因在調(diào)控細菌抵御巨噬細胞殺菌中其它機制也起作用,如我們以前的研究表明,Eha蛋白能夠調(diào)控Et 抵抗Mф 氧化殺菌的作用[6]。

    圖1 比較酸對野生株和eha基因缺失株巨噬細胞胞內(nèi)存活的不同影響Fig.1 Comparison of the differences of the intracellular survival rates of the wild type and its eha mutant in macrophages against acid

    2.2 比較經(jīng)不同pH LB處理,野生株和eha基因缺失株存活率的差異 模擬細菌在巨噬細胞吞噬溶酶體中酸性的環(huán)境,對數(shù)期細菌經(jīng)不同pH(7.2,6.3,5.5,4.8,4.3)LB處理細菌2 h后,結(jié)果如圖2所示,eha基因缺失株的存活率明顯低于野生株(P<0.05),互補株的存活率介于缺失株和野生株之間。結(jié)果表明,eha基因在細菌在體外抵御酸的殺菌機制中起重要作用。

    圖2 比較不同pH酸對野生株和eha基因缺失株存活率的影響Fig.2 Comparison of the differences of the survival rates of the wild type and its eha mutant against different pH acid

    2.3 檢測eha基因的啟動子在不同環(huán)境刺激下的轉(zhuǎn)錄活性 體外模擬在巨噬細胞酸的生存環(huán)境,分別在不同時間和pH值的LB培養(yǎng)Et菌,檢測含pMP220-PehaLacZEt菌的β-半乳糖苷酶活性,結(jié)果表明,對數(shù)期的Et菌在pH值6.3的LB培養(yǎng)2 h,Eha轉(zhuǎn)錄水平最高。

    2.4 轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)評估 提取野生株與eha基因缺失株RNA濃度分別為1.905 μg/μL和1.255 μg/μL;純度:OD260/OD280,≥1.9,OD260/OD230≥2.0;RIN:10.0,表明其純度高,滿足建庫要求。為了構(gòu)建Et菌的cDNA文庫,其mRNA被隨機性打斷。其隨機性評估表明,ET13菌野生株和缺失株轉(zhuǎn)錄組測序不同的長度的clean reads在基因組中分布均勻。利用軟件將成功比對到基因組上的clean reads與參考基因序列進行比對,進行基因覆蓋度分析,結(jié)果表明,野生株和eha基因缺失株的clean reads中覆蓋率在90%以上的基因分別超過92%。

    2.5eha基因缺失株和野生株差異表達基因比較和功能聚類分析 利用RPKM法計算兩種細菌基因的表達量,閾值設(shè)為:|log2 Ratio|≥1,FDR≤0.001。在ET13野生株中,共有147個基因的轉(zhuǎn)錄水平與eha基因缺失株相比差異顯著,其中113個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),34個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。采用GO數(shù)據(jù)庫對147個差異表達的基因進行功能聚類分析,分成25類,這些基因主要涉及細胞加工(68個)、定位(30個)、結(jié)合(59個)、催化(83個)、運輸 (27個)、代謝 (78個)、細胞成份(37個)和細胞膜(33個) (圖3),Eha在酸性條件下調(diào)節(jié)這些基因。

    基于KEGG通路的顯著性富集分析,能確定DEGs參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)。結(jié)果顯示,147個DEGs中,有130個基因可以富集到55條通路中,包括10條與氨基酸代謝相關(guān)的路徑,16條與碳代謝、脂質(zhì)、酯酸及能量代謝相關(guān)的路徑,4條與核苷酸代謝相關(guān)的路徑,3條與硫代謝相關(guān)的路徑,以及一些與氮代謝、鐵的轉(zhuǎn)運等相關(guān)的路徑。涉及差異表達基因較多的代謝路徑主要有(|log2 Ratio|≥1) (表2):雙組分系統(tǒng)路徑(20個),ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)路徑(12個),不同環(huán)境中的微生物代謝路徑(21個)和次代謝的合成路徑(17個)。

    2.6 實時熒光定量PCR 隨機選取 15個DEGs進行qRT-PCR,驗證RNA-seq測結(jié)果。兩種方法結(jié)果表明,14個基因的表達趨勢出現(xiàn)了一致的結(jié)果,其相關(guān)性為強相關(guān)(R2=0.799>0.75),僅ETATCC-RS11570基因在eha基因缺失株和野生株中通過qRT-PCR檢測無明顯差異,與RNA-seq結(jié)果不一致(圖4)。

