連續(xù)性血液透析濾過對四氯化碳模型大鼠肝腎腸功能的保護(hù)作用

包美美,許盼盼,吳春麗

包美美,許盼盼,吳春麗,金華市人民醫(yī)院血透室 浙江省金華市 321000

核心提要 背景 四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)中毒是化工從業(yè)人員常見的中毒類型,但目前尚無特效的臨床藥物能治療此類中毒導(dǎo)致的肝、腎、腸損傷.目的 探索連續(xù)性血液透析濾過(continuous blood purification,CBP)對口服CCl4中毒大鼠肝、腎、腸功能的保護(hù)作用及其潛在干預(yù)機(jī)制.方法 將斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬状笫蠓譃閷φ战M、模型組(CCl4)和CBP治療組(CCl4+CBP),利用CCl4灌胃建立大鼠模型.收集外周血用于檢測白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)以及血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,AST)、D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)、腸性脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)和降鈣素(procalcitonin,PCT)的水平.將收集的肝腎腸組織進(jìn)行相關(guān)病理檢測,免疫組化法和免疫印跡法檢測核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路的相對表達(dá)水平.結(jié)果 CBP處理可顯著降低CCl4引起的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多(P＜0.05)以及血清BUN、Cr、CRP、ALT、AST、D-LA、I-FABP和PCT的水平的增高(P＜0.05),并降低腎臟組織中損傷標(biāo)記物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的表達(dá)以及肝、腎、腸相關(guān)病理形態(tài)改變.免疫組化和免疫印跡法檢測顯示,CBP處理能降低CCl4引起的NF-κB通路激活(P＜0.05).結(jié)論 CBP對CCl4引起的肝、腎、腸損傷具有保護(hù)效果,其可能通過降低CCl4引起NF-κB通路激活從而改善肝、腎、腸損傷的癥狀.

0 引言

腎功能損傷通常由化學(xué)毒素、藥物過量等毒性因素引起[1].四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)為常見的一種工業(yè)溶劑,是公認(rèn)的肝毒素[2].肝臟并不是CCl4唯一的毒靶器官,其還在如腎、腸、肺、睪丸、腦和血液等其它器官或組織中誘發(fā)自由基的生成并造成損害[3].目前已有證據(jù)表明接觸或誤服CCl4可誘發(fā)急性和慢性的肝、腎、腸損傷[4],由此引起的肝、腎、腸功能下降可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅人類健康.目前針對此類疾病尚無特異的干預(yù)措施.目前已建立成熟的口服CCl4中毒的相關(guān)動物模型,此可為理解CCl4中毒導(dǎo)致的相關(guān)肝、腎、腸等器官損傷的病理生理學(xué)機(jī)制及開發(fā)相關(guān)療法提供極好的模型方法.

Kramer等[5]人于1977年報道了連續(xù)動靜脈血液濾過作為急性腎衰竭患者的治療方案.此后,源自此策略的一系列治療模式被命名為連續(xù)性腎臟替代療法,也稱為連續(xù)性血液凈化或連續(xù)性血液透析濾過(continuous blood purification,CBP)[6].近年來,CBP在清除重大疾病中的炎癥介質(zhì)中的應(yīng)用一直是危重病醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn).口服CCl4中毒誘導(dǎo)器官損傷的動物模型可模擬臨床中常見的急性肝、腎、腸損傷疾病模型.在本研究中,我們探究了CBP對CCl4引起的肝、腎、腸損傷的潛在保護(hù)作用.

