大白菜番茄紅素β-環(huán)化酶基因BrLCYB的鑒定與功能分析

李必元,岳智臣,趙彥婷,雷娟利,胡齊贊,陶 鵬

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)

類胡蘿卜素(carotenoids)是一類重要的類萜類化合物的總稱, 廣泛存在于高等植物、真菌、藻類以及部分細菌中的黃色、橙紅色或紅色的色素之中,在許多生物體中發(fā)揮著重要的生物學功能[1]。類胡蘿卜素主要分成胡蘿卜素和葉黃素兩大類,從胡蘿卜素向下游葉黃素合成過程中,番茄紅素的環(huán)化是一個關鍵步驟,主要由番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopeneβ-cyclase, LCYB)和番茄紅素ε-環(huán)化酶(lycopene ε-cyclase, LCYE)完成,分別形成γ-胡蘿卜素和δ-胡蘿卜素,在LCYB的催化下進一步生成β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素[2]。LCYB是類胡蘿卜素代謝途徑中的關鍵酶,也是基因工程改良植物類胡蘿卜素含量的重要靶點[3]。

大白菜的花色變異和球內(nèi)葉顏色變異豐富,且很多與類胡蘿卜素的積累有關[4-5],因此,研究番茄紅素β-環(huán)化酶對于白菜類胡蘿卜素代謝十分重要。此外,大白菜相對于擬南芥,是經(jīng)過三倍化的,在大白菜中是否存在多個番茄紅素β-環(huán)化酶基因,其功能如何?并不是很清楚。本研究鑒定了大白菜的BrLCYB基因,分析了其基因表達與進化及其基因功能。為將來更好地開發(fā)利用大白菜LCYB功能基因,為大白菜類胡蘿卜素代謝育種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 大白菜材料與DNA

大白菜He2高代自交系由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所大白菜甘藍研究室選育而成。種植大白菜He2材料,采用Ezup 柱式植物基因組 DNA 抽提試劑盒(上海生工)提取其葉片DNA。采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(上海生工)提取葉片的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。大白菜He2生長至開花時,對花瓣取樣3次,提取樣品總RNA并進行檢測,構(gòu)建文庫,在Illumina平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序工作由百邁客公司完成。

1.2 大白菜BrLCYB的克隆與鑒定

設計BrLCYB基因的引物(表1),使用引物對白菜葉片的DNA和cDNA進行PCR,并電泳。然后送樣測序。使用轉(zhuǎn)錄組測序文庫中的測序片段,進行拼接獲得BrLCYB基因的編碼序列和5′UTR和3′UTR。參考白菜基因組序列,分析BrLCYB的內(nèi)含子情況,并繪制BrLCYB基因的組織結(jié)構(gòu)和剪接異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。

表1 本研究中所使用的引物/檢索序列

為分析剪接異構(gòu)體BrLCYB-1和BrLCYB-2所占的比例,分別使用檢索序列BrLCYB-1S和BrLCYB-2S(表1)在轉(zhuǎn)錄組測序片段文庫進行檢索,獲得上述兩種類型的測序片段數(shù)量,統(tǒng)計每種剪接異構(gòu)體占總的BrLCYB測序片段數(shù)量的百分比。

1.3 BrLCYB轉(zhuǎn)錄表達分析

白菜全基因組已完成測序,大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也已公開。在BRAD數(shù)據(jù)庫中下載獲得不同組織器官中的表達數(shù)值[6]。在公開發(fā)表的文獻中下載白菜胚胎發(fā)育過程中的表達數(shù)據(jù)[7],為使得兩者數(shù)據(jù)均一化,使用β-actin的基因表達作為內(nèi)參,獲得BrLCYB相對表達數(shù)據(jù),使用Excel作圖。