    圖4 比較qRT-PCR和RNA-seq發(fā)現(xiàn)的差異表達基因Fig.4 Comparison of significantly different expressed genes by qRT-PCR和RNA-seq

    Classification of DEGs between the wild type and the eha mutant,according to GO functional analysis (|log2 Ratio|≥1).圖3 ET 13 eha基因缺失株和野生株差異表達基因比較和聚類分析Fig.3 Classification of significantly different expressed genes between the wild type and its eha mutant of ET 13

    3 討 論

    本研究首先用洛霉素A1抑制酸化和菌落計數(shù)法,比較酸化對ET13株和它的eha基因缺失株胞內(nèi)存活數(shù)目的影響,以及比較兩種細菌在體外酸性應(yīng)激實驗中存活率的差異,發(fā)現(xiàn)了Eha在調(diào)控Et菌抵御巨噬細胞酸化殺菌和體外酸性環(huán)境中的重要作用。然后,采用β-半乳糖苷酶實驗檢測eha的啟動子在不同酸性pH值下和不同培養(yǎng)時間的轉(zhuǎn)錄活性;選擇Eha轉(zhuǎn)錄水平最高的一個酸性pH值和培養(yǎng)時間,分別提取兩種細菌RNA,進行RNA-Seq,比較ET13株和eha基因缺失株的轉(zhuǎn)錄組表達,發(fā)現(xiàn)了147個DEGs,對它們進行GO功能聚類和KEGG通路分析,結(jié)果如下:

    為了生存和適應(yīng)外界環(huán)境,細菌通過雙組分系統(tǒng)(Two-component system,TCS)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來響應(yīng)環(huán)境信號并對刺激作出應(yīng)答。本研究提示,20個DEGs涉及TCS系統(tǒng)路徑。在酸壓力下,eha基因缺失株中有7個DEGs上調(diào),13個DEGs下調(diào)。ETATCC_RS06140、ETATCC_RS06135 和ETATCC _RS06130分別編碼檸檬酸裂合酶CitC的α、β、γ亞基,ETATCC_RS06145和ETATCC_RS06150編碼CitG亞基。檸檬酸裂合酶是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,已經(jīng)報道,檸檬酸裂合酶基因突變的Et在感染魚的模型中生存力和致病性明顯下降[7]。ETATCC_RS14195和ETATCC_RS00005以及ETATCC_RS12655分別編碼谷氨酰胺酶和絲氨酸脫水酶。幽門螺桿菌產(chǎn)生的谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺脫氨,中和胃酸,這和該菌在胃的生存能力和致病性有關(guān)[8]。ETATCC_RS16530編碼一種外膜蛋白,它負責(zé)將莢膜多糖從周質(zhì)間隙運輸?shù)骄w表面,而莢膜直接參與細菌對環(huán)境的抗逆性[9]。Et菌通過Eha調(diào)控這些基因的表達量以抵抗酸性環(huán)境的刺激,增加其在細胞內(nèi)的存活能力。

    表2 基于KEGG通路分析在酸性條件eha基因調(diào)控差異明顯表達的基因

    Tab.2 KEGG pathway analysis of theeha-dependent genes differentially expressed in an acid condition