1 材料和方法

1.1 材料 核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB,NFκB)p65(A2547)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)抗體(A3176)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(AF1186)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(A0208)、花青素3(cyanine 3,Cy3)綴合的山羊抗兔二抗(A0516)、蛋白裂解液(P0013C)、考馬斯亮藍(lán)法蛋白測定試劑盒(P0006C)和BeyoECL增強(qiáng)發(fā)光試劑盒(P0018S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)(C013-2-1)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)(H126-1-2)、肌酐(creatinine,Cr)(C011-2-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)(C009-3-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)(C010-3-1)、D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)(A019-2-1)、腸性脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid-binding protein,I-FABP)(H265-1-1)和降鈣素(procalcitonin,PCT)(H153)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptavidin-perosidase,SP)法檢測試劑盒(SP0021)購自北京索萊寶科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組處理: 18只雄性7 wk齡斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠(200 g-230 g)購自杭州啟真實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司(SCXK(浙)2022-0005),在維持22 ℃-25 ℃和保持12 h/12 h的光/暗循環(huán)的屏障環(huán)境中飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水.在實(shí)驗(yàn)中,將大鼠隨機(jī)分為三組: 對照組、模型組(CCl4)和CBP治療組(CCl4+CBP),每組納入6只SD大鼠.對照組大鼠灌胃生理鹽水,CCl4組和CCl4+CBP組給大鼠灌胃CCl4(溶于11%橄欖油),劑量為1 mL/kg.CBP治療方法參照文獻(xiàn)[7],通過右頸內(nèi)靜脈插入雙向留置導(dǎo)管,形成體外循環(huán)系統(tǒng),用稀釋法以200 mL/min的流速注入替代液,在連接導(dǎo)管前,用肝素-生理鹽水(5000 U/L)循環(huán)沖洗右頸內(nèi)靜脈30 min,治療期間用1500 U/h的肝素持續(xù)抗凝,透析處理持續(xù)24 h.實(shí)驗(yàn)第3天,收集大鼠眼眶靜脈血2.5 mL,麻醉后處死大鼠,立即取出肝臟、腎臟和腸,用生理鹽水沖洗3次以去除血液,然后分為倆部分,一部分用石蠟包埋用于后續(xù)病理研究,另一部分儲存在80 ℃下用于蛋白免疫印跡檢測.實(shí)驗(yàn)程序按照實(shí)驗(yàn)動物管理和使用的指導(dǎo)原則進(jìn)行.

1.2.2 血生化測定: 每只大鼠取0.3 m L靜脈血用EDTA-K2抗凝后,用VH20型血細(xì)胞分析儀(深圳市錦瑞生物科技股份有限公司)對血中白細(xì)胞(white blood cell,WBC)和中性粒細(xì)胞(neutrophil,NEU)計(jì)數(shù).剩余外周靜脈血以2500 rpm離心5 min,收集血清,并根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測血清中BUN、CRP、Cr、ALT、AST、D-LA、I-FABP和PCT水平.

1.2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色組織病理學(xué): 將石蠟包埋的肝、腎和腸組織切為6 μm厚的切片.將切片用二甲苯脫蠟,然后在從高到低不同濃度的酒精中對組織進(jìn)行再水合.組織切片行HE染色.在CX23型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察.

1.2.4 免疫熒光和免疫組化染色: 將不同分組的組織切片按上述方法進(jìn)行脫蠟水合后,分別進(jìn)行免疫熒光和免疫組化染色.對于免疫熒光染色,腎組織切片用10%山羊血清室溫封閉1 h,滴加抗NGAL抗體(1:500)在4 ℃下孵育過夜,洗片后,用Cy3綴合的山羊抗兔二抗(1:500)在37 ℃下避光孵育60 min,切片用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復(fù)染,在BX53M型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察.對于免疫組化染色,按免疫組化SP法檢測試劑盒說明書步驟,組織切片經(jīng)3%雙氧水處理和10%山羊血清室溫封閉后,滴加NF-κB p65抗體(1:300)在4℃下孵育過夜,按SP法進(jìn)行免疫組化,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,在CX23型光學(xué)顯微鏡下觀察.

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測: 分別將肝、腎和腸組織切成大小大致相同的小塊,以150-250 μL/20 mg組織的比例加入蛋白質(zhì)裂解緩沖液(含1%蛋白酶磷酸酶抑制劑),勻漿,在冰上裂解30 min以完全溶解組織.在4 ℃下裂解的樣品以12000 rpm離心10 min.用考馬斯亮藍(lán)法蛋白測定試劑盒測量上清液中的蛋白濃度.取含等量蛋白的裂解上清液通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白,并轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上.封閉后,加入NF-κB p65抗體(1:2000)和GAPDH抗體(1:8000)4 ℃下孵育過夜.用0.5%吐溫20緩沖液沖洗膜后,室溫下孵育HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1:2000)1 h.用BeyoECL增強(qiáng)發(fā)光試劑盒顯像,用Image J軟件量化NF-κB p65蛋白的相對表達(dá)水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用GraphPad Prism 8.0.0軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD).用單因素方差分析組間差異.P＜0.05的值表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠血液生化指標(biāo)的影響 首先通過血液生化法檢測了創(chuàng)傷/炎性指標(biāo)(WBC和NEU細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP和PCT水平)、腎功能指標(biāo)(BUN和Cr水平)、肝功能指標(biāo)(ALT和AST水平)和腸功能指標(biāo)(D-LA和I-FABP水平).表1結(jié)果所示,CCl4導(dǎo)致大鼠肝腎腸損傷,表現(xiàn)為WBC和NEU細(xì)胞增多(P＜0.05)、CRP、PCT、BUN、Cr、ALT、AST、D-LA和I-FABP水平均顯著升高(均P＜0.05),而CBP能有效降低CCl4誘導(dǎo)的上述指標(biāo)(均P＜0.05).

