牛呼吸道合胞體病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

李艷婷，侯喜林

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牛呼吸道合胞體病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

李艷婷，侯喜林

目的 建立牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)檢測方法。方法 以重組純化的BRSV-G蛋白免疫家兔和小鼠，制備抗G蛋白的多克隆抗體(PcAb)和單克隆抗體(MAb)，方陣滴定法優(yōu)化DAS-ELISA方法抗體工作濃度及反應(yīng)條件，并對其敏感性、特異性、符合率進(jìn)行驗證。結(jié)果 獲得5株穩(wěn)定分泌抗G蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株，分泌抗體亞類均為IgG1型κ鏈，Western blot、IFA試驗表明PcAb和MAb均與G蛋白和BRSV發(fā)生特異性反應(yīng)，MAb作為捕獲抗體的最佳包被濃度為2.5 μg/mL，PcAb作為檢測抗體最佳工作濃度為5 μg/mL，判定臨界值為0.22，最低檢測限為1.43 μg/mL，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)均小于10%，與常引起牛呼吸道疾病的幾種病原均無交叉反應(yīng)，與RT-PCR的敏感性、特異性、符合率分別為92.0%、100%、95.6%。結(jié)論 建立的檢測BRSV的DAS-ELISA方法可用于臨床樣品的大規(guī)模檢測,為BRSV疫情的監(jiān)測和快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

牛呼吸道合胞體病毒；G蛋白；多克隆抗體；單克隆抗體；DAS-ELISA

牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是引起犢牛呼吸道疾病的主要病原[1]。BRSV感染引起犢牛的高發(fā)病率和高死亡率，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。自2007年王紅等[3]首次從黑龍江省某牛場成功分離出牛呼吸道合胞體病毒以來，之后我國多個省份陸續(xù)報道檢出BRSV病毒[4]，證明BRSV病毒已在我國普遍存在。牛是BRSV的天然宿主且感染率非常高，牛群中血清陽性率可達(dá)30%～70%，BRSV感染可引起60%～80%的發(fā)病率，20%的死亡率[5]。隨著我國集約化的養(yǎng)殖，需不斷從國外進(jìn)口優(yōu)質(zhì)犢牛，而我國尚未將BRSV列入檢疫范圍[6]，有可能從有該病國家引進(jìn)帶毒的牛，嚴(yán)重制約我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，因此建立有效地檢測方法對于我國BRSV感染的快速診斷和科學(xué)防治具有重要意義。

牛呼吸道合胞體病毒為有囊膜，非節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科肺病毒屬，BRSV RNA基因編碼11種蛋白[7]，其中G蛋白促進(jìn)BRSV病毒與宿主的結(jié)合，是主要的保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)病毒中和抗體的產(chǎn)生[8]。本研究基于馮軍科等[9]對BRSV G蛋白的截短與表達(dá)的基礎(chǔ)上，利用有抗原性和特異性的一段基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫新西蘭大白兔和BABL/c小鼠，分別制備抗G蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，建立檢測BRSV雙抗體夾心ELISA檢測方法，可為臨床診斷提供簡便快速的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 His-Binding-resin為上海點創(chuàng)生物科技有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基為HyClone產(chǎn)品；雙抗為Biosharp產(chǎn)品；胎牛血清為GIBCO產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測定試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇融合劑(PEG1450)、HAT、HT均為Sigma產(chǎn)品；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒為SouthernBiotech產(chǎn)品；Hi Trap Protein G親和層析柱為GE公司產(chǎn)品；HRP-羊抗鼠IgG為博奧森產(chǎn)品。

1.2 病毒、細(xì)胞及實驗動物 BRSV HJ株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室分離鑒定；牛輪狀病毒(BCV)、牛冠狀病毒(BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)均由本研究室保存；牛鼻拭子樣品采自黑龍江某規(guī)模化養(yǎng)殖場；SP2/0細(xì)胞為本研究室保存；清潔級體質(zhì)量1.5 kg～2.0 kg新西蘭大白兔和6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自哈爾濱華興家兔養(yǎng)殖基地。