1.4 LCYB系統(tǒng)進化分析

從Ensembl Bacteria(http://bacteria.ensembl.org/index.html)和Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)分別下載藍藻、紅藻、綠藻、低等植物和高等植物的LCYB蛋白序列,同時,記錄每個LCYB基因在編碼序列中的內(nèi)含子數(shù)量。使用Mega7.0軟件采用最大似然統(tǒng)計法,自展值設置成1 000進行檢驗,采用LG模型構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.5 LCYB原核表達載體的構(gòu)建

以大白菜He2材料的葉片cDNA為模板,使用引物對LCYBF和LCYBR進行PCR擴增獲得包含BrLCYB完整編碼序列的片段。使用NocⅠ和XhoⅠ(上海生工)酶切pET-28a(+)質(zhì)粒,使其線性化,再與上述的BrLCYB編碼序列進行同源重組(TaKaRa)以獲得pET-BrLCYB質(zhì)粒,挑單克隆,測序進行驗證。

pACCRT-EIB質(zhì)粒由日本Misawa研究組授權和鄧秀新院士團隊惠贈,將0.5 μg的pACCRT-EIB與0.5 μg pET-28a(+) 質(zhì)粒同時加入到BL感受態(tài)細胞中,通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21中,加入700 μL的液體LB,200 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h,5 000 r·min-1離心后在30 mg·L-1氯霉素和50 mg·L-1卡那霉素的固體LB中均勻涂布,過夜培養(yǎng)后挑選單菌落。采用上述方法將pACCRT-EIB與pET-BrLCYB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21,在30 mg·L-1氯霉素和50 mg·L-1卡那霉素的固體LB中篩選,挑選單菌落。將含pACCRT-EIB與pET-28a(+) 質(zhì)粒的大腸埃希菌和含pACCRT-EIB與pET-BrLCYB質(zhì)粒的大腸埃希菌在30 mg·L-1氯霉素和50 mg·L-1卡那霉素的固體LB中劃線,觀察兩種大腸埃希菌菌體的顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜LCYB的鑒定與變異分析

使用擬南芥LCYB基因(At3g10230)序列在大白菜參考基因組(Chiifu401)中進行檢索,顯示大白菜Chiifu401中僅有1個BrLCYB基因(BraA05g036 490.3C),定位于LF亞基因組中(表2)。為了解十字花科植物LCYB的拷貝數(shù)和亞基因組的定位情況。通過共線性關系分析顯示,十字花科植物中大部分物種只有1個LCYB。在蕓薹屬中,二倍體物種大白菜、甘藍以及黑芥中均只有1個LCYB基因,均定位于LF亞基因組。而四倍體的甘藍型油菜和芥菜中有兩個LCYB基因,分別定位于蕓薹屬A、B、C基因組的LF亞基因組上。

表2 LCYB基因在蕓薹屬物種中的亞基因組定位和共線性關系

2.2 大白菜BrLCYB的基因結(jié)構(gòu)和選擇性剪接

使用引物對大白菜BrLCYB基因進行PCR克隆,顯示基因組DNA和葉片的cDNA分別作為模板,PCR產(chǎn)物大小相同,顯示其BrLCYB的DNA序列和cDNA序列一致。通過對PCR產(chǎn)物進行測序,結(jié)果顯示,兩者序列完全一致,證實BrLCYB的編碼序列中沒有內(nèi)含子(圖1-A)。

為進一步獲得白菜BrLCYB完全的基因結(jié)構(gòu),使用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的測序片段數(shù)據(jù),分析顯示BrLCYB在編碼序列中不存在內(nèi)含子,但是在轉(zhuǎn)錄本測序片段數(shù)據(jù)中存在著兩種轉(zhuǎn)錄本,一種顯示5′UTR中缺失一段序列,一種與基因組序列完全一致。顯示BrLCYB的5′UTR中保留了內(nèi)含子的序列,該內(nèi)含子擁有典型的“GT-AG”結(jié)構(gòu)(圖1-B)。由于同時存在兩種類型的轉(zhuǎn)錄本,意味著BrLCYB在轉(zhuǎn)錄的過程中存在選擇性剪接。為顯示兩種剪接異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄表達差異,基于RPKM比較了兩種轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示,BrLCYB以內(nèi)含子剪接的轉(zhuǎn)錄本為主,約占BrLCYB轉(zhuǎn)錄本總數(shù)的98.26%(圖1-C)。