表1 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(mean±SD,n=6)

2.2 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)的影響 本研究對CBP參與改善CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)進(jìn)行了HE染色觀察檢測.對照組大鼠的肝、腎、結(jié)腸和小腸的病理形態(tài)正常.CCl4組大鼠的肝、腎、腸組織病理形態(tài)學(xué)均發(fā)生了明顯改變,表現(xiàn)為: 肝實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞呈灶狀或帶狀壞死、細(xì)胞凋亡和氣球樣變、匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤;腎小管部分上皮細(xì)胞空泡變性、系膜基質(zhì)擴(kuò)張且有明顯的腎小球肥大及腎小球體積增加;小腸和結(jié)腸組織的絨毛變短和結(jié)構(gòu)不清晰、絨毛黏膜上皮層的上皮細(xì)胞受到破壞.CCl4+CBP組大鼠的肝、腎、腸組織病理形態(tài)學(xué)均較CCl4組得到明顯改善.具體見圖1所示.

圖1 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)的影響(HE染色法).CBP: 連續(xù)性血液透析濾過;Ctrl: 對照組;CCl4:四氯化碳,模型組;CCl4+CBP: 連續(xù)性血液透析濾過治療組.

2.3 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠腎損傷的影響 本研究進(jìn)一步采用免疫熒光標(biāo)記NGAL評估了CBP對CCl4模型大鼠腎損傷的影響,熒光染色(圖2)顯示,CCl4組急性腎損傷的生物標(biāo)志物NAGL的熒光表達(dá)豐度較對照組明顯增高,說明CCl4組大鼠發(fā)生了腎損傷;而CCl4+CBP組腎組織中NAGL表達(dá)較CCl4組明顯降低,說明CBP能降低CCl4導(dǎo)致的腎損傷.

圖2 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠腎損傷標(biāo)記物NAGL表達(dá)的影響(免疫熒光染色法).DAPI: 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚;NAGL: 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白;CBP: 連續(xù)性血液透析濾過;Ctrl: 對照組;CCl4: 四氯化碳,模型組;CCl4+CBP: 連續(xù)性血液透析濾過治療組.

2.4 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織NF-κB通路激活的影響 為研究CBP對CCl4誘發(fā)肝、腎、腸損傷的保護(hù)作用的機(jī)制,本研究采用免疫組織化學(xué)法和蛋白免疫印跡法檢測肝、腎、腸組織中NF-κB的表達(dá)情況,圖3結(jié)果顯示,CCl4誘導(dǎo)了肝、腎、腸組織中NF-κB p65表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);而CBP則有效降低了CCl4導(dǎo)致該通路激活,即: NF-κB p65表達(dá)較CCl4組明顯降低(P＜0.05).

圖3 連續(xù)性血液透析濾過抑制CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織NF-κB通路激活. A: 每組大鼠肝組織代表性NF-κB p65免疫組織化學(xué)染色圖像(左)、蛋白免疫印跡檢測(中)及相對表達(dá)量(右);B: 每組大鼠腎組織代表性NF-κB p65免疫組織化學(xué)染色圖像(左)、蛋白免疫印跡檢測(中)及相對表達(dá)量(右);C: 每組大鼠結(jié)腸組織代表性NF-κB p65免疫組織化學(xué)染色圖像(左)、蛋白免疫印跡檢測(中)及相對表達(dá)量(右).NF-κB p65: 核轉(zhuǎn)錄因子p65;CBP: 連續(xù)性血液透析濾過;Ctrl: 對照組;CCl4: 四氯化碳,模型組;CCl4+CBP: 連續(xù)性血液透析濾過治療組.aP＜0.05,與對照組相比;bP＜0.05,與模型組相比;n=6.

3 討論

CCl4中毒主要見于是二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷及氯仿等化工從業(yè)人員.常見的CCl4中毒方式包括吸入高濃度CCl4蒸汽中毒和接觸、口服CCl4中毒.盡管CCl4中毒方式存在差異,但CCl4最為突出的是肝臟損害,另外腎臟也為CCl4損傷靶器官,其還能引起胃腸功能紊亂和其他靶器官損傷[3,4,8,9],而目前尚無特效藥物對此類損傷進(jìn)行干預(yù).近來研究認(rèn)為,CBP不僅可維持機(jī)體水平衡和排泄代謝產(chǎn)物,還可調(diào)節(jié)炎癥和促進(jìn)器官恢復(fù),尤其是腎衰竭相關(guān)疾病的重要治療策略[10,11].另外,CBP也常用于其他急性器官損傷的治療[12],但其確切機(jī)制尚不清楚.本研究通過CCl4口服(灌胃)法建立了大鼠的急性內(nèi)臟損傷模型,并在此探索了CBP對CCl4引起內(nèi)臟損傷的保護(hù)性作用效果,發(fā)現(xiàn)其可改善CCl4導(dǎo)致的大鼠肝、腎、腸損傷,并初步揭示了其作用可能與抑制NF-κB信號活性有關(guān).

