膿毒癥誘導(dǎo)大鼠延髓內(nèi)臟帶膽堿能神經(jīng)元凋亡及其對(duì)系統(tǒng)性炎癥和行為學(xué)的影響

黃 偉,李紅兵,張 程

膿毒癥誘導(dǎo)的失控系統(tǒng)性炎癥與高死亡率密切相關(guān)[1],對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥進(jìn)行神經(jīng)調(diào)控是近年的研究熱點(diǎn)。既往研究證實(shí)延髓內(nèi)臟帶(medullary visceral zone,MVZ)參與應(yīng)激反應(yīng),是重要的自主神經(jīng)及免疫調(diào)節(jié)的整合中樞[2]。MVZ通過膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)釋放乙酰膽堿,作用于免疫細(xì)胞的α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR),從而抑制系統(tǒng)性炎癥與免疫[3-4];GTS-21作為α7nAchRs特異性激動(dòng)劑,可顯著抑制膿毒癥導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎癥,同樣,MLA作為α7nAchRs特異性拮抗劑,可增強(qiáng)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),表明干預(yù)CAP對(duì)系統(tǒng)性炎癥具有明顯影響。已知膿毒癥能誘導(dǎo)MVZ等區(qū)域的神經(jīng)炎癥并導(dǎo)致神經(jīng)功能的異常[5-7]。另一方面,膿毒癥誘導(dǎo)的腦損傷可導(dǎo)致血腦屏障的破壞[8],促進(jìn)GTS-21和MLA通過血腦屏障進(jìn)入中樞。中樞神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞均能表達(dá)α7nAChRs[9],且激活小膠質(zhì)細(xì)胞上的α7nAChRs能抑制中樞炎癥[10],干預(yù)CAP 對(duì)MVZ神經(jīng)病理及神經(jīng)功能的影響目前尚不清楚。此外,膿毒癥病人往往表現(xiàn)為精神萎靡、情緒低落、活動(dòng)減少、呼吸異常等病態(tài)行為,與部分中樞的神經(jīng)炎癥相關(guān)[11]。已知MVZ通過杏仁核及前腦等高級(jí)中樞參與調(diào)控膿毒癥病人的情緒與行為[12],抑制神經(jīng)炎癥是治療膿毒癥抑郁癥的重要的策略[13]。干預(yù)CAP對(duì)膿毒癥病態(tài)行為的影響及其機(jī)制,需要進(jìn)一步的探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠64只,周齡6周,許可證號(hào):SYXK(鄂)2018-0104;購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[出售許可證號(hào):SCXK(鄂)2017-0012]。大鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)愛和使用協(xié)定指南(IACUC)執(zhí)行,并經(jīng)過貴陽市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2019007)。

1.2 主要試劑

GTS-21,貨號(hào):29834(dihydrochloride MCE);甲基牛扁亭(methyllycaconitine,MLA),貨號(hào):HY-N2332A/CS-0021211 (MCE);熒光(FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG,武漢博斯特,貨號(hào):BA1105;熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗小鼠IgG,武漢博斯特,貨號(hào):BA1031;DAPI,武漢三鷹,貨號(hào):C1002; CHAT,武漢博斯特,貨號(hào):bs-2423R;TH,武漢博斯特,批號(hào):BM4568;Caspase-3,武漢三鷹,貨號(hào):66470-2-IG。

1.3 主要儀器

脫水機(jī),型號(hào):武漢俊杰JT-12J電腦生物組織脫水機(jī);病理切片機(jī),型號(hào):德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī);抗原修復(fù)用電陶爐,型號(hào):SKG;顯微鏡,型號(hào):奧林巴斯BX53型生物顯微鏡。

1.4 研究方法

1.4.1 動(dòng)物及分組、處理方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后按照隨機(jī)數(shù)字表分為3組,并進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)。對(duì)照組8只:正常飼養(yǎng),不做任何處理。假手術(shù)組8只:大鼠剖腹但不進(jìn)行盲腸穿刺結(jié)扎法(cecum ligation and puncture,CLP)進(jìn)行膿毒癥制備[14],并予哌拉西林(50 mg/kg)腹腔注射,每日3次,連續(xù)3 d。膿毒癥組48只,采用CLP制備膿毒癥模型,成功后隨機(jī)再分為3組,每組16只,哌拉西林使用同假手術(shù)組;模型組給予生理鹽水(1 mL/100 g)腹腔注射,每日3次,連續(xù)3d;GTS-21組以GTS-21(4 mg/kg[15])腹腔注射,每日1次,連續(xù)3 d進(jìn)行干預(yù);MLA組以MLA(4.8 mg/kg)[16-17]腹腔注射,每日1次,連續(xù)3 d進(jìn)行干預(yù)。3 d后處死大鼠進(jìn)行延髓的免疫熒光檢測(cè)。

