關節(jié)腔注射負載Dickkopf-3 的溫敏羥丁基殼聚糖水凝膠對大鼠骨關節(jié)炎的影響

郭 正，趙之棟，高劃一，李眾利

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心骨科，北京 100853

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨重塑為特征的慢性退行性疾病，是造成關節(jié)疼痛和功能喪失的主要原因[1-2]。軟骨細胞的改變是OA 進展的核心，暴露于炎性細胞因子等不利因素的肥大軟骨細胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5，ADAMTS-5)等細胞外基質(zhì)分解酶打破軟骨基質(zhì)合成與分解的平衡，導致軟骨組織的破壞[3]。有證據(jù)表明，Wnt 信號通路的過度激活是OA 進展的關鍵因素之一[4]。

Dickkopf 相關蛋白3(Dickkopf-3，DKK3)是一種Wnt 通路抑制劑，已被報道在不同程度的OA 患者異常重塑的軟骨下骨中與Wnt 通路的核心蛋白β-連環(huán)蛋白發(fā)揮拮抗作用，且在OA 軟骨、滑膜、滑液中的水平均有升高[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)DKK3 抑制炎性細胞因子介導的人和牛軟骨外植體蛋白聚糖和膠原蛋白的損失，并認為DKK3 在疾病中的上調(diào)可能是抵消疾病相關細胞信號通路失調(diào)的防御機制[6]?？偟膩碚f，DKK3 有治療OA 的潛力，但缺乏直接作用于生物體內(nèi)改善OA 的證據(jù)。全身使用DKK3 可能造成未知的不良反應，為了驗證其在OA 進展中的治療作用，迫切需要開發(fā)合適的制劑和使用方法。

關節(jié)腔為關節(jié)囊滑膜層與關節(jié)面共同圍成的密閉腔隙[7]。針對OA 的治療，關節(jié)腔注射可以減少藥物脫靶，避開生理屏障，提高生物利用度。然而，藥物在關節(jié)腔內(nèi)被迅速清除至作用濃度以下，為了取得理想的效果需要頻繁進行注射，感染風險隨之增加[8]。原位凝膠是一類以溶液狀態(tài)給藥后，立即在用藥部位發(fā)生相變，轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍虘B(tài)凝膠的制劑。負載其中的藥物緩慢釋放，將藥物濃度保持在治療窗口內(nèi)，從而減少給藥頻率，提高患者依從性[9]。原位凝膠制劑常選用狀態(tài)隨著環(huán)境變化而變化的聚合物材料來制備。

殼聚糖是一種正電性天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、抑菌性，無毒性，低免疫原性，在藥物遞送領域受到廣泛關注[10]。常溫下，殼聚糖既不溶于水，也不溶于普通的有機溶劑，限制了其應用[11]。羥丁基殼聚糖(hydroxybutyl chitosan，HBC)是對殼聚糖分子鏈的羥基和氨基進行羥丁基化的衍生物，除殼聚糖的固有屬性外，還具有水溶性和溫敏性，環(huán)境溫度低于相變點時為透明溶液，環(huán)境溫度高于相變點時形成水凝膠，具備極佳的載藥和藥物緩釋能力[12-13]。

本研究將DKK3 裝載于HBC 溫敏凝膠系統(tǒng)中用于大鼠膝關節(jié)腔注射，使其緩慢釋放，評估其對骨關節(jié)炎的改善作用。

材料與方法

1 實驗動物、儀器與試劑 雄性SD 大鼠購于維通利華。重組DKK3 和抗體購于ABclonal 公司，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)和多聚甲醛購于Servicebio 公司，酶聯(lián)免疫實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于Cloud-Clone 公司，Ⅱ型膠原酶購于Sigma公司，胎牛血清和α-MEM 培養(yǎng)基購于Gibco 公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)購于Dojindo 公司，顯微計算機斷層掃描(micro-computed tomography，Micro-CT)設備購于Siemens 公司。

