雌雄紅螯螯蝦染色體核型比較分析

劉芳芳,陳紅林,劉 峰,許曉軍,黃福勇,樓 寶,錢(qián)豪杰

(1.浙江海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,浙江 舟山 316022; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所,浙江 杭州 310021; 3.浙江省海寧市鴻海養(yǎng)殖有限公司,浙江 海寧 314400)

十足目是甲殼綱中種類最豐富的一個(gè)目,現(xiàn)存物種14 000余種[1],在水環(huán)境中占有重要的生態(tài)位,其中包含的多種蝦蟹類動(dòng)物是我國(guó)經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品種的重要組成部分。染色體核型分析可以揭示染色體數(shù)量、大小和形態(tài)等基礎(chǔ)遺傳信息。分析物種的染色體核型信息是開(kāi)展許多應(yīng)用研究的基本前提,對(duì)了解生物的遺傳組成、遺傳變異規(guī)律、發(fā)育機(jī)制等有重要意義[2]。然而,相較于其他水產(chǎn)動(dòng)物,關(guān)于蝦蟹類動(dòng)物核型的研究相對(duì)較少。這主要是由于十足目動(dòng)物的染色體數(shù)目龐大[3],平均為2n=125[4],許多物種的染色體數(shù)目達(dá)到180條以上,如克氏原螯蝦(Procambarusclarkii,2n=188)[5-6]、日本黑螯蝦(Cambaroidesjaponicus,2n=196)[7]、破壞者螯蝦(Cheraxdestructor,2n=188)[8]、亞太螯蝦(Astacustrowbridgii,2n=376)[9]等,其中,亞太螯蝦是十足目中迄今報(bào)道的染色體數(shù)目最多的物種。龐大的數(shù)目給十足目動(dòng)物的染色體計(jì)數(shù)帶來(lái)很大困難,這也是導(dǎo)致十足目動(dòng)物二倍體數(shù)目占比普遍偏低的原因之一。不僅如此,十足目動(dòng)物的染色體形態(tài)還很微小,通常不超過(guò)4 μm[10],難以獲得形態(tài)清晰的中期分裂相,得到的染色體大多呈點(diǎn)狀[11]、塊狀[12]或棒狀[13-15],這些都加大了染色體核型制備和分析的難度,致使很多蝦蟹類的核型研究發(fā)展較為緩慢。

紅螯螯蝦隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱十足目,自1992年作為一種淡水經(jīng)濟(jì)蝦類引進(jìn)我國(guó)后[16],因其生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、養(yǎng)殖效益高而逐漸成為養(yǎng)殖新寵。紅螯螯蝦的營(yíng)養(yǎng)豐富,出肉率高,市場(chǎng)需求旺盛,有著良好的發(fā)展前景[17]。紅螯螯蝦具有十足目動(dòng)物染色體的典型特征,染色體制備困難。Tan等[18]對(duì)雄性紅螯螯蝦的核型進(jìn)行了研究,指出其染色體數(shù)目為200,染色體長(zhǎng)度均小于4 μm,但未對(duì)雌性紅螯螯蝦的染色體核型進(jìn)行分析,無(wú)法比較雌、雄紅螯螯蝦的染色體核型。

本研究以紅螯螯蝦的肝胰腺組織和精巢組織為材料,采用低滲和空氣干燥的方法制備染色體標(biāo)本,對(duì)雌、雄紅螯螯蝦染色體的長(zhǎng)度、臂比等核型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,比較雌、雄間的染色體核型差異,更新紅螯螯蝦的核型數(shù)據(jù),旨在豐富紅螯螯蝦細(xì)胞遺傳學(xué)的研究基礎(chǔ)和十足目動(dòng)物染色體核型信息,為推進(jìn)紅螯螯蝦遺傳育種工作提供數(shù)據(jù)參考。研究?jī)?nèi)容對(duì)十足目其他動(dòng)物染色體核型研究工作的開(kāi)展亦有借鑒和啟發(fā)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用的紅螯螯蝦個(gè)體采自浙江省海寧市鴻海養(yǎng)殖有限公司,取體重25～35 g的雌、雄蝦各15只用于實(shí)驗(yàn),養(yǎng)殖溫度為25 ℃,早、晚各投喂人工配合飼料(天邦全熟化龍蝦飼料)一次。

實(shí)驗(yàn)試劑主要包括:植物血凝素(PHA),上海新國(guó)衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司;秋水仙素,生工生物工程(上海)股份有限公司;甲醇、冰乙酸,上海麥克林生化科技股份有限公司;瑞氏-吉姆薩染色液,珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括TD5B型低速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)和DM4B型正置熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制備