2.3 白菜BrLCYB基因的轉(zhuǎn)錄表達

為鑒定白菜中BrLCYB的轉(zhuǎn)錄表達情況,從公共數(shù)據(jù)庫下載轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)。為縮小這種不同實驗條件造成的誤差,本研究使用內(nèi)參基因β-actin對BrLCYB基因的表達進行均一化,研究結(jié)果顯示,BrLCYB基因在檢測的器官中均有表達,其中在花中的表達量最高,在根中的表達量最低。在整個胚胎發(fā)育階段均有表達,其中在成熟的胚胎發(fā)育階段中的表達量相對較高(圖2)。

圖2 BrLCYB基因在不同器官和不同胚胎發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄表達水平Fig.2 The transcriptional expression level of BrLCYB gene in different organs and different embryonic development stages

2.4 LCYB的系統(tǒng)進化發(fā)育分析與基因組織結(jié)構(gòu)分析

為了解LCYB基因的系統(tǒng)進化情況,本研究從數(shù)據(jù)庫中下載獲得包括藍藻、紅藻、綠藻以及高等植物的LCYB蛋白序列。結(jié)果顯示,白菜等其他的高等植物LCYB基因最早起源于原核植物藍藻。通過分析這些物種的LCYB基因的組織結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,從單細胞植物綠色鞭毛藻進化到低等植物衣藻、輪藻、地錢和卷柏,內(nèi)含子出現(xiàn),在萊茵衣藻中達到13個內(nèi)含子,然后在進化中逐步減少,到輪藻、苔蘚和卷柏時,內(nèi)含子只剩余7個。進化到高等植物時,內(nèi)含子已經(jīng)完全丟失(圖3)。

方框中的數(shù)字表示相應物種的LCYB基因編碼序列中內(nèi)含子的數(shù)量。The number of the box representing the number of introns in the coding sequence of LCYB gene of the corresponding specie.圖3 LCYB系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 The LCYB phylogenetic tree

圖4 大白菜He2的BrLCYB蛋白的功能域及其對應的蛋白序列(A)及BrLCYB蛋白的酶活性分析(B)Fig.4 Functional domain of BrLCYB of Chinese cabbage He2 line and its corresponding protein sequence (A) and enzyme activity analysis of BrLCYB (B)

2.5 大白菜He2 BrLCYB蛋白結(jié)構(gòu)及其酶活性的鑒定

BrLCYB的蛋白中包含1個完整的番茄紅素環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域,顯示BrLCYB蛋白具有番茄紅素β-環(huán)化酶的功能。為了證明BrLCYB的蛋白具有催化番茄紅素合成β-胡蘿卜素的功能,利用大腸埃希菌顏色互補實驗可以證明。

質(zhì)粒pACCRT-EIB 中含有來源于噬夏孢歐文細菌(Erwiniauredovora)類胡蘿卜素生物合成途徑上牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫飽和酶基因crtE、crtB和crtI,在大腸埃希菌中表達可以合成和積累番茄紅素,使得菌體呈紅色。為了驗證大白菜BrLCYB的β環(huán)化酶活性,將pACCRT-EIB與pET-BrLCYB進行共轉(zhuǎn)化,結(jié)果大腸埃希菌菌體顏色變成橙色。而對照組pACCRT-EIB與pET-28a(+)共轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌菌體依然為粉紅色。研究結(jié)果顯示,BrLCYB的導入將pACCRT-EIB質(zhì)粒合成的番茄紅素環(huán)化成了橙黃色的β-胡蘿卜素,最終使得pACCRT-EIB與pET-BrLCYB共轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌富集β-胡蘿卜素,通過上述實驗證明了BrLCYB具有番茄紅素β-環(huán)化酶活性(圖3)。