1.3 重組蛋白的制備及抗體制備

1.3.1 重組G蛋白的制備 將構(gòu)建的pET30a-G重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Kan+平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆接種于含50 μg/mL Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12～14 h。按照1∶100的比例將菌液加入到含Kan+的LB液體培養(yǎng)中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.3～0.4時，取1 mL作為對照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 后各取1 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體沉淀加入上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白表達(dá)量，按照His-Binding-resin說明書純化重組G蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化的重組蛋白濃度，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多克隆抗體的制備 取純化后的重組蛋白2 mg，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后皮下多點注射新西蘭大白兔。15 d后，與首免相同劑量的抗原和等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，皮下多點注射。30 d后，與二免相同的劑量及接種方式進(jìn)行接種。37 d后，靜脈單獨注射相同劑量的蛋白抗原進(jìn)行加強免疫。加強免疫7 d后，心臟采血分離血清，Western blot和IFA鑒定其特異性，血清按照Protein G親和層析柱說明書方法進(jìn)行抗體純化，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單克隆抗體的制備 用純化的重組蛋白免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，免疫劑量為100 μg/只，免疫程序參考文獻(xiàn)[10]，每次免疫間隔時間為2周，融合前3 d，檢測小鼠血清抗體效價，效價達(dá)到1∶10 000以上時，腹腔單獨注射50 μg抗原進(jìn)行加強免疫。細(xì)胞融合后經(jīng)過3次亞克隆純化陽性雜交瘤細(xì)胞，之后進(jìn)行擴大培養(yǎng)和凍存。采用SouthernBiotech分型試劑盒對分泌的抗體進(jìn)行分型，將雜交瘤細(xì)胞注射BALB/c小鼠腹腔進(jìn)行腹水的采集，Western blot和IFA鑒定其特異性，按照Protein G親和層析柱說明書介紹的方法進(jìn)行抗體純化，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 間接免疫熒光試驗 參照文獻(xiàn)[11]方法分別驗證多克隆抗體和5株單克隆抗體的特異性。

1.4 雙抗體夾心ELISA方法的建立

1.4.1 操作程序 用0.05 mmol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋單克隆抗體，加入到96孔酶標(biāo)板內(nèi)，100 μL/孔，4 ℃包被過夜，次日取出包被好的ELISA板棄盡板中的液體，加入PBST溶液洗滌孔板，200 μL/孔，洗滌3次；每孔加入含5%脫脂乳的PBST溶液200 μL，37 ℃孵育封閉1 h，同樣的洗滌方法PBST溶液洗板3次；加入含有5%脫脂乳的PBST 稀釋后的純化的BRSV病毒液加入反應(yīng)孔內(nèi)，陰性對照為未感染BRSV病毒的Vero細(xì)胞培養(yǎng)液，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次；加入稀釋后的多克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板3次；加入TMB底物顯色液，100 μL/孔，室溫避光顯色15 min；之后加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，50 μL/孔，測定OD450值，并計算P/N值。

1.4.2 單抗、多抗?jié)舛群Y選 按照方陣滴定法，分別將單克隆抗體稀釋至20 μg/mL、10 μg/mL、 5 μg/mL、 2.5 μg/mL、1.25 μg/mL，多克隆抗體稀釋至20 μg/mL、10 μg/mL、 5 μg/mL、 2.5 μg/mL，按照上述DAS-ELISA方法操作程序進(jìn)行檢測純化BRSV病毒液，酶標(biāo)儀讀取OD450值，計算P/N值。

1.4.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化和包被條件的優(yōu)化 在下列5種條件下用單克隆抗體包被酶標(biāo)板：37 ℃封閉1 h、37 ℃封閉2 h 4 ℃過夜、37 ℃封閉1 h 4 ℃過夜、37 ℃封閉2 h 4 ℃過夜，分別進(jìn)行DAS-ELISA反應(yīng)，確定最適包被條件。

封閉液種類的優(yōu)化 分別選擇5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉、5%BSA、10%犢牛血清、1%明膠作為封閉液，進(jìn)行DAS-ELISA反應(yīng)，計算P/N值，選擇最佳封閉液種類。

酶標(biāo)二抗稀釋度的優(yōu)化 將酶標(biāo)二抗分別按照1∶1 000、 1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000比例進(jìn)行稀釋，按照上述DAS-ELISA方法進(jìn)行操作，通過分析結(jié)果確定最適酶標(biāo)二抗稀釋度。

顯色時間的優(yōu)化 將顯色時間分別設(shè)為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，分別進(jìn)行顯色測定OD450值，以確定最佳顯色時間。