參照石林林等[6]的染色體標(biāo)本制備方法,選取紅螯螯蝦肝胰腺和精巢組織用于染色體制備。設(shè)置秋水仙素處理時(shí)長(zhǎng)分別為2.5、3.0、4.0 h,其他制備條件相同,觀察比較不同處理時(shí)長(zhǎng)下的中期染色體形態(tài),篩選出秋水仙素最佳作用時(shí)長(zhǎng)。

1.2.2 染色體數(shù)據(jù)處理

選取有絲分裂中期相,在Adobe Photoshop 2020 21.2.0軟件中觀察、統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。選取形態(tài)良好、圖像清晰的雌、雄紅螯螯蝦染色體有絲分裂中期相,使用Image J軟件測(cè)量每條染色體的臂長(zhǎng),計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度和臂比(長(zhǎng)臂長(zhǎng)度與短臂長(zhǎng)度之比)。根據(jù)Levan等[19]的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)和命名法將染色體分為4組,即中部著絲粒染色體(m)、亞中部著絲粒染色體(sm)、亞端部著絲粒染色體(st)和端部著絲粒染色體(t),每組核型對(duì)應(yīng)的臂比范圍分別為1.00～1.67、>1.67～3.00、>3.00～7.00、>7.00。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備條件篩選

觀察并比較秋水仙素不同處理時(shí)長(zhǎng)條件下的有絲分裂中期染色體形態(tài),發(fā)現(xiàn)當(dāng)處理時(shí)長(zhǎng)為4.0 h時(shí),可以觀察到較多的點(diǎn)狀染色體,當(dāng)處理時(shí)長(zhǎng)為2.5、3.0 h時(shí)均可獲得染色體形態(tài)較好的有絲分裂中期相。從秋水仙素不同作用時(shí)長(zhǎng)條件下獲得的分裂相中選擇可以代表該條件下較多染色體形態(tài)的分裂相進(jìn)行觀察與比較(圖1)。

圖1 秋水仙素處理2.5 h(A)、3 h(B)、4 h(C)后染色體的形態(tài)Fig.1 Chromosome morphology after 2.5 h (A), 3 h (B) and 4 h (C) colchicine treatment

2.2 雌、雄紅螯螯蝦的染色體數(shù)目

本研究成功地從12只紅螯螯蝦中獲得分裂相,其中,在雌、雄肝胰腺組織中均獲得有絲分裂相,從雄性精巢組織中獲得減數(shù)分裂相。經(jīng)統(tǒng)計(jì),本研究分別獲得雌、雄紅螯螯蝦肝胰腺的有絲分裂中期相和雄性精巢組織減數(shù)分裂中期相各36個(gè)。雌性和雄性紅螯螯蝦有絲分裂的染色體數(shù)目范圍存在一定差異(圖2),分別為190～206、200～207,兩者的眾數(shù)均為200,分別占39.3%、50.0%。雄性精巢組織減數(shù)分裂中期相中,二價(jià)體數(shù)目在94～104(圖3),眾數(shù)為100,占比50%。將出現(xiàn)頻率最高的染色體數(shù)目定為二倍體染色體數(shù)目,則紅螯螯蝦的染色體數(shù)為2n=200。

圖2 雄、雌紅螯螯蝦肝胰腺染色體數(shù)目分布Fig.2 Chromosome number distribution of hepatopancreas in male and female Cherax quadricarinatus

圖3 紅螯螯蝦精巢染色體數(shù)目分布Fig.3 Spermatic chromosome number distribution of Cherax quadricarinatus

2.3 雌、雄紅螯螯蝦核型分析與比較

從雌、雄紅螯螯蝦中各選出一個(gè)數(shù)目完整、形態(tài)良好的有絲分裂中期相(圖4)進(jìn)行核型分析,測(cè)量分裂相中各染色體的臂長(zhǎng),計(jì)算臂比,將染色體長(zhǎng)度和臂比最相近的染色體配對(duì),最后按照同源染色體長(zhǎng)度遞減的順序排列,分別構(gòu)建雄性(圖5)和雌性(圖6)紅螯螯蝦的染色體組型,其核型公式均為n=100=36(m)+33(sm)+14(st)+17(t)。

圖4 雄性(A)、雌性(B)紅螯螯蝦有絲分裂中期相和雄性減數(shù)第一次分裂中期相(C)Fig.4 Metaphase mitotic chromosome of male (A), female (B) Cherax quadricarinatus and meiosis first division metaphase chromosome (C)

m,中部著絲粒染色體;sm,亞中部著絲粒染色體;st,亞端部著絲粒染色體;t,端部著絲粒染色體。下同。m, Central centromere; sm, Subcentral centromere; st, Subterminal centromere; t, terminal centromere. The same as below.圖5 雄性紅螯螯蝦核型模式圖Fig.5 Karyotype pattern of male Cherax quadricarinatus