1.4.2 大鼠行為學(xué)評(píng)分

采用膿毒癥嚴(yán)重程度評(píng)分(Murine Sepsis Score,MSS)進(jìn)行評(píng)分[18],記錄大鼠外觀、意識(shí)水平、行為表現(xiàn)、對(duì)刺激的反應(yīng)、睜眼反應(yīng)、呼吸頻率、呼吸質(zhì)量等分值。由3名實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行單獨(dú)評(píng)分,取平均值評(píng)價(jià)各組大鼠在造模后1、2、3 d的病情嚴(yán)重程度。

1.4.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)

采用灌注取腦的方式,制備大鼠延髓中尾段的石蠟包埋切片,分別用于標(biāo)記 Caspase-3及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,CHAT)的一抗混合物中孵育24 h,然后將切片與熒光標(biāo)記的二抗(Cy3,FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG)中孵育4 h,最后將切片用帶有 DAPI 媒介對(duì)切片中所有細(xì)胞進(jìn)行核染色,使用奧林巴斯 BX53 生物顯微鏡拍攝,用Image pro(ipp6.0)軟件分析每組3幅圖像,計(jì)算平均光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MSS評(píng)分比較

對(duì)照組MSS評(píng)分為0,膿毒癥模型組、GTS-21組及MLA組評(píng)分高于對(duì)照組,且MLA組評(píng)分高于GTS-21組(P<0.05),GTS-21組在第1天第2天評(píng)分低于模型組;同組大鼠評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1。

圖1 各組大鼠MSS評(píng)分比較

2.2 各組大鼠行為學(xué)分類評(píng)分比較

分類評(píng)分中,膿毒癥各組外觀、意識(shí)水平、行為表現(xiàn)、對(duì)刺激反應(yīng)、睜眼反應(yīng)、呼吸頻率、呼吸質(zhì)量評(píng)分均高于對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05),3組間分類評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠MSS分類評(píng)分散點(diǎn)圖(與對(duì)照組同時(shí)間比較,＊ P<0.05;與假手術(shù)組同時(shí)間比較,#P<0.05)

2.3 延髓中尾段膽堿能神經(jīng)元的分布

免疫熒光可以看出膽堿能神經(jīng)元主要集中在孤束核(solitary nucleus,NTS)、迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核(dorsal vagus motor nucleus,DVMN)和腹外側(cè)網(wǎng)狀核(rostral ventrolateral medulla,RVLM)。詳見圖3。

2.4 各組大鼠MVZ中CHAT/Caspase-3免疫熒光雙標(biāo)表達(dá)情況

與對(duì)照組比較,膿毒癥各組CHAT表達(dá)有降低的趨勢(shì),與MLA組比較,GTS-21組有升高CHAT表達(dá)的趨勢(shì);膿毒癥各組Caspase-3表達(dá)升高。提示炎癥可使膽堿能神經(jīng)元凋亡,但對(duì)CHAT表達(dá)無明顯影響,惡化的炎癥可導(dǎo)致CHAT表達(dá)降低。詳見圖4。各組CHAT/Caspase-3 表達(dá)比較見圖5。

圖4 各組代表性的熒光雙標(biāo)圖像及融合圖(200倍)

圖5 各組CHAT/Caspase-3 表達(dá)比較的柱狀圖

3 討 論

系統(tǒng)性炎癥及免疫的紊亂與異常行為學(xué)之間具有復(fù)雜的交互關(guān)系,如抑郁癥病人可表現(xiàn)出不同特征的免疫表型,抗抑郁藥具有抗炎作用,而抗炎藥物也顯示出抗抑郁作用[19]。此外,研究證實(shí):系統(tǒng)性炎癥除導(dǎo)致血清細(xì)胞因子升高外,還導(dǎo)致延髓背側(cè)炎癥標(biāo)志物升高,提示延髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活,并與較高的MSS評(píng)分有關(guān)[20-21]。表明膿毒癥誘發(fā)的炎癥風(fēng)暴影響了大鼠行為學(xué),MSS評(píng)分的升高可能與MVZ神經(jīng)炎癥具有密切的關(guān)系。

MVZ中膽堿能神經(jīng)元主要位于孤束核及迷走背側(cè)運(yùn)動(dòng)核,分別是迷走神經(jīng)的傳入和傳出的初級(jí)中樞,感受并調(diào)節(jié)系統(tǒng)性炎癥強(qiáng)度。研究證實(shí):外周迷走神經(jīng)的刺激能抑制神經(jīng)炎癥,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[22]。經(jīng)皮迷走神經(jīng)刺激有效降低脂多糖誘導(dǎo)的血清TNF-α水平,同時(shí)促進(jìn)MVZ的重要核團(tuán)如孤束核和迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核中CHAT表達(dá),阻礙小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,改善認(rèn)知功能[23],表明CAP的激活除可抑制系統(tǒng)性炎癥外,還可通過改善MVZ的病理和功能而增強(qiáng)認(rèn)知功能。

