血管外膜細(xì)胞鈣化及其鈣化機(jī)制研究

譚小青,張旭升,樊小容,黃戰(zhàn)軍

血管鈣化常見(jiàn)于動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常、高血壓、糖尿病、慢性腎病及衰老等人群[1],血管鈣化引起血管硬度增加、順應(yīng)性降低,導(dǎo)致心肌缺血、心力衰竭、血栓形成等,增加腦卒中、心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂等的風(fēng)險(xiǎn),被認(rèn)為是影響心血管疾病的重要因素之一[2-4]。目前關(guān)于血管內(nèi)膜、中膜和心臟瓣膜鈣化的關(guān)注和研究相對(duì)較多。臨床工作中發(fā)現(xiàn),血管外膜也可發(fā)生鈣化,然而調(diào)查發(fā)現(xiàn),現(xiàn)階段對(duì)血管外膜鈣化的關(guān)注較少,因此,需要更多的研究來(lái)闡明血管鈣化的致病機(jī)制。最初血管鈣化被認(rèn)為是被動(dòng)和退行性病變,標(biāo)志著血管老化,但是越來(lái)越多研究表明血管鈣化是類(lèi)似于胚胎骨形成的病理生物學(xué)過(guò)程[5-6]。Bostr?m等[7-8]研究發(fā)現(xiàn),鈣化過(guò)程中大鼠血管中膜細(xì)胞由原有收縮表型轉(zhuǎn)變成為成骨樣細(xì)胞表型,原有的收縮標(biāo)志物如平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)等表達(dá)減少,并表達(dá)核心結(jié)合因子α1(Runx2)、骨形態(tài)生成蛋白2(BMP2)等多種成骨樣標(biāo)志物,從而介導(dǎo)骨基質(zhì)在血管中沉積。細(xì)胞凋亡與自噬為2種細(xì)胞死亡的方式,與血管鈣化息息相關(guān),研究表明,血管中膜細(xì)胞在細(xì)胞凋亡過(guò)程中釋放凋亡小體,促進(jìn)細(xì)胞鈣化,而細(xì)胞自噬通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞鈣化[9-10]。本研究對(duì)大鼠血管外膜細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)鈣化,建立大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化模型,并檢測(cè)鈣化過(guò)程中成骨相關(guān)指標(biāo)及凋亡、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,旨在為心血管疾病模型提供更精確的細(xì)胞模型,并初步探討其鈣化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清(FBS,Gibco),青霉素,鏈霉素(Gibco,美國(guó)),茜素紅S溶液,β-甘油磷酸,抗壞血酸,地塞米松(Sigma,美國(guó)),抗GAPDH抗體(Bioworld),抗Bcl-2,Bax, Bcelin1和微血管相關(guān)蛋白(LC3)抗體(CST), 堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒、鈣(Ca)檢測(cè)試劑盒(南京建城生物工程研究所)。

1.2 大鼠血管外膜細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取10只4～6周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠(體質(zhì)量120～180 g)胸主動(dòng)脈分離血管外膜,采用組織黏附法培養(yǎng)。使用添加10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco dmem) 在37 ℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞增殖至80%～90%融合時(shí),用0.25%胰酶消化傳代。使用第3代至第6代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 體外鈣化模型的建立

鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清,10 mmol/L β-甘油磷酸鈉,0.05 mmol/L 抗壞血酸和100 mmol/L 地塞米松的高糖DMEM 培養(yǎng)液。將第3代至第6代細(xì)胞分為對(duì)照組和鈣化組,待細(xì)胞長(zhǎng)至50%融合時(shí),使用鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng),每3 d更換1次培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)15 d。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)酶活測(cè)定

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)后,棄去培養(yǎng)基, 1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗細(xì)胞3次, 加入裂解液 500 μL(1%TritonX-100),冰上裂解 40 min后,離心,取上清液。使用上清液根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ALP活性及總蛋白含量。

1.5 細(xì)胞內(nèi)鈣含量檢測(cè)