圖6 雌性紅螯螯蝦核型模式圖Fig.6 Karyotype pattern of female Cherax quadricarinatus

取每對(duì)同源染色體長(zhǎng)臂和短臂的平均值作為同源染色體臂長(zhǎng)數(shù)據(jù),計(jì)算同源染色體長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度和臂比。雌、雄紅螯螯蝦分別對(duì)應(yīng)100組數(shù)據(jù),將統(tǒng)計(jì)結(jié)果整理于表1。比較雌性、雄性紅螯螯蝦的染色體長(zhǎng)度數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),雄性紅螯螯蝦的染色體平均長(zhǎng)度(1.28 μm)大于雌性(1.09 μm),雄性紅螯螯蝦的染色體長(zhǎng)度分布范圍(0.16～3.65 μm)也大于雌性(0.25～2.67 μm),雄性和雌性紅螯螯蝦染色體的相對(duì)長(zhǎng)度范圍分別為0.1%～2.9%、0.2%～2.4%。對(duì)比雌、雄紅螯螯蝦染色體的臂比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),雄性紅螯螯蝦sm型染色體的臂比范圍(1.709～2.963)與雌性(1.735～2.968)相近,雄性紅螯螯蝦m型染色體的臂比范圍(1.117～1.596)與雌性(1.052～1.639)相當(dāng)。在st型分組中,雄性的臂比范圍(3.024～4.710)略小于雌性(3.042～5.507)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,雌、雄紅螯螯蝦的染色體長(zhǎng)度與各組型染色體長(zhǎng)度均無(wú)顯著差異(P>0.05),染色體臂比與各組型染色體臂比也均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

為了更直觀地比較每條染色體的長(zhǎng)度,將雄性和雌性紅螯螯蝦染色體的長(zhǎng)臂和短臂用柱形圖展示(圖7、圖8)。計(jì)算100對(duì)同源染色體的長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)差,雄性的為0.67,雌性的為0.43,可知雌性染色體長(zhǎng)度的離散程度更小,染色體長(zhǎng)度分布更集中,數(shù)值變化更穩(wěn)定。在各組型中,雄性的最大染色體長(zhǎng)度均大于雌性。雌、雄紅螯螯蝦的最大染色體分別為m型和sm型,長(zhǎng)度分別為2.67、3.65 μm,最小染色體均為t型,長(zhǎng)度分別為0.25、0.16 μm。雌、雄紅螯螯蝦的染色體長(zhǎng)度均小于4 μm。

正向長(zhǎng)度表示染色體短臂,負(fù)向長(zhǎng)度表示染色體長(zhǎng)臂,0表示染色體著絲粒位置。圖8同。The positive length represents the short arm of chromosome, the negative length represents the long arm of chromosome, and 0 represents the centromere position of chromosome. The same as in Fig. 8.圖7 雄性紅螯螯蝦各染色體的長(zhǎng)度Fig.7 Chromosome length of male Cherax quadricarinatus

圖8 雌性紅螯螯蝦各染色體的長(zhǎng)度Fig.8 Chromosome length of female Cherax. quadricarinatus

3 討論

3.1 染色體制備

在染色體核型制備過(guò)程中,為了獲得大量的有絲分裂相和減數(shù)分裂相,通常會(huì)選取細(xì)胞快速分裂狀態(tài)下的組織[15]。在蝦蟹類動(dòng)物中,使用精巢[12,20]、受精卵[13]、觸角腺[20]和肝胰腺[21]等組織均可獲得較好的效果。Tan等[18]從紅螯螯蝦精巢組織中獲得了有絲分裂和減數(shù)分裂中期相。本研究選用紅螯螯蝦肝胰腺和精巢組織進(jìn)行染色體制片,在肝胰腺組織中獲得大量有絲分裂相,在精巢組織中獲得減數(shù)分裂相。減數(shù)分裂相的染色體數(shù)目較少,統(tǒng)計(jì)更為精確,統(tǒng)計(jì)結(jié)果符合有絲分裂相中染色體數(shù)目的一半,說(shuō)明本研究中紅螯螯蝦染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可靠。

通過(guò)調(diào)整秋水仙素作用時(shí)長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)當(dāng)秋水仙素用量為5 μg·g-1(以蝦體重計(jì)),作用時(shí)長(zhǎng)為2.5～3 h時(shí),可獲得形態(tài)良好的中期分裂相,并從中選出了形態(tài)良好、著絲?？杀娴拇?、雄紅螯螯蝦有絲分裂中期染色體進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì),使得雌、雄個(gè)體間染色體核型的比較結(jié)果更加客觀,更具說(shuō)服力。