膿毒癥可導(dǎo)致中樞促炎細(xì)胞因子的升高及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[24],通過激活線粒體凋亡途徑,導(dǎo)致Caspase-3 表達(dá)增高和功能神經(jīng)元的凋亡[25-26];研究證實(shí):激活α7nAChRs可減少促炎性M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,增加抗炎M2表型的細(xì)胞數(shù)量[27]、減輕神經(jīng)元的凋亡和腦組織損傷[28]。本研究中,模型組大鼠MVZ的膽堿能神經(jīng)元明顯凋亡,但CHAT表達(dá)并未明顯減少,表明膽堿能神經(jīng)元與神經(jīng)環(huán)路具有一定的補(bǔ)償機(jī)制[29-30],從而在膿毒癥中維持對(duì)炎癥的穩(wěn)定調(diào)節(jié)。GTS-21通過激活中樞α7nAChRs而抑制了神經(jīng)炎癥,減少了膽堿能神經(jīng)元的凋亡;MLA則相反。上述研究表明,膿毒癥導(dǎo)致MVZ膽堿能神經(jīng)元凋亡,功能水平低下,并進(jìn)一步導(dǎo)致 CAP對(duì)系統(tǒng)性炎癥的負(fù)向調(diào)控作用減弱,可能是系統(tǒng)性炎癥失控的中樞機(jī)制,干預(yù)CAP對(duì)MVZ神經(jīng)炎癥和系統(tǒng)性炎癥具有重要的影響。

神經(jīng)炎癥對(duì)行為學(xué)具有顯著影響[31]。膿毒癥呼吸功能損壞與延髓的早期炎癥反應(yīng)有關(guān),與脂多糖的濃度和損害時(shí)長(zhǎng)具有一定的關(guān)系[32],無菌性炎癥誘導(dǎo)的嘆息樣呼吸與孤束核的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活與IL-1表達(dá)增加有關(guān)[33]。作為低位中樞的MVZ神經(jīng)炎癥對(duì)高級(jí)行為學(xué)的影響,可能在于:1)中樞膽堿能系統(tǒng)和杏仁核對(duì)于動(dòng)機(jī)和記憶等行為具有重要的調(diào)節(jié)作用,腦干內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的激活可導(dǎo)致中央外側(cè)杏仁核活動(dòng)的短暫增加,從而調(diào)整情緒記憶等相關(guān)行為[34]。2)MVZ兒茶酚胺能神經(jīng)元能將炎癥信息傳遞給中央杏仁核,神經(jīng)炎癥可誘導(dǎo)基底外側(cè)杏仁核投射神經(jīng)元的突觸和非突觸傳遞的失調(diào),從而導(dǎo)致焦慮和抑郁樣行為[35],杏仁核的功能改變可能與膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠情緒低下、恐懼、躁動(dòng)、反應(yīng)遲鈍等有關(guān)。3)MVZ神經(jīng)元也投射到基底前腦,基底前腦膽堿能系統(tǒng)廣泛地投射到整個(gè)皮層,調(diào)節(jié)皮層功能、行為喚醒和注意力[36-37]。這些神經(jīng)元可劃分為爆發(fā)性放電膽堿能神經(jīng)元和常態(tài)化放電的膽堿能神經(jīng)元,前者與激勵(lì)和懲罰機(jī)制相關(guān),后者與行為后果相關(guān),兩種基底前腦膽堿能神經(jīng)元類型的差異化募集會(huì)產(chǎn)生行為特異性的皮質(zhì)激活[38],從而導(dǎo)致不同的高級(jí)智能行為反應(yīng)?？梢?MVZ的功能和結(jié)構(gòu)的改變,勢(shì)必通過杏仁核、基底前腦-前腦等神經(jīng)投射從而影響意識(shí)狀態(tài)及行為反應(yīng)等高級(jí)神經(jīng)功能。

前腦M1型膽堿能神經(jīng)元也可激活MVZ的膽堿能神經(jīng)元,通過CAP進(jìn)一步抑制系統(tǒng)性炎癥[39]。因此,MVZ的炎癥及膽堿能神經(jīng)元的凋亡,通過MVZ-基底前腦-前腦-MVZ等神經(jīng)環(huán)路的影響,將進(jìn)一步加劇系統(tǒng)性炎癥風(fēng)暴,與膿毒癥早期失控的炎癥有關(guān),因此,阻斷MVZ的神經(jīng)炎癥,恢復(fù)MVZ膽堿能神經(jīng)元對(duì)系統(tǒng)性炎癥調(diào)控功能和向杏仁核,基底前腦等投射功能的正常,及時(shí)打斷炎癥的初級(jí)中樞和高級(jí)調(diào)控的異常環(huán)路調(diào)節(jié),對(duì)于控制系統(tǒng)性炎癥風(fēng)暴和異常行為學(xué)具有重要的理論意義。

MVZ是CAP的調(diào)控中心,其膽堿能神經(jīng)元在調(diào)控系統(tǒng)性炎癥中具有重要作用;同時(shí),MVZ通過杏仁核、基底前腦-前腦的膽堿能系統(tǒng)調(diào)控膿毒癥的行為學(xué)反應(yīng),是膿毒癥病態(tài)行為發(fā)生的重要機(jī)制之一;通過CAP的干預(yù)來調(diào)控MVZ神經(jīng)炎癥可能成為控制系統(tǒng)性炎癥風(fēng)暴、恢復(fù)膿毒癥異常行為學(xué)表現(xiàn)的重要靶點(diǎn)。