    PathwayGeneIDGenedescriptionRNA?Seq?Two?componentsystemETATCC_RS04225hydrogenase2smallsubunit1.229ETATCC_RS01230multidrugtransporter1.133ETATCC_RS14195glutaminase1.096ETATCC_RS081653?demethylubiquinone?93?methyltransferase1.082ETATCC_RS00005serinedehydratase1.080ETATCC_RS12655serinedehydratase1.045ETATCC_RS02740transcriptionalregulator1.025ETATCC_RS06125[citrate[pro?3S]?lyase]ligase-3.916ETATCC_RS06135citratelyasesubunitbeta-3.269ETATCC_RS06130citratelyasesubunitgamma-3.255ETATCC_RS07080putativecitratetransporter-2.859ETATCC_RS06140citratelyasesubunitalpha-2.725ETATCC_RS061502?(5′?triphosphoribosyl)?3′?dephosphoCoAsynthase-2.423ETATCC_RS06155antiporter-2.372ETATCC_RS061452?(5′?triphosphoribosyl)?3′?dephospho?CoAsynthase-2.347ETATCC_RS16525proteintyrosinephosphatase-2.234ETATCC_RS16530polysaccharideexportproteinWza-2.202ETATCC_RS04890aminoacidtransporter-1.216ETATCC_RS16520tyrosineproteinkinase-1.142ETATCC_RS11420flagellarproteinFliS-1.115BiosynthesisofsecondarymetabolitesETATCC_RS10420tryptophansynthasesubunitalpha2.208ETATCC_RS10415tryptophansynthasesubunitbeta1.787ETATCC_RS16110inosine?5?monophosphatedehydrogenase1.400ETATCC_RS02195phosphoribosylglycinamideformyltransferase1.383ETATCC_RS06795threoninedehydratase1.341ETATCC_RS14735chorismatesynthase1.107ETATCC_RS081653?demethylubiquinone?93?methyltransferase1.082ETATCC_RS00005serinedehydratase1.080ETATCC_RS10525glyoxylatereductase1.080ETATCC_RS12655serinedehydratase1.045ETATCC_RS12785riboflavinsynthasesubunitalpha1.041ETATCC_RS02280succinyl?diaminopimelatedesuccinylase1.039ETATCC_RS041802?succinyl?5?enolpyruvyl?6?hydroxy?3?cyclohexene?1?carbox?ylatesynthase1.027ETATCC_RS158158?amino?7?oxononanoatesynthase1.026ETATCC_RS01185sirohemesynthase1.001ETATCC_RS07360gluconokinase-3.176ETATCC_RS10185hypotheticalprotein-1.867ABCtransportersETATCC_RS16605nickelABCtransporterATP?bindingprotein2.617ETATCC_RS16615nickelABCtransporterpermeaseproteinNikB2.467ETATCC_RS16600nickelABCtransporterATP?bindingproteinNikE2.348ETATCC_RS16620nickelABCtransportersubstrate?bindingprotein2.129ETATCC_RS16610nickelABCtransporterpermeaseproteinNikC2.055續(xù)表PathwayGeneIDGenedescriptionRNA?Seq?

    ETATCC_RS10370aminoacidABCtransportersubstrate?bindingprotein1.718ETATCC_RS11635aminoacidABCtransporterATP?bindingprotein1.631ETATCC_RS10375cysteineABCtransporterpermease1.505ETATCC_RS07555thiamineABCtransporterpermease1.193ETATCC_RS14735chorismatesynthase1.107ETATCC_RS07595ironABCtransporterpermeaseABC1.012ETATCC_RS04890aminoacidtransporter-1.216FlagellarassemblyETATCC_RS11420flagellarproteinFliS-1.115ETATCC_RS14855flagellarhookproteinFlgK-1.072ETATCC_RS14860flagellarhookproteinFlgL-1.035MicrobialmetabolismindiverseenvironmentsETATCC_RS10375cysteineABCtransporterpermease1.505ETATCC_RS13205acidphosphatase1.313ETATCC_RS04225hydrogenase2smallsubunit1.229ETATCC_RS10905phosphonoacetaldehydehydrolase1.212ETATCC_RS06430haloaciddehalogenase1.195ETATCC_RS14735chorismatesynthase1.107ETATCC_RS13645cytochromeCnitritereductase1.099ETATCC_RS10525glyoxylatereductase1.080ETATCC_RS09485putativeoxidoreductase1.074ETATCC_RS04220hydrogenase1.048ETATCC_RS02280succinyl?diaminopimelatedesuccinylase1.039ETATCC_RS087253?mercaptopyruvatesulfurtransferase1.036ETATCC_RS07510putativelong?chainfatty?acid?CoAligase1.014ETATCC_RS04215putativeNiFe?hydrogenase2b?typecytochromesubunit1.011ETATCC_RS01185sirohemesynthase1.001ETATCC_RS04315thiosulfatesulfurtransferase1.000ETATCC_RS06135citratelyasesubunitbeta-3.269ETATCC_RS07360gluconokinase-3.176ETATCC_RS061502?(5′?triphosphoribosyl)?3′?dephosphoCoAsynthase-2.423ETATCC_RS10185hypotheticalprotein-1.867ETATCC_RS070755?oxopent?3?ene?1,2,5?tricarboxylatedecarboxylase-1.156