HBC 水溶液由惠眾國際醫(yī)療器械(北京)有限公司提供，其制備方法如下。將殼聚糖堿化，分散在異丙醇-水中，并與1，2-環(huán)氧丁烷混合。在室溫下反應96 h 后，除去過量的烷化劑和未反應的部分，用丙酮徹底洗滌樣品并在50℃真空中干燥。最后，將樣品溶解在去離子水中以制備2 wt%HBC 水溶液，并在4℃儲存直至使用。4℃溫和攪拌下，將濃縮的DKK3 添加到HBC 溶液中以產(chǎn)生負載DKK3 的HBC(DKK3-loaded HBC)溶液(250 ng/mL)，4℃保存以備使用。

2 評估凝膠形成時間 將裝有DKK3-loaded HBC溶液的離心管分別浸泡在17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃恒溫水浴中，觀察到?jīng)]有可流動液體表明DKK3-loaded HBC 溶液成功形成凝膠，記錄所需時間。

3 DKK3-loaded HBC 水凝膠的體外釋放 將3 mL DKK3-loaded HBC 溶液加入6 孔板中，于37℃固化，將DKK3-loaded HBC 水凝膠浸入3 mL PBS中作為釋放介質(zhì)，并在37℃環(huán)境孵育。分別在1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h后收集3 mL 釋放介質(zhì)，并使用新鮮PBS 替換以保持體積恒定。根據(jù)制造商說明進行ELISA 測定每個時間點DKK3-loaded HBC 水凝膠中DKK3 的釋放，并計算體外累積釋放量。

4 細胞毒性實驗 使用Ⅱ型膠原酶消化接受全膝關節(jié)置換術OA 患者的脛骨平臺宏觀正常區(qū)域以獲得原代人軟骨細胞。使用添加15%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)軟骨細胞，每2 d 更換1 次培養(yǎng)液。

將HBC 溶液以1∶4 的比例浸入α-MEM 培養(yǎng)基中24 h，收集其上清液作為100% HBC 浸取液，并分別稀釋為25%和50% HBC 浸取液。使用DKK3(250 ng/mL)或不同濃度的HBC 浸取液培養(yǎng)黏附在96 孔板(104/孔)的軟骨細胞，并在1 d、3 d、5 d 和7 d 后使用20 μL CCK-8 溶液和180 μL培養(yǎng)基替換，37℃孵育1 h 后，使用酶標儀測量其在450 nm 波長的光密度(optical density，OD)并計算相對增長率(實驗組與未經(jīng)DKK3 或HBC 浸取液處理組的平均OD 值的比值；relative growth rate，RGR)[14]。

5 動物模型制備 將24 只8 周齡的雄性SD 大鼠(維通利華)隨機分為4 組：假手術組(Sham)、OA 模型組(OA Model)、OA+DKK3 組和OA +DKK3-loaded HBC 組，每組各6 只。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉并切開關節(jié)囊后，對OA Model、OA +DKK3 和OA +DKK3-loaded HBC 組大鼠右膝關節(jié)行前交叉韌帶離斷術，抽屜試驗陽性是造模成功的標志。術后4 周，假手術組和OA 模型組大鼠關節(jié)腔注射0.1 mL PBS，OA +DKK3 和OA+DKK3-loaded HBC 組大鼠關節(jié)腔注射0.1 mL DKK3 或DKK3-loaded HBC。所有4 組大鼠每周注射1 次，持續(xù)3 周。

6 大鼠步態(tài)分析 使用步態(tài)分析系統(tǒng)CatWalk XT(Noldus)評估大鼠的運動功能。訓練大鼠自發(fā)通過玻璃跑道向終點移動，步態(tài)分析系統(tǒng)檢測并記錄大鼠腳印，從而計算與腳印大小、時間和腳印之間距離等相關的統(tǒng)計信息。

7 Micro-CT 掃描大鼠膝關節(jié) 使用戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹膜內(nèi)過量麻醉處死大鼠，分離右膝關節(jié)并通過