兩種玉竹根莖顯微形態(tài)及同工酶譜帶比對(duì)研究

吳杰，寧偉

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110161）

玉竹[Polygonatum odoratum(Mill.)Druce]為百合科黃精屬多年生草本植物，其根莖的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)。玉竹性微寒，味甘，有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、生津止渴之功效[1-3]。據(jù)現(xiàn)代藥理研究，玉竹中主要化學(xué)成分為多糖類化合物，玉竹具有提高人體免疫力、強(qiáng)心、降血脂、降血糖及延長(zhǎng)動(dòng)物壽命等作用[4-6]。在我國(guó)玉竹主要有南北兩大產(chǎn)區(qū)[7]，本研究選擇北方遼寧省寬甸縣主產(chǎn)區(qū)的寬甸玉竹和湖南新邵縣玉竹藥材基地主產(chǎn)區(qū)的邵縣玉竹為實(shí)驗(yàn)材料，具有栽培藥材的道地代表性?，F(xiàn)對(duì)兩類玉竹品種的顯微結(jié)構(gòu)和POD 同工酶譜帶進(jìn)行比對(duì)，分析寬甸玉竹與邵縣玉竹顯微結(jié)構(gòu)和POD同工酶譜帶差異，進(jìn)而來區(qū)分南北玉竹結(jié)構(gòu)差異及遺傳特性，為進(jìn)一步開發(fā)利用玉竹資源奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步開發(fā)玉竹成分提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 主要儀器

試驗(yàn)儀器為OLYMPUS 臺(tái)式顯微鏡（BH 型，日本奧林巴斯），高速冰凍離心機(jī)（TGL-16EI，山東博科），電泳儀（DYCZ-24DN型，北京六一），垂直平板電泳槽（JY-SCZ2 型，北京六一），40 W日光燈具一套（上海燈具廠），酸度計(jì)（上海儀器儀表有限公司），Brand 移液器（德國(guó)普蘭德）等。

1.2 材料與藥品

1.2.1 材料 寬甸玉竹新鮮根莖來源于遼寧省丹東市寬甸縣玉竹生產(chǎn)基地，稱為寬甸玉竹（屬于關(guān)玉竹中一種）；邵縣玉竹新鮮根莖來源于湖南新邵縣玉竹藥材基地，稱為邵縣玉竹（屬于湘玉竹中一種）；兩種中藥玉竹均為市場(chǎng)常見藥材，具有藥材可比性。

1.2.2 藥品 FAA 固定液（50%～70%酒精90 mL，37%～40%甲醛水溶液5 mL，冰醋酸5 mL）；二甲苯、酒精、石蠟（48～50 ℃）、明膠、染色液0.5%～1%的番紅酒精（70%酒精）+0.1%～0.2%的固綠酒精（95%酒精）、加拿大樹膠、5 mol/L磷酸緩沖液、Tris、四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、核黃素、鹽酸、甘氨酸、聯(lián)苯胺、醋酸、EDTA-Na、氯化銨、雙氧水（以上試劑均為分析試劑，購(gòu)自沈陽國(guó)藥）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖石蠟切片觀察

試驗(yàn)取材為寬甸玉竹與邵縣玉竹1 年生新鮮根莖進(jìn)行石蠟切片觀察。利用常規(guī)石蠟切片與番紅－固綠對(duì)染法，其步驟為固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→粘片→脫蠟→復(fù)水→番紅、固綠染色→封藏。切片厚度為10μm，用加拿大樹膠封片，BH 型OLYMPUS 顯微鏡觀察并照相[8]。

2.2 寬甸玉竹與邵縣玉竹POD同工酶檢測(cè)

2.2.1 酶液的制備 將采收的寬甸玉竹根莖與購(gòu)買的邵縣玉竹新鮮根莖用蒸餾水洗凈并吸干水分，各稱取0.5 g 根莖于研缽中，用0.5×10-2mol/L 磷酸緩沖液pH 7.8 在冰浴中研磨勻漿，并定容至5 mL，在4 ℃下以13 000 g 離心20 min，取上清液即為酶粗提液。

2.2.2 電泳 采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10%（pH 8.9），濃縮膠濃度（pH 6.7），電極緩沖液為pH 8.3 的Tris 每孔點(diǎn)樣量為40μL，加入2 滴溴酚藍(lán)指示電泳前沿。于4 ℃冰箱內(nèi)恒壓電泳，濃縮膠中為112V，待指示劑進(jìn)入分離膠后增大至210V，電泳約需4 h。

2.2.3 染色 過氧化物同工酶染色用醋酸 聯(lián)苯胺染色法染色。經(jīng)染色膠版上出現(xiàn)棕褐色清晰酶帶，用蒸餾水漂洗后置7.5%冰醋酸中脫色、固定、照相和作圖。按Rf=酶帶遷移距離/指示劑遷移距離記錄Rf 值。并利用SPSS 19.1.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[6]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 玉竹形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

從寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖的表面形態(tài)學(xué)觀察可以看出，新鮮的寬甸玉竹根莖相對(duì)較細(xì)且顏色為白色，而邵縣玉竹根莖較粗且顏色為棕黃色。寬甸玉竹與邵縣玉竹的根莖均為圓柱形，且有分支，但寬甸玉竹的表面玉白色或淡白色，直徑均值為0.5～1.6 cm，節(jié)明顯，節(jié)間距平均值為3.5～9.6 cm，而邵縣玉竹直徑均值為1.2～4.7 cm，節(jié)明顯，節(jié)間距平均值為5.3～11.4 cm。一般寬甸玉竹根莖比邵縣玉竹根莖細(xì)小，且寬甸玉竹顏色較淺，分支較邵縣玉竹的多且粗，多呈分支狀，而邵縣玉竹的多為須根狀，見圖1。

圖1 寬甸玉竹和邵縣玉竹1～3 年生根莖比對(duì)圖Fig.1 Comparison of 1～3 year roots and stems of Kuandian and Shaoxian

3.2 玉竹根莖的石蠟切片觀察

3.2.1 玉竹根莖石蠟切片結(jié)果 基于寬甸玉竹與邵縣玉竹形態(tài)學(xué)的明顯差異，進(jìn)一步對(duì)其顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，石蠟切片觀察結(jié)果表明，寬甸玉竹的表皮厚度平均為2.24×10-2mm；薄壁組織厚度平均為8.69×10-2mm；微管組織厚度平均為1.561mm；邵縣玉竹的表皮厚度平均為3.85×10-2mm；薄壁組織厚度平均為5.36×10-2mm；微管組織厚度平均為3.114 mm，見圖2。

圖2 寬甸玉竹和邵縣玉竹根莖石蠟切片橫縱切面Fig.2 Transverse and longitudinal section of paraffin section of rhizome of Kuandian and Shaoxian

試驗(yàn)基于寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖形態(tài)學(xué)存在很大差異的基礎(chǔ)上，對(duì)寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)石蠟切片的觀察，目的是為了觀察確定寬甸玉竹與邵縣玉竹的形成層主要結(jié)構(gòu)，分為表皮、薄壁組織和微管組織，寬甸玉竹與邵縣玉竹的新鮮根莖的主要顯微形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)基本一致，這與寬甸玉竹和邵縣玉竹的本身生長(zhǎng)特性相符合。

3.2.2 玉竹根莖石蠟切片顯著性分析 由上述玉竹新鮮根莖石蠟切片觀察測(cè)定結(jié)果進(jìn)行寬甸玉竹與邵縣玉竹種間的表皮、薄壁組織和微管組織進(jìn)行差異顯著性的方差分析，進(jìn)一步為判斷寬甸玉竹與邵縣玉竹種間的差異顯著性提供可靠依據(jù)，其方差分析結(jié)果表明，寬甸玉竹與邵縣玉竹種間石蠟切片結(jié)構(gòu)表皮、薄壁組織和微管組織結(jié)構(gòu)間均存在顯著差異，見表1。

表1 寬甸玉竹與邵縣玉竹石蠟切片結(jié)構(gòu)方差分析Table 1 Anova of paraffin section structure of Kuandian and Shaoxian

表1 寬甸玉竹與邵縣玉竹石蠟切片結(jié)構(gòu)方差分析Table 1 Anova of paraffin section structure of Kuandian and Shaoxian

注：**代表極顯著差異。Note:**Represents a very significant difference.

3.3 玉竹POD同工酶譜帶分析

試驗(yàn)基于對(duì)寬甸玉竹與邵縣玉竹根莖形態(tài)學(xué)和顯微結(jié)構(gòu)觀察的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其POD 同工酶電泳譜帶進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到區(qū)分鑒定寬甸玉竹與邵縣玉竹分類學(xué)地位的目的，其POD 譜帶，見圖3。

圖3 寬甸玉竹與邵縣玉竹POD 同工酶電泳譜帶及模式圖Fig.3 POD isozyme electrophoretic bands and patterns of Kuandian and Shaoxian

由圖3 可以看出，寬甸玉竹與邵縣玉竹的過氧化物同工酶譜帶從負(fù)極到正極共分離出4 條譜帶，且所有譜帶的Rf 值都小于0.5。寬甸玉竹與邵縣玉竹過氧化物（POD）同工酶譜帶相似度達(dá)80%以上，但是寬甸玉竹的過氧化物同工酶譜帶在Rf=0.03 與Rf=0.16時(shí)譜帶顏色很淺淡，而相同Rf 值時(shí)邵縣玉竹譜帶顏色很深，說明寬甸玉竹中的某些蛋白含量低于邵縣玉竹。