    Note:*RNA-seq,llog2 Ratio (eha_mutant_ET13/wild_ET13)l≥1.00

    ABC轉(zhuǎn)運子(ABC transporter)是細菌膜上的一種運輸ATP酶,如寡肽透過酶(Oligopeptide permease,Opp),控制著必需營養(yǎng)物質(zhì)進出細胞.在本研究中, 12個DEGs涉及該轉(zhuǎn)運路徑,編碼鎳、氨基酸、硫胺素、鐵等轉(zhuǎn)運蛋白。金葡菌Opp1ABC轉(zhuǎn)運子運輸鎳和鈷進入細胞,該突變子降低黏附小鼠膀胱和腎臟的能力,以及在泌尿道感染的模型中小鼠死亡率[10]。Et菌通過Eha調(diào)控這些基因的表達量以抵抗酸性環(huán)境的刺激,增加其在細胞內(nèi)的存活能力。

    微生物次級代謝產(chǎn)物的合成通常以初級代謝產(chǎn)物為前體,并受其調(diào)節(jié);次級代謝產(chǎn)物的合成過程易受環(huán)境因素的影響. 本研究發(fā)現(xiàn)17個DEGs涉及該路徑,均呈上調(diào)趨勢。ETATCC_RS10420和ETATCC_RS10415編碼的色氨酸合酶,沙眼衣原體的色氨酸合酶有助于它在Hela細胞內(nèi)的存活和對干擾素的抵抗力[11]。

    本研究發(fā)現(xiàn)ETATCC_RS11420、ETATCC_RS14855和ETATCC_RS14860分別編碼鞭毛蛋白FliC的分子伴侶FliS、鞭毛鉤絲FlgK和FlgL。FlgM-FliA回路在協(xié)調(diào)細菌鞭毛組裝中起關(guān)鍵作用。鞭毛是細菌的運動器官,鞭毛的運動方向受到細菌趨化作用系統(tǒng)的控制,鞭毛對于細菌的環(huán)境適應(yīng)性及致病性至關(guān)重要。在假結(jié)核耶爾森氏菌中,F(xiàn)liS作為分子伴侶通過調(diào)節(jié)FlgM的活性,調(diào)控后期鞭毛的表達、運動及生物膜形成(biofilm)[12]。生物膜是細菌為適應(yīng)自然環(huán)境,在生長過程中附著于固體表面而形成的特殊存在形式,生物膜的形成顯著增強了細菌對環(huán)境的抵抗能力。

    不同環(huán)境中的微生物代謝路徑涉及多種物質(zhì)的代謝與降解過程,參與細菌物質(zhì)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)20個DEGs直接涉及該路徑,ETATCC_RS13205拷貝的酸性磷酸酶,能夠在酸性條件下水解磷酸酯鍵如酪氨酸磷酸酯酶,它可以作用于許多含酪氨酸磷酸的蛋白,這些蛋白涉及信號傳導(dǎo)。對于細菌來說,該酶和致病菌的毒力因子I和IV莢膜的合成有關(guān),莢膜直接參與細菌對環(huán)境的抵抗能力[13]。

    綜上所述,我們將RNA-seq技術(shù)首次用于Et菌的轉(zhuǎn)錄組研究。 Eha通過調(diào)控147個靶基因,影響Et的能量,代謝和毒力,以適應(yīng)其酸性環(huán)境。因此,在酸性生存環(huán)境,Eha對Et菌的轉(zhuǎn)錄組呈多途徑、多基因的適應(yīng)性的全局性調(diào)控,這些結(jié)果有助于探討 Eha調(diào)控Et抵抗巨噬細胞酸化的殺菌機制。

    [1] Chen AP,Jiang YL,Qian D,et al. Edwardsiellasis[J]. China Fisheries,2011,7: 49-50. (in Chinese)

    陳愛平,江育林,錢冬,等. 遲緩愛德華氏菌病 [J].中國水產(chǎn),2011,7:49-50.

    [2] Nelson JJ,Nelson CA,Carter JE. Extraintestinal manifestations ofEdwardsiellatardainfection: a 10-year retrospective review[J]. J La State Med Soc,2009,161 (2): 103-106.

    [3] Sheng AK,Li YH,Zhang P,et al.ehagene regulates the virulence ofEdwardsiellatarda[J]. Chin J Zoonoses,2015,31(2): 125-129.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.02.007 (in Chinese)

    盛安康,李玉紅,張坡,等.eha基因調(diào)控遲緩愛德華菌的毒力[J]. 中國人獸共患病學(xué)報,2015,31(2):125-129.