1.4.5 DAS-ELISA特異性試驗 采用優(yōu)化的DAS-ELISA方法檢測本實驗室保存的BRSV、BPIV3、IBRV和BCV 4種病毒，同時設(shè)BRSV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照及細(xì)胞培養(yǎng)液空白對照，檢測建立的DAS-ELISA方法的特異性。

1.4.6 DAS-ELISA重復(fù)性試驗 批內(nèi)重復(fù)性試驗 以優(yōu)化的DAS-ELISA方法在同一塊酶標(biāo)板內(nèi)檢測5份BRSV陽性樣品，每份重復(fù)3孔，計算批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)。

批間重復(fù)性試驗 用不同批次的單抗分別包被5塊酶標(biāo)板，以同樣的方法在5塊酶標(biāo)板上分別檢測上述5份BRSV陽性樣品，每份重復(fù)3孔，計算批間重復(fù)性變異系數(shù)。

1.4.7 靈敏性試驗 將純化的BRSV病毒定量后，按照1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000倍比稀釋，進(jìn)行DAS-ELISA檢測，計算最低病毒檢出量。

1.4.8 DAS-ELISA與RT-PCR符合率試驗 將本實驗室保存的45份牛鼻拭子樣品，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5 min，取上清液，同時采用優(yōu)化的DAS-ELISA檢測方法和RT-PCR對樣品進(jìn)行檢測，比較2種方法的檢測結(jié)果，確定建立的DAS-ELISA與RT-PCR的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 目的蛋白的表達(dá)及純化 將構(gòu)建的pET30a-G重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，對不同的誘導(dǎo)時間進(jìn)行SDS-PAGE分析，可見最佳誘導(dǎo)時間為4 h，目的蛋白大小約為36 kD (圖1)，與預(yù)期大小相符。用His-Binding-resin對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，BCA試劑盒檢測純化后的蛋白濃度為2 mg/mL左右。

1：未誘導(dǎo)的 2：誘導(dǎo)的pET-30a;3～8：經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后1～6 h表達(dá)產(chǎn)物; M：低分子量蛋白Marker1: pET-30a-G without inducing by IPTG; 2: pET-30a;3-8: Expressed products induced by IPTG from 1 to 6 h respectively; M: Protein molecular weight marker.圖1 不同誘導(dǎo)時間表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the expression products of different induction time

1：裂解物上清;2：純化后的表達(dá)產(chǎn)物;M：低分子量蛋白Marker1: Supernatant of lysis; 2: The protein after purification; M: Protein molecular weight marker圖2 表達(dá)產(chǎn)物純化結(jié)果Fig.2 Purification of the expressed protein

2.2 抗體的純化鑒定 用rProteinG親和層析柱對采集的兔血清進(jìn)行純化，并測定純化后的濃度，SDS-PAGE電泳分析可見在55 kD和24 kD有特異性條帶(圖3)，因多克隆抗體為針對不同抗原表位的混合抗體，所以24 kD左右條帶呈現(xiàn)均勻彌散狀，純化后濃度為1.3 mg/mL。

小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細(xì)胞誘生腹水，用rProteinG親和層析柱進(jìn)行純化，進(jìn)行SDS-PAGE分析，55 kD和24 kD處出現(xiàn)兩條特異性條帶(圖4)，分別為重鏈和輕鏈。BCA試劑盒測定純化單克隆抗體濃度，5株單克隆抗體濃度分別為2.1 mg/mL、1.9 mg/mL、 1.7 mg/mL、2.0 mg/mL、1.6 mg/mL。

1：純化的多克隆抗體；M：低分子量蛋白Marker 1: Purified PcAb; M: Protein Molecular Weight Maker 圖3 多克隆抗體純化結(jié)果Fig.3 Results of the PcAb after purification

1-5：分別為1E3、2B4、3F6、4B8、5F7腹水純化SDS-PAGE結(jié)果; M：低分子量蛋白Marker 1-5：The results of 1E3，2B4，3F6，4B8，5F7 SDS-PAGE analysis of purified ascites; M: Protein molecular maker 圖4 單克隆抗體純化結(jié)果Fig.4 Results of the mAb after purification

2.3 抗體Western blot檢測 將純化的重組G蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜后，以制備的多克隆抗體作為一抗，與酶標(biāo)二抗結(jié)合，DAB顯色。可見36 kD處有特異性條帶(圖5)，與陰性血清無反應(yīng)，表明抗原和抗體能夠很好地結(jié)合。