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)后,棄去培養(yǎng)基, 1×PBS洗細(xì)胞3次,每孔加入500 μL 0.6 mol/L的鹽酸4 ℃脫鈣過(guò)夜,取上清,根據(jù)鈣測(cè)試試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)鈣含量。將脫鈣后的細(xì)胞用 4 ℃ PBS 洗 3 次,每孔加入 500 μL NaOH/0.1%SDS 裂解細(xì)胞,取上清,用二喹啉甲酸法(BCA)測(cè)定細(xì)胞蛋白含量。

1.6 茜素紅S染色

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)15 d,棄去培養(yǎng)基, 1×PBS洗細(xì)胞3次,加入0.5 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min, 用雙蒸水洗3次, 加入1 mL 0.1%茜素紅室溫孵育15 min, 吸去染液, 雙蒸水洗3次,在倒置顯微鏡下觀察。

1.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)后,棄去培養(yǎng)基, 1×PBS洗細(xì)胞3次,使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA,使用PrimeScripTMRT reagent Kit 將所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,以cDNA為模板, 通過(guò)SYBR Green I嵌合熒光定量RT-PCR檢測(cè)BMP-2、Runx2和GAPDH的表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)

細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)15 d,棄去培養(yǎng)基,1×PBS洗細(xì)胞3次,提取細(xì)胞總蛋白。使用12% SDS-PAGE膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,封閉后,加入一抗(Bax 1∶1 000,Bcl-2 1∶1 000,Beclin1 1∶1 000,LC3 1∶1 000,GAPDH 1:1 000)稀釋液,4 ℃孵育過(guò)夜;加入二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h后,使用ECL發(fā)光試劑盒顯影并計(jì)算灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血管外膜細(xì)胞可在體外被誘導(dǎo)鈣化

為驗(yàn)證高磷是否能誘導(dǎo)大鼠血管外膜細(xì)胞鈣化,使用鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)ALP活性和胞內(nèi)鈣含量。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),ALP活性逐漸上升,在培養(yǎng)第12天達(dá)到峰值,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);誘導(dǎo)第3天開(kāi)始所測(cè)得的胞內(nèi)鈣含量與對(duì)照組比較升高(P<0.05),ALP活性和鈣含量升高具有時(shí)間依賴(lài)性。詳見(jiàn)圖1、圖2。誘導(dǎo)15 d所測(cè)得鈣含量最高,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的誘導(dǎo)時(shí)間為15 d。對(duì)鈣化誘導(dǎo)15 d的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅S染色,結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,而鈣化組細(xì)胞變成菱形。茜素紅S染色后,鈣化組可觀察到大量的橘紅色鈣結(jié)節(jié)(見(jiàn)圖3),而對(duì)照組完全沒(méi)有。這也證明大鼠血管外膜細(xì)胞可在體外被鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化。

圖1 鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)外膜細(xì)胞后ALP含量

圖2 鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)外膜細(xì)胞后胞內(nèi)鈣含量

圖3 培養(yǎng)15 d時(shí)細(xì)胞經(jīng)茜素S紅染色切片圖(×100)

2.2 血管外膜細(xì)胞鈣化與細(xì)胞向成骨樣表型轉(zhuǎn)化有關(guān)

血管鈣化的增加與成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物如BMP2、和Runx2的增加有關(guān)[11]。RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,鈣化組的成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物BMP2和Runx2 mRNA表達(dá)量增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 外膜細(xì)胞鈣化過(guò)程中BMP2和Runx2 mRNA表達(dá)量

2.3 血管外膜細(xì)胞鈣化過(guò)程涉及細(xì)胞自噬及凋亡調(diào)控

通過(guò)Western Blot檢測(cè)凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化。與對(duì)照組比較,鈣化組促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào),抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5。鈣化組自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)上調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例上調(diào)(P<0.05),說(shuō)明鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)凋亡水平上調(diào)、自噬水平升高。詳見(jiàn)圖6。