    [4] Gao D,Cheng J,Zheng E,et al.Eha,a transcriptional regulator of hemolytic activity ofEdwardsiellatarda[J]. FEMS Microbiol Lett,2014,353(2): 132-140. DOI:10.1111/1574-6968. 12420.

    [5] Zhang L,Ni C,Xu W,et al. Intramacrophage infection reinforces the virulence ofEdwardsiellatarda[J]. J Bacteriol,2016,198(10): 1534-1542. DOI: 10.1128/JB.00978-15

    [6] Xu ZY,Li YH,Cheng J,et al.Ehagene is required forEdwardsiellatardaoxidative stress resistance in macrophage[J]. Chin J Zoonoses,2015,31(6):497-500. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2015.06.001(in Chinese)

    徐澤炎,李玉紅,成靜,等.eha基因調(diào)控遲緩愛德華菌抵抗巨噬細胞氧化殺菌作用[J]. 中國人獸共患病學(xué)報,2015,31(6):497-500.

    [7] Srinivasa Rao PS,Lim TM,Leung KY. Functional genomics approach to the identification of virulence genes involved inEdwardsiellatardapathogenesis[J]. Infect Immun,2003,71(3): 1343-1351.

    [8] Stark RM,Suleiman MS,Hassan IJ,et al. Amino acid utilisation and deamination of glutamine and asparagine byHelicobacterpylori[J]. J Med Microbiol,1997,46(9): 793-800.

    [9] Cooper CA,Mainprize IL,Nickerson NN. Genetic,biochemical,and structural analyses of bacterial surface polysaccharides[J]. Adv Exp Med Biol,2015,883: 295-315. DOI: 10.1007 /978-3-319-23603-2_16

    [10] Remy L,Carrière M,Derré-Bobillot A,et al. TheStaphylococcusaureusOpp1 ABC transporter imports nickel and cobalt in zinc-depleted conditions and contributes to virulence[J]. Mol Microbiol,2013,87(4): 730-743. DOI: 10.1111/mmi.12126

    [11] Muramatsu MK,Brothwell JA,Stein BD,et al. Beyond tryptophan synthase: identification of genes that contribute toChlamydiatrachomatissurvival during Gamma interferon-induced persistence and reactivation[J]. Infect Immun,2016,84(10): 2791-2801. DOI: 10.1128/ IAI.00356-16

    [12] Xu S,Peng Z,Cui B,et al. FliS modulates FlgM activity by acting as a non-canonical chaperone to control late flagellar gene expression,motility and biofilm formation in Yersinia pseudotuberculosis[J]. Environ Microbiol,2014,16(4): 1090-1104. DOI: 10.1128 /IAI.00356-16

    [13] Caselli A,Paoli P,Santi A,et al. Low molecular weight protein tyrosine phosphatase: Multifaceted functions of an evolutionarily conserved enzyme[J]. Biochim Biophys Acta,2016,1864(10): 1339-1355. DOI: 10.1016/j.bbapap.2016.07.001

    Deep sequencing analysis on transcriptomes ofEdwardsiellatardaregulated by Eha following acidification

    LIU Nian1,LI Yu-hong1,2,ZHENG En-jin1,GAO Da-qing1,LU Cheng-ping3

    (1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China;2.WuxiMedicineSchool,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

    Our studies tried to demonstrate Eha (Et haemolysin activator) could regulate the resistance of the bacterium against acidification to survive in the macrophage and explain its underlying molecular mechanism. When the bacteria infected the macrophages at time intervals,intracellular survival rate in bafilomycin-treated macrophages was higher than that with untreated cells,and the rate of wild type ET 13 was higher than that of itsehamutant,respectively (P<0.05). The survival rate of the wild type was higher than that of the mutant under acid treatment (P<0.05). To determine the conditions that induced the highest eha expression,we constructed a pMP220-PehaLacZ plasmid and determined thelacZ expression under different conditions. After exposure of pH6.3 medium for 2 h time,we performed the whole transcriptomic profiles of the wild type and mutant by RNA-sequencing. We identified 147 differentially-expressed genes (|log2 ratio|≥1),113 and 34 of which were significantly up-and down-regulated,respectively in the mutant,comparing with the wild type. These findings were validated by qRT-PCR. GO functional analysis revealed that these genes were divided into 25 categories,including the bacterial catalysis,cellular composition,combination,localization,metabolism,processing,and transportation. Based on the KEGG database,these genes were distributed in 55 pathways,such as two-component system,ABC transporters,and microbial metabolism in diverse environments. Overall,Eha is an important regulator to affect all kinds of target genes and pathways forE.tardato adapt to an acid environment. These results could be helpful for further investigations of the mechanisms by whichE.tardasurvives in macrophages.