Western blot對5株單抗的特異性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，在36 kD處出現(xiàn)特異性條帶(圖6)，而SP2/0細(xì)胞上清不能與目的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。

1,2：多克隆抗體；3：陰性對照；M：低分子量蛋白Marker 1,2: PcAb serum; 3: Negative control; M: Protein molecular Maker圖5 多克隆抗體Western blot鑒定結(jié)果Fig.5 Results of the PcAb of Western blot

1～5：分別為1E3、2B4、3F6、4B8、5F7 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；6：SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清；M：低分子量蛋白Marker 1-5: 1E3，2B4，3F6，4B8，5F7; 6: AP2/0; M: Protein molecular marker圖6 單克隆抗體Western blot鑒定結(jié)果Fig.6 Results of the mAb of Western blot

2.4 間接免疫熒光檢測 分別將多克隆抗體和5株單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測，檢測結(jié)果顯示多克隆抗體和5株單克隆抗體均與感染BRSV的Vero細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，陰性對照無熒光反應(yīng)(圖7)。

A：多克隆抗體；B～F.1E3、2B4、3F6、4B8、5F7；G：陰性兔血清；H：SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清A: PcAb; B-F: 1E3，2B4，3F6，4B8，5F7; G: Negative rabbits serum; H: SP2/0.圖7 單克隆抗體、多克隆抗體間接免疫熒光鑒定結(jié)果Fig.7 IFA identification of MAbs and PcAb reacted with BRSV

2.5 單抗、多抗最佳工作條件的確定 通過方陣滴定試驗測定結(jié)果，可見當(dāng)單抗最佳包被濃度為2.5 μg/mL，多抗最佳工作濃度為5 μg/mL時P/N值最大(表1)。

表1 單抗多抗最適工作濃度的確定

Tab.1 Determination of the optimal concentration of MAb and PAb

多抗工作濃度(μg/mL)ConcentrationofPcAb單抗包被濃度(μg/mL)ConcentrationofmAb201052．51．2520+2．8492．7822．7212．6032．402-0．3530．2980．2560．2350．203P/N8．0719．33610．62911．07711．83310+2．7962．6972．6442．5672．464-0．3400．2810．2050．2020．192P/N8．2249．59812．89812．70612．8315+2．6082．5672．5262．4452．133-0．3150．2630．1910．1760．165P/N7．9629．76013．22513．89212．922．5+2．5632．4792．4572．1421．928-0．2910．2560．1880．1640．153P/N8．8089．68413．06913．06112．601

注： + ：陽性；- :陰性

Note：“+”means positive; “-”means negative

分別對包被條件、封閉液種類、酶標(biāo)二抗?jié)舛?、及顯色時間等條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳包被條件為4 ℃過夜，最佳封閉液為5%脫脂乳，最佳酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶5 000，最佳顯色時間為20 min(圖8～圖11)。

圖8 最佳包被條件的選擇Fig.8 Optimization temperature and time of coating antibody

圖10 最佳酶標(biāo)二抗稀釋度的選擇Fig.10 Optimization dilution of enzyme-labeled antibody

圖9 最佳封閉液的選擇Fig.9 Selection for optimal blocking reagents

圖11 最佳顯色時間的選擇Fig.11 Determination of substrate optimal reaction time

2.8 特異性試驗 試驗結(jié)果表明，建立的DAS-ELISA方法與BCV、BRV、IBRV以及BPIV3均無交叉反應(yīng)(表2)，表明該方法特異性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 對5份陽性樣品分別進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗和批間重復(fù)性試驗，試驗結(jié)果表明批內(nèi)重復(fù)性試驗變異系數(shù)為3.79%～4.12%，批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)為2.96%～6.55%，變異系數(shù)均小于10%(表3)，表明建立的DAS-ELISA方法重復(fù)性良好。

2.10 靈敏性試驗 用建立的DAS-ELISA法檢測倍比稀釋后的病毒液，結(jié)果表明隨著稀釋度的增大其OD450值呈線性下降，當(dāng)稀釋度為1∶32 000(病毒含量1.43 μg/mL)時，結(jié)果為陽性，而當(dāng)稀釋度為1∶64 000(病毒含量0.71 μg/mL)時，結(jié)果為陰性(表4)。表明建立的DAS-ELISA法最低檢測量為1.43 μg/mL，具有較高的靈敏度。