圖5 誘導(dǎo)鈣化后促凋亡蛋白及抑凋亡蛋白表達(dá)變化

圖6 誘導(dǎo)鈣化后凋亡及自噬蛋白Beclin1等表達(dá)變化

3 討 論

血管鈣化作為心血管疾病病人的并發(fā)癥之一,其發(fā)病率與嚴(yán)重程度逐年增高及加重,是導(dǎo)致心血管疾病病人高死亡率的重要因素。血管鈣化缺乏有效的治療藥物。因此,探究血管鈣化發(fā)病機(jī)制,在分子水平尋找有效的診斷和防治靶點(diǎn)是急需開(kāi)展的基礎(chǔ)研究工作。本研究證明,使用10 mmol/L β-甘油磷酸+0.05 mmol/L 抗壞血酸+100 mmol/L 地塞米松培養(yǎng)外膜細(xì)胞即可誘導(dǎo)大鼠血管外膜細(xì)胞在體外發(fā)生鈣化,這是通過(guò)茜素紅S染色、ALP活性檢測(cè)及胞內(nèi)鈣含量檢測(cè)結(jié)果得以確定的。

血管鈣化過(guò)程中,血管中膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變并表達(dá)相關(guān)成骨標(biāo)志物,從而引起骨基質(zhì)的沉積,是血管鈣化的重要特點(diǎn)及機(jī)制[5]。本實(shí)驗(yàn)所用的血管外膜細(xì)胞鈣化條件與血管中膜細(xì)胞鈣化條件一致,說(shuō)明血管外膜細(xì)胞鈣化的機(jī)制可能與中膜細(xì)胞鈣化的機(jī)制部分一致。血管中膜細(xì)胞鈣化過(guò)程中,細(xì)胞表達(dá)成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如Runx2等,進(jìn)而促進(jìn)下游表達(dá)骨相關(guān)蛋白如骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2等的表達(dá),從而促使細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞主動(dòng)分化[12-13],本研究也觀察到類(lèi)似的機(jī)制。通過(guò)PT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠血管外膜細(xì)胞15 d后,BMP2和Runx2的mRNA表達(dá)水平升高。本研究通過(guò)對(duì)鈣鹽沉積與成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變2個(gè)維度的探討,證明血管外膜細(xì)胞可在體外被誘導(dǎo)鈣化,豐富了血管鈣化的分型。

血管鈣化的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,涉及多種信號(hào)通路,如細(xì)胞自噬和凋亡、Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均參與調(diào)控血管鈣化的過(guò)程。自噬作為一種細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng),在維持血管結(jié)構(gòu)與功能中十分關(guān)鍵。研究表明,血管鈣化過(guò)程中自噬水平增高[14-15]。在體外實(shí)驗(yàn)中,高磷可提高大鼠血管中膜細(xì)胞的自噬水平,增加細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量,從而抑制凋亡與鈣化[16]。還有研究表明,自噬可通過(guò)抑制大鼠血管中膜細(xì)胞氧化應(yīng)激,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),對(duì)三酰甘油等脂代謝進(jìn)行調(diào)控,從而減輕血管鈣化[17-18]。LC3和Beclin1是2種典型的自噬標(biāo)志物,Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)大鼠血管外膜細(xì)胞15 d, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率升高, Beclin1蛋白水平表達(dá)升高,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高。

多項(xiàng)研究表明,細(xì)胞凋亡參與促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生,抑制細(xì)胞凋亡和抑制鈣化[16 -17]。在對(duì)大鼠的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控Caspase-12 信號(hào)通路來(lái)減少血管內(nèi)中膜細(xì)胞凋亡,從而抑制血管鈣化[18]。另外,提高培養(yǎng)基中的Pi或Ca2+濃度,可誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜形成并釋放基質(zhì)囊泡(如凋亡小體),從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)鈣化,這種基質(zhì)鈣化可能成為血管鈣化的成核位點(diǎn)[19]。Bax和Bcl-2是2種典型的凋亡和抑制凋亡蛋白,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,利用鈣化培養(yǎng)基對(duì)血管外膜細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)凋亡水平升高。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)自噬水平也升高,這可能是細(xì)胞自我調(diào)控以對(duì)抗鈣化的結(jié)果。

本研究證實(shí)血管外膜細(xì)胞可在體外被誘導(dǎo)鈣化,且外膜鈣化過(guò)程與骨組織鈣化過(guò)程類(lèi)似,為主動(dòng)可調(diào)控的過(guò)程。血管鈣化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及細(xì)胞凋亡和自噬等調(diào)控通路,仍需進(jìn)一步研究。