    ehagene; RNA-sequencing;Edwardsiellatarda; acidification

    Gao Da-qing,Email: dgao2@seu.edu.cn

    10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.001

    國家自然科學(xué)基金(No.31570124)資助

    高大慶:Email:dgao2@seu.edu.cn

    1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,南京 210009; 2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院,無錫 214122; 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,南京 21009

    R378.2

    A

    1002-2694(2017)07-0575-08

    2016-10-01 編輯:張智芳

    Supported by the National Natural Science Foundation (No. 31570124)

    猜你喜歡
    酸化酸性測序
    杰 Sir 帶你認識宏基因二代測序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    酸性高砷污泥穩(wěn)定化固化的初步研究
    云南化工(2021年10期)2021-12-21 07:33:28
    二代測序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    論證NO3-在酸性條件下的氧化性
    檸檬是酸性食物嗎
    淺論水平井壓裂酸化技術(shù)的改造
    嗜酸性脂膜炎1例與相關(guān)文獻淺析
    基因捕獲測序診斷血癌
    海洋酸化或造成2.5億年前地球生物大滅絕
    單細胞測序技術(shù)研究進展
    国产一区二区三区视频了| 三级毛片av免费| 国产有黄有色有爽视频| 国产淫语在线视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 男女边摸边吃奶| 亚洲av电影在线进入| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜两性在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久视频综合| 国产精品偷伦视频观看了| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一区二区三区精品91| 一个人免费在线观看的高清视频| 午夜福利欧美成人| 国产在线一区二区三区精| 曰老女人黄片| 两个人看的免费小视频| 操美女的视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久中文字幕人妻熟女| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久精品亚洲av国产电影网| 极品教师在线免费播放| 91精品三级在线观看| 国产av一区二区精品久久| 精品视频人人做人人爽| 少妇精品久久久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 午夜免费成人在线视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中文字幕制服av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产视频一区二区在线看| av免费在线观看网站| 国产精品久久久久成人av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品一区二区三区av网在线观看 | 制服诱惑二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av电影在线进入| 免费观看人在逋| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日韩视频一区二区在线观看| 十八禁人妻一区二区| h视频一区二区三区| 免费少妇av软件| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产日韩欧美在线精品| 精品一品国产午夜福利视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品人妻1区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 婷婷成人精品国产| 午夜激情av网站| 国产精品国产av在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 搡老岳熟女国产| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲第一av免费看| 脱女人内裤的视频| 日韩欧美三级三区| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品二区激情视频| 九色亚洲精品在线播放| 欧美激情高清一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 免费高清在线观看日韩| 搡老熟女国产l中国老女人| 丝袜人妻中文字幕| 少妇精品久久久久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 嫁个100分男人电影在线观看| 97在线人人人人妻| 在线观看舔阴道视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产又爽黄色视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 一级片'在线观看视频| 91av网站免费观看| av在线播放免费不卡| 亚洲成人手机| 天天添夜夜摸| 亚洲九九香蕉| 十八禁网站网址无遮挡| 妹子高潮喷水视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品偷伦视频观看了| 在线 av 中文字幕| 一个人免费在线观看的高清视频| 麻豆成人av在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久av网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 男女边摸边吃奶| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一级,二级,三级黄色视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲avbb在线观看| 69av精品久久久久久 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女高潮到喷水免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 一级毛片电影观看| 夜夜爽天天搞| 国产欧美日韩一区二区三| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲熟女精品中文字幕| 日本欧美视频一区| 久久国产精品影院| 高清在线国产一区| av在线播放免费不卡| 曰老女人黄片| 制服人妻中文乱码| 一区在线观看完整版| 捣出白浆h1v1| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 宅男免费午夜| 婷婷成人精品国产| 99国产精品99久久久久| 高清在线国产一区| 最新在线观看一区二区三区| 一区二区三区精品91| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | √禁漫天堂资源中文www| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲中文av在线| a级毛片黄视频| 欧美大码av| 久久国产精品大桥未久av| 久久狼人影院| 婷婷成人精品国产| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产麻豆69| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 多毛熟女@视频| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 搡老岳熟女国产| 国产精品免费视频内射| 精品久久久精品久久久| 午夜久久久在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 国产三级黄色录像| 91九色精品人成在线观看| 黄片大片在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 日本五十路高清| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 