4 討論

4.1 寬甸玉竹與邵縣玉竹顯微結(jié)構(gòu)區(qū)別顯著

在《中國(guó)植物志》上描述玉竹，分布于歐亞大陸的溫帶，變異甚大，葉下面脈上和花絲均可平滑至具乳頭狀突起，不同作者對(duì)不同類型曾給予不同等級(jí)的名稱，由于對(duì)它的變異規(guī)律尚未十分掌握，我們?cè)谥参镏局?，?duì)它的種下等級(jí)不再細(xì)分[10-15]。本研究采用具有南北區(qū)域代表性的寬甸玉竹（屬于關(guān)玉竹中的一種）和邵縣玉竹（屬于湘玉竹中一種），且這兩種玉竹均是大量銷售于河北安國(guó)和安徽亳州的主要玉竹品種。因此，本研究受藥材企業(yè)委托，將這南北兩大主產(chǎn)區(qū)中藥玉竹根莖進(jìn)行比對(duì)研究，我們跟蹤3 年，分別采集1 年生、2年生和3 年生玉竹根莖進(jìn)行形態(tài)學(xué)比對(duì)，并進(jìn)行同工酶圖譜比對(duì)。針對(duì)《中國(guó)植物志》中玉竹種屬分類問題的混淆，我們主要開展以藥產(chǎn)地為依托的中藥材形態(tài)學(xué)比對(duì)工作，因此可忽略中間分類問題的混淆。本試驗(yàn)對(duì)寬甸玉竹與邵縣玉竹形態(tài)學(xué)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明新鮮的寬甸玉竹根莖相對(duì)較細(xì)且顏色為白色，而邵縣玉竹根莖較粗且顏色為棕黃色。寬甸玉竹與邵縣玉竹的根莖均為圓柱形，且有分支。但寬甸玉竹直徑均值為0.5～1.6 cm，節(jié)明顯，節(jié)間距平均值為3.5～9.6 cm；邵縣玉竹直徑均值為1.2～4.7 cm，節(jié)明顯，節(jié)間距平均值為5.3～11.4 cm。

本研究在對(duì)寬甸玉竹和邵縣玉竹新鮮根莖橫切面和縱切面石蠟切片觀察的基礎(chǔ)上進(jìn)行其顯微結(jié)構(gòu)分析鑒定，結(jié)果顯示寬甸玉竹與邵縣玉竹的切片結(jié)構(gòu)一致，均有表皮、薄壁組織和微管組織組成。結(jié)果表明，寬甸玉竹的表皮和薄壁組織結(jié)構(gòu)比邵縣玉竹的厚且相對(duì)疏松，而微管組織比邵縣玉竹的薄且致密，且均存在極顯著差異，這主要是由于寬甸玉竹與邵縣玉竹的種間差異和生長(zhǎng)環(huán)境條件不同所導(dǎo)致的。邵縣玉竹相對(duì)于寬甸玉竹而言，其結(jié)構(gòu)微管組織相對(duì)較厚，且組織細(xì)胞較密，細(xì)胞間隙相對(duì)較小，這也符合邵縣玉竹比寬甸玉竹粗壯堅(jiān)硬的特性[16-18]。

4.2 寬甸玉竹與邵縣玉竹同工酶譜帶比對(duì)

由于寬甸玉竹與邵縣玉竹在形態(tài)上就存在著一些差異，且同工酶是編碼基因不同而產(chǎn)生的多種分子結(jié)構(gòu)的酶，基因的微小變化都會(huì)引起同工酶的變化[19,20]。因此，可從同工酶譜的變化及酶譜特征了解品種間的種間差異，但僅憑同工酶圖譜尚無法證明其種間親緣關(guān)系。應(yīng)該綜合考慮AFLP、SSR、ISSR 和PARD 等分子標(biāo)記研究結(jié)果，來進(jìn)行玉竹種間親緣關(guān)系鑒定。本試驗(yàn)說明了寬甸玉竹與邵縣玉竹之間的品種，屬于同一種屬植物，存在的差異為種內(nèi)遺傳多樣性差異。

本研究對(duì)于寬甸玉竹與邵縣玉竹的石蠟切片顯微結(jié)構(gòu)觀察和POD 同工酶電泳譜帶分析技術(shù)進(jìn)行分類學(xué)地位鑒定，并確定二者之間的親緣關(guān)系，得出寬甸玉竹與邵縣玉竹為同一種屬植物但存在一定的種內(nèi)差異。這主要因?yàn)閷挼橛裰衽c邵縣玉竹生長(zhǎng)產(chǎn)地的地域性差距形成了不同的生態(tài)居群，環(huán)境原因是造成寬甸玉竹與邵縣玉竹形態(tài)結(jié)構(gòu)及同工酶電泳譜帶不同的根本原因。本研究為中藥玉竹產(chǎn)地分類提供理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開發(fā)利用中藥玉竹資源提供理論依據(jù)。