眾所周知,過度的炎性反應(yīng)是急性多器官損傷發(fā)生的關(guān)鍵病理學(xué)因素.炎性介質(zhì)的釋放,刺激細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-1β等)、趨化因子和粘附分子的產(chǎn)生,級聯(lián)放大反應(yīng),進(jìn)一步增強(qiáng)了炎性損傷[13].另一方面,活性氧的產(chǎn)生能導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體損傷,加劇炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[14].因此,抑制炎性微環(huán)境在治療急性器官損傷中起著重要作用.本研究顯示,CBP能降低CCl4造模大鼠外周血中WBC和NEU細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血清CRP和PCT水平,體現(xiàn)了CBP能清除促炎性介質(zhì)的能力.此外,本研究以腎功能(BUN和Cr水平)、肝功能(ALT和AST水平)和腸功能(D-LA和I-FABP水平)生化標(biāo)記物、組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)以及腎組織損傷標(biāo)志物水平的改變證實(shí)了CBP對CCl4造成的肝、腎、腸損傷的治療效果.

既往研究證實(shí)了NF-κB信號通路可通過炎性反應(yīng)參與調(diào)節(jié)急性器官損傷的進(jìn)展[15,16].NF-κB信號通路在組織中的改變與損傷發(fā)生及緩解密切相關(guān),其被認(rèn)為是急性器官損傷中的細(xì)胞因子信號通路、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子生成的關(guān)鍵中樞信號通路[15-18].已有研究表明,抑制NF-κB信號通路能減輕CCl4導(dǎo)致的動物模型中肺、肝、腎和腸損傷[17,19-21].為探討CBP對CCl4造成的內(nèi)臟損傷的改善作用是否與NF-κB通路有關(guān),我們實(shí)驗(yàn)分析了各組肝、腎和腸組織中NF-κB p65表達(dá),發(fā)現(xiàn)NF-κB p65在CCl4造模大鼠中高表達(dá),而給予CBP治療后其表達(dá)降低,提示CBP可能至少通過抑制CCl4肝、腎和腸組織中NF-κB信號激活,進(jìn)而改善急性器官損傷的炎性反應(yīng)以及損傷癥狀;但其中涉及的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明.

4 結(jié)論

總之,本研究提示CBP可改善CCl4造成的肝、腎和腸損傷,其機(jī)制至少與抑制NF-κB信號介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān),但具有機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明.另外,本研究還提示了CBP治療可能是治療肝、腎和腸損傷尤其是腎損傷的潛在候選干預(yù)策略.在應(yīng)對器官損傷時,應(yīng)嚴(yán)格考慮多器官并發(fā)損傷的潛在因素,尤其存在腎損傷可能時應(yīng)及時給予CBP治療.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

四氯化碳中毒可引起肝臟、腎臟和腸等器官損傷,而目前針對此類損傷尚無特效的干預(yù)措施.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

連續(xù)性血液透析濾過是急重性內(nèi)臟器官損傷的常見干預(yù)措施,而其對四氯化碳中毒可引起肝臟、腎臟和腸等器官損傷的干預(yù)效果尚不清楚.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

以灌胃法建立四氯化碳中毒模型大鼠,觀察連續(xù)性血液透析濾過是否對四氯化碳中毒大鼠的肝、腎、腸發(fā)揮器官保護(hù)作用.

實(shí)驗(yàn)方法

收集大鼠外周血及肝、腎和腸組織,進(jìn)行血液生化檢測和病理學(xué)檢測.免疫熒光法觀察腎損傷標(biāo)記物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白表達(dá),免疫組織化學(xué)和免疫印跡法檢測核轉(zhuǎn)錄因子p65的表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)性血液透析濾過改善四氯化碳中毒大鼠的血液生化指標(biāo)及肝、腎、腸組織的病理學(xué)形態(tài),降低腎組織中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的表達(dá)及肝、腎、腸組織中核轉(zhuǎn)錄因子p65的表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

連續(xù)性血液透析濾過能對四氯化碳中毒大鼠的肝、腎、腸發(fā)揮器官保護(hù)作用.

展望前景

連續(xù)性血液透析濾過可能是四氯化碳中毒的潛在候選干預(yù)策略,特別是存在腎損傷可能時應(yīng)及時給予連續(xù)性血液透析濾過干預(yù).