波多野结衣一区麻豆| 黄色视频,在线免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品国产亚洲在线| 91精品国产国语对白视频| 免费观看人在逋| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品1区2区在线观看. | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲中文av在线| 精品国产亚洲在线| 757午夜福利合集在线观看| 国产av一区二区精品久久| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 麻豆av在线久日| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品国产一区二区精华液| 露出奶头的视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 91九色精品人成在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美日韩成人在线一区二区| 免费看十八禁软件| 91成年电影在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 久久国产精品影院| 国产精品久久久久久精品电影小说| 制服人妻中文乱码| 老鸭窝网址在线观看| 国产免费现黄频在线看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 美女福利国产在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 1024视频免费在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产单亲对白刺激| 久久免费观看电影| videosex国产| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产av国产精品国产| 老司机福利观看| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品电影一区二区三区 | 日本av免费视频播放| 十八禁网站网址无遮挡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| av天堂在线播放| 亚洲精品国产区一区二| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产高清国产精品国产三级| 精品免费久久久久久久清纯 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 男男h啪啪无遮挡| 国产成人精品久久二区二区免费| 9191精品国产免费久久| 高清在线国产一区| 在线观看一区二区三区激情| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 另类精品久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美国产精品一级二级三级| 两人在一起打扑克的视频| 99热国产这里只有精品6| 欧美黄色淫秽网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美精品人与动牲交sv欧美| a级毛片在线看网站| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产一区有黄有色的免费视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费看a级黄色片| 丝瓜视频免费看黄片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜免费成人在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 脱女人内裤的视频| 国产高清videossex| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲色图综合在线观看| 黄色 视频免费看| 不卡av一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 老司机亚洲免费影院| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产福利在线免费观看视频| 亚洲精品美女久久av网站| 国产午夜精品久久久久久| 日韩三级视频一区二区三区| 久久av网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 日韩视频在线欧美| 国产欧美日韩一区二区三| 飞空精品影院首页| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲伊人久久精品综合| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久香蕉激情| 大香蕉久久成人网| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美日韩成人在线一区二区| a级片在线免费高清观看视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产又爽黄色视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 搡老岳熟女国产| 宅男免费午夜| 91成年电影在线观看| 国产精品九九99| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 91成人精品电影| 国产伦理片在线播放av一区| 中文欧美无线码| av国产精品久久久久影院| 黄色毛片三级朝国网站| 999精品在线视频| 捣出白浆h1v1| 在线观看免费午夜福利视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久热这里只有精品99| 狠狠狠狠99中文字幕| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 老司机午夜十八禁免费视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产av又大| 一区二区三区精品91| 欧美日韩视频精品一区| 视频区图区小说| 久久中文字幕一级| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品国产高清国产av | 91精品三级在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产99久久九九免费精品| 窝窝影院91人妻| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品一区二区精品视频观看| 成人特级黄色片久久久久久久 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩欧美三级三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲黑人精品在线| 69精品国产乱码久久久| 精品久久蜜臀av无| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 多毛熟女@视频| 91大片在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 天堂8中文在线网| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲 国产 在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 黄色视频,在线免费观看| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产一区二区 视频在线| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲五月色婷婷综合| 色在线成人网| 高清视频免费观看一区二区| 免费少妇av软件| 成人亚洲精品一区在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 久久精品91无色码中文字幕| 久久99一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 老司机深夜福利视频在线观看| av线在线观看网站| 久久国产精品影院| 99re在线观看精品视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩欧美三级三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 麻豆国产av国片精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产高清videossex| 国产极品粉嫩免费观看在线| 两人在一起打扑克的视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产亚洲欧美精品永久| 日本av免费视频播放| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 精品国产一区二区久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 五月天丁香电影| 亚洲午夜理论影院| 黑人操中国人逼视频| 国产在线一区二区三区精| 国产精品.