表2 雙抗體夾心ELISA方法特異性試驗

Tab.2 Result of specific test for DAS-ELISA

待測樣品SamplesBRSVBCVBRVIBRVBPIV3OD4502．3980．1640．1820．1920．127P/N13．5711．3151．2451．3021．073S0．0180．0210．0230．0190．022結(jié)果判定Result+----

注： + ：陽性；- :陰性

Note：“+”means positive; “-”means negative

表3 DAS-ELISA方法重復(fù)性試驗

Tab.3 Repeatability assay for DAS-ELISA

樣品Sampleno．批間重復(fù)Introbatch批內(nèi)重復(fù)Interbatchx±SCVx±SCV12．431±0．0214．052．397±0．0203．9322．423±0．0223．932．413±0．0224．0732．392±0．0173．862．425±0．0196．5542．386±0．0194．122．419±0．0233．7452．296±0．0153．792．422±0．0172．96

表4 DAS-ELISA法靈敏性試驗結(jié)果

Tab.4 Sensitivity test results of DAS-ELISA

BRSV稀釋倍數(shù)DilutionofBRSV病毒含量(μg/mL)ConcentrationsofthevirusOD450ValueofOD450P/N值ValueofP/N標(biāo)準(zhǔn)差S結(jié)果Result1∶100045．762．57714．150．020+1∶200022．882．32512．770．021+1∶400011．442．10411．560．019+1∶80005．721．5278．3900．015+1∶160002．861．0315．6640．018+1∶320001．430．4932．7080．016+1∶640000．710．2011．1040．014-空白對照0．000．182-

注： + ：陽性；- ：陰性

Note：“+”means positive; “-”means negative

2.11 符合率試驗 45份疑似BRSV感染的牛鼻拭子同時使用DAS-ELISA檢測方法和RT-PCR檢測方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。在DAS-ELISA中，23份樣品被確定為陽性，在RT-PCR中，25份樣品被確定為陽性，兩種方法的敏感性、特異性、符合率分別為92.0%、100%、95.6%。

表5 DAS-ELISA方法與RT-PCR方法符合率結(jié)果

Tab.5 The coincidence rate of DAS-ELISA method and RT-PCR method

RT?PCR檢測結(jié)果RT?PCRtestresultsDAS?ELISA檢測結(jié)果DAS?ELISAtestresults陽性陰性總數(shù)陽性23225陰性02020總數(shù)232245

3 討 論

近年來，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，需不斷地從國外引進(jìn)優(yōu)質(zhì)奶牛，而我國未將BRSV列入檢疫范圍，市場上也無商品化疫苗，因此及時檢測出BRSV病毒，盡早淘汰BRSV陽性牛，對我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展意義重大。目前國內(nèi)外報道的牛呼吸道合胞體病毒的診斷方法主要有病毒的分離鑒定、血清中和實驗、補體結(jié)合實驗、免疫熒光檢測、RT-PCR方法等，而病毒的分離鑒定作為病毒檢測的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但病毒分離周期長，成本高，因此不適合臨床樣品大批量的檢測，上述其他檢測方法均需專業(yè)設(shè)備、特殊試劑、專業(yè)人員，因此基層大規(guī)模檢測難以普及。有研究表明BRSV暴發(fā)后會出現(xiàn)很高的血清轉(zhuǎn)換可達(dá)22%～53%[12]，因此只檢測BRSV抗體會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此抗原的檢測對于確定是否感染BRSV是必要的。而DAS-ELISA檢測方法是測定抗原的一種常用的方法，與普通ELISA不同之處為多加了一層抗體，因此提高了檢測的特異性[13]。

雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法在基層臨床大規(guī)模檢測中使用比較普及[14]，近年來我國學(xué)者分別對牛傳染性鼻氣管炎病毒[15-16]、牛皰疹病毒[17]、牛病毒性腹瀉病毒[18]建立了DAS-ELISA檢測方法，用該方法同IDEXX公司抗原檢測試劑盒和RT-PCR檢測同一批臨床樣品，符合率均很高，可用于臨床樣品的檢測。本實驗室曾成功建立了牛輪狀病毒DAS-ELISA檢測方法[19]和牛副流感病毒3型DAS-ELISA檢測方法[13]，經(jīng)臨床樣品檢測該方法與RT-PCR試驗相比符合率分別為95%和94.6%，為臨床的檢測和開展病原學(xué)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。而有關(guān)BRSV的DAS-ELISA檢測方法還未見報道，因此本研究在馮軍科等對BRSV G基因截短表達(dá)的基礎(chǔ)上選用具有抗原性的G1段基因進(jìn)行表達(dá)，原核表達(dá)的蛋白制備的抗體滴度較高且具有較好的反應(yīng)原性[19]，因此利用原核表達(dá)的G蛋白作為抗原制備兔抗G蛋白高免多克隆抗體和鼠抗G蛋白單克隆抗體，獲得5株分泌抗體亞類均為IgG1型κ鏈的單克隆細(xì)胞株，利用獲得的抗體進(jìn)行建立檢測BRSV的DAS-ELISA檢測方法，因該方法具有較高的敏感性，選用同動物源的抗體會產(chǎn)生非特異性，因此選用1株單克隆抗體和多克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，大大的降低了非特異性，經(jīng)不斷傳代和細(xì)胞凍存復(fù)蘇，間接ELISA檢測1E3雜交瘤細(xì)胞分泌抗體最為穩(wěn)定，因此選擇1E3為捕獲抗體，多克隆抗體為檢測抗體。通過方陣滴定試驗對抗體的濃度進(jìn)行摸索，確定單抗?jié)舛?.5 μg/mL，多抗5 μg/mL時效果最好，并對包被條件、封閉液種類、酶標(biāo)二抗稀釋度、顯色時間等進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，提高了其敏感性，建立的DAS-ELISA方法與牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3型無交叉反應(yīng)，特異性良好，最低可檢出1.43 μg/mL BRSV病毒。用建立好的DAS-ELISA檢測方法檢測45份樣品，與RT-PCR方法的敏感性、特異性、符合率分別為92.0%、100%、95.6%。本研究建立的DAS-ELISA檢測方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、敏感度高，能在短時間內(nèi)直接檢測樣品中BRSV抗原，較其他檢測方法更為省時省力，適用于獸醫(yī)基層大批量樣本的檢測，為BRSV的流行病學(xué)調(diào)查和診斷提供了有效的技術(shù)手段。

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Establishment and evaluation of DAS-ELISA for detecting bovine respiratory syncytial virus

LI Yan-ting，HOU Xi-lin

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

In order to develop a double antibody sandwich assay (DAS-ELISA) for detecting bovine respiratory syncytial virus (BRSV)，New Zealand white rabbits and BALB/c mice were immunized with the purified G protein as an antigen to prepare anti-G protein polyclonal and monoclonal antibodies. The antibody concentration and reaction conditions of DAS-ELISA were optimized by square titration，and its sensitivity，specificity，and coincidence rate were validated. Five hybridoma were stably secreting MAb which subclass belonged to IgG1κ. Western blot and IFA test showed that PcAb and MAb could react specifically with G protein and BRSV. The PcAb and MAb as the capture antibody and detection antibody respectively，and their optimal working concentrations were determined to be 2.5 μg/mL and 10 μg/mL，the critical value 0.22 and the detection limit of 1.43 μg/mL，batch，inter-assay coefficient of variation less than 10%. The DAS-ELISA had no cross-reaction with several pathogens which often caused bovine respiratory disease. When 45 nasal swabs of clinical samples were simultaneously detected by the DAS-ELISA and RT-PCR，the sensitivity，specificity and coincidence rate were 92.0%，100%，95.6%，respectively. It’s indicated that the established DAS-ELISA detection method can be used to detect a large number of clinical samples. It was the foundation of monitoring and quick diagnosis for BRSV.

bovine respiratory syncytial virus; G protein; polyclonal antibody; monoclonal antibody; DAS-ELISA

Hou Xi-lin，Email: xly_hou@163.com

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(No. YJSCX2016-Y18)和黑龍江省教育廳資助項目(No. 12521372)聯(lián)合資助

侯喜林，Email：xly_hou@163.com

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.011

R373.1

A

1002-2694(2017)07-0628-09

2016-12-21 編輯：張智芳

Supported by the Graduate Student Innovation Research Project in Heilongjiang Bayi Agricultural University (No. YJSCX2016-Y18) and the Funded Projects by Department of Education in Heilongjiang Province (No. 12521372)