3 結(jié)論與討論

通過共線性和BLAST分析,顯示白菜并未隨著其基因組的三倍化,而導致白菜中LCYB基因成員數(shù)量的擴大,白菜3個亞基因組中只有LF上有一個LCYB基因。作為BB基因組的黑芥和CC基因組的甘藍,兩者同樣只在LF亞基因組上存在唯一的LCYB基因,四倍體甘藍型油菜(AACC)和芥菜型油菜(AABB)同樣只在LF亞基因組存在1個LCYB(表2)。這個結(jié)果暗示,A、B和C基因組的共同祖先中就已在MF1和MF2亞基因組中丟失了LCYB基因。系統(tǒng)樹分析顯示,LCYB基因廣泛分布于藍藻、紅藻、綠藻、低等植物以及高等植物中,這些生物均屬于有氧光合植物,意味著LCYB參與了有氧光合植物的光合作用。類胡蘿卜素是光合系統(tǒng)中捕光天線蛋白復合體中的重要成分,參與捕光等[8]。此外,類胡蘿卜素具有猝滅三線態(tài)葉綠素和清除單線態(tài)氧的功能,從而發(fā)揮光保護作用[9]。LCYB是一個高度保守的功能蛋白,是胡蘿卜素合成向葉黃素合成的關鍵酶,保障了類胡蘿卜素代謝通路的完整性。白菜BrLCYB存在BrLCYB-1和BrLCYB-2兩種類型的轉(zhuǎn)錄本,但由于BrLCYB-2內(nèi)含子保留在5′UTR中,并不會改變其編碼的蛋白序列,其蛋白功能也不會受到影響(圖1)。大量研究發(fā)現(xiàn),一些基因的5′UTR的序列和結(jié)構(gòu)會影響蛋白翻譯效率[10]。此外,在5′UTR的大片段插入/缺失有可能會影響到基因的轉(zhuǎn)錄表達。棉花FAD2-1基因的5′UTR內(nèi)含子具有啟動子活性[11]。白菜BrLCYB的選擇性剪接及其對應的剪接異構(gòu)體的具體生物學意義有待后續(xù)進一步研究。

LCYB基因的內(nèi)含子隨著物種進化發(fā)生了明顯變化。綠藻是高等植物的祖先,在綠藻LCYB的編碼序列對應的區(qū)域中并沒有內(nèi)含子存在,但是到萊茵衣藻、苔蘚、輪藻后卻出現(xiàn)了大量內(nèi)含子,隨后在高等植物中又再次完全丟失(圖3)。前人研究發(fā)現(xiàn),海鏈藻和萊茵衣藻存在大量物種特異的內(nèi)含子位點。這兩個藻類物種首先經(jīng)歷了大量的內(nèi)含子丟失后又在近期獲得了大量的新內(nèi)含子[12]。

pACCRT-EIB質(zhì)粒中包含來自噬夏孢歐文細菌的crtE、crtB和crtI基因,在大腸埃希菌中進行表達,可富集番茄紅素[13]。BrLCYB蛋白中包含了一個完整的番茄紅素β-環(huán)化酶的結(jié)構(gòu),暗示該蛋白可能具有番茄紅素β-環(huán)化酶活性。本研究采用大腸埃希菌體系通過顏色互補對BrLCYB的酶活性進行驗證。以共轉(zhuǎn)化pACCRT-EIB與pET-28a(+)的大腸埃希菌為對照(紅色)。當轉(zhuǎn)化有pACCRT-EIB與pET-BrLCYB到大腸埃希菌中后,pACCRT-EIB合成番茄紅素,在pET-BrLCYB表達的BrLCYB蛋白作用下,番茄紅素環(huán)化生成了橙黃色的β-胡蘿卜素。前人采用顏色互補實驗證實了紅肉臍橙番茄紅素β-環(huán)化酶基因的酶催化活性[14]。張建成等[15]利用大腸埃希菌工程菌體系誘導表達了ChLCYB 蛋白,并證實其可催化工程菌株中番茄紅素向β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化。