3.2 紅螯螯蝦染色體核型

理論上,以出現(xiàn)百分比大于85%的眾數(shù)為該物種的染色體數(shù)[10],然而在十足目染色體數(shù)目的研究中往往不能滿足該要求,在已報(bào)道的部分十足目動(dòng)物,如南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei,2n=88)[22]、加州對(duì)蝦(Penaeuscaliforniensis,2n=88)[22]、日本絨螯蟹(Eriochierjaponica,2n=146)[14]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis,2n=146)[14]中,二倍體染色體數(shù)目占比均在35%～70%。在染色體數(shù)目更多的十足目動(dòng)物中,二倍體數(shù)目占比甚至更低,如克氏原螯蝦(2n=188)二倍體數(shù)目占比為25.6%[6]。奧斯塔歐洲螯蝦(Astacusastacus,n=88)和東歐螯蝦(Astacusleptodactylus,n=90)的單倍體數(shù)目分別占40%和35%[23]。本研究中,雌、雄紅螯螯蝦二倍體數(shù)占比分別為39.3%、50.0%,單倍體數(shù)占比為50%,高于前述奧斯塔歐洲螯蝦和東歐螯蝦的研究結(jié)果,稍低于已報(bào)道的紅螯螯蝦單倍體數(shù)目(54.4%)[18]。本研究中,有27.8%的染色體數(shù)目小于二倍體數(shù)。造成這種結(jié)果的原因可能是染色體在制備過(guò)程中丟失,比如固定液和低滲溶液的交換過(guò)程、懸浮液滴片過(guò)程等。此外,染色體擴(kuò)散時(shí)的重疊分布也會(huì)導(dǎo)致觀察到的數(shù)目小于實(shí)際數(shù)目[24]。

本研究獲得的雄性染色體核型與已報(bào)道的核型結(jié)果[18]存在較大差異,本研究中雄性個(gè)體的m組和sm組分別比已報(bào)道的多3對(duì)和8對(duì),st組染色體數(shù)目相同,相應(yīng)地,t組染色體則少11對(duì)。分析其可能的原因在于,制備條件不同影響染色體的皺縮程度,使得皺縮程度較大的染色體著絲粒位置難以確定,進(jìn)而影響觀察結(jié)果。制備著絲粒位置可辨的染色體中期分裂相是獲得準(zhǔn)確核型信息的關(guān)鍵。本研究表明,染色體皺縮程度受到秋水仙素用量和作用時(shí)長(zhǎng)的影響,當(dāng)秋水仙素用量為5 μg·g-1時(shí),作用時(shí)長(zhǎng)2.5～3.0 h可獲得形態(tài)良好的有絲分裂中期相。已報(bào)道的紅螯螯蝦染色體是經(jīng)2 μg·g-1秋水仙素作用5.0～6.0 h[18]得到的有絲分裂中期染色體。經(jīng)過(guò)觀察、比較兩項(xiàng)研究中的有絲分裂中期分裂相和核型模式圖,發(fā)現(xiàn)本研究中著絲粒位置可辨別的染色體數(shù)目更多,染色體形態(tài)相對(duì)更為舒展,更多地呈現(xiàn)為“X”狀、倒“Y”狀和倒“V”狀,點(diǎn)狀染色體較少,更利于確定染色體分組,因此核型分組結(jié)果準(zhǔn)確性更高。此外,本研究中雄性和雌性紅螯螯蝦的染色體核型分組結(jié)果一致,也增加了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。

二價(jià)體由同源染色體發(fā)生聯(lián)會(huì)兩兩配對(duì)而成,形狀呈環(huán)狀、十字狀和啞鈴狀。啞鈴狀結(jié)構(gòu)是甲殼類動(dòng)物二價(jià)體的典型特征[10]。二價(jià)體數(shù)目是有絲分裂染色體的一半,降低了染色體計(jì)數(shù)的難度。在一些核型研究中,為了便于確定染色體數(shù)目,通常選擇精巢組織,以獲得數(shù)量減半的減數(shù)分裂中期染色體[25-27]。本研究在精母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂中期獲得二價(jià)體,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其染色體數(shù)目為有絲分裂的一半。相對(duì)于減數(shù)分裂,二價(jià)體具有便于統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目的優(yōu)勢(shì);但有絲分裂中期獲得的染色體的優(yōu)勢(shì)在于更易觀察形態(tài)特征,更適合對(duì)染色體大小和形態(tài)進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

本研究分別統(tǒng)計(jì)了雌、雄紅螯螯蝦有絲分裂中期和雄性第一次減數(shù)分裂中期的染色體數(shù)目,確定了紅螯螯蝦的二倍體染色體數(shù)目為2n=200、單倍體染色體數(shù)目為n=100。經(jīng)分析雌、雄個(gè)體有絲分裂中期染色體的核型數(shù)據(jù),確定核型公式為n=100=36(m)+33(sm)+14(st)+17(t)。雌、雄紅螯螯蝦染色體在大小和形態(tài)上無(wú)顯著差異,未發(fā)現(xiàn)異形染色體。