久久久| 中亚洲国语对白在线视频| 视频区图区小说| 国产精品免费大片| 在线 av 中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 精品亚洲成国产av| 国产一区二区三区综合在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 少妇的丰满在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 人妻 亚洲 视频| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品免费一区二区三区在线 | 三上悠亚av全集在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 精品久久久久久电影网| 国产精品免费大片| a级片在线免费高清观看视频| 99香蕉大伊视频| 久久香蕉激情| 国产成人av激情在线播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品二区激情视频| 亚洲人成电影观看| 中文字幕最新亚洲高清| 久热爱精品视频在线9| 飞空精品影院首页| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 午夜精品久久久久久毛片777| 黄色视频不卡| 麻豆成人av在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产成人一精品久久久| 老鸭窝网址在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美激情 高清一区二区三区| 桃花免费在线播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲色图综合在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品免费视频内射| 亚洲性夜色夜夜综合| 9色porny在线观看| 午夜福利欧美成人| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美日韩精品网址| 久久中文字幕一级| 久久99热这里只频精品6学生| 考比视频在线观看| e午夜精品久久久久久久| 999精品在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 一本久久精品| 日韩三级视频一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女主播在线视频| 国产视频一区二区在线看| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲色图综合在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜福利在线观看吧| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一级毛片电影观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲熟女毛片儿| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产av国产精品国产| 国产av一区二区精品久久| 亚洲伊人久久精品综合| 在线观看免费视频日本深夜| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 91字幕亚洲| 大香蕉久久成人网| 美女国产高潮福利片在线看| 91成年电影在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品久久久av美女十八| 国产97色在线日韩免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产黄色免费在线视频| 热99国产精品久久久久久7| 女性生殖器流出的白浆| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99久久精品国产亚洲精品| 热re99久久精品国产66热6| a级毛片在线看网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产日韩欧美亚洲二区| 一区二区三区精品91| 女性被躁到高潮视频| 成年人免费黄色播放视频| 午夜久久久在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 叶爱在线成人免费视频播放| 怎么达到女性高潮| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美成人免费av一区二区三区 | 我要看黄色一级片免费的| 久久中文字幕一级| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成人av一区二区三区在线看| 久久午夜亚洲精品久久| 少妇 在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产在线视频一区二区| 久久影院123| 欧美黑人精品巨大| 亚洲精品乱久久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 69精品国产乱码久久久| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品自拍成人| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲成人手机| 99在线人妻在线中文字幕 | 人人澡人人妻人| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美大码av| 国产不卡av网站在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| av在线播放免费不卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产在线观看jvid| 国产成人欧美在线观看 | 涩涩av久久男人的天堂| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品 国内视频| 亚洲色图av天堂| 国产成人精品无人区| 美国免费a级毛片| 俄罗斯特黄特色一大片| 美国免费a级毛片| 亚洲九九香蕉| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲av片天天在线观看| 老司机影院毛片| 99国产精品99久久久久| 色94色欧美一区二区| 国产1区2区3区精品| 亚洲,欧美精品.| www.精华液| avwww免费| 亚洲综合色网址| 飞空精品影院首页| 国产成人av教育| 亚洲少妇的诱惑av| 成人国语在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产男女内射视频| 国产主播在线观看一区二区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产xxxxx性猛交| 国产精品 欧美亚洲| 少妇被粗大的猛进出69影院| 黄色丝袜av网址大全| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品电影一区二区三区 | 国产欧美亚洲国产| 国产亚洲欧美精品永久| 悠悠久久av| 午夜老司机福利片| 日韩免费av在线播放| 18在线观看网站| 老司机在亚洲福利影院| a在线观看视频网站| 老司机靠b影院| 午夜老司机福利片| 十八禁高潮呻吟视频| 国产单亲对白刺激| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 两个人看的免费小视频| 十八禁网站网址无遮挡| 看免费av毛片| 视频区欧美日本亚洲| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产成人精品在线电影| 国产亚洲精品一区二区www | 91av网站免费观看| 久久久久网色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 12—13女人毛片做爰片一| 日本wwww免费看| 精品亚洲成国产av| 亚洲欧洲日产国产| 少妇被粗大的猛进出69影院| 青青草视频在线视频观看| 午夜福利在线免费观看网站| 高清欧美精品videossex| 精品福利永久在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 一区二区三区精品91| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 夜夜夜夜夜久久久久| 99re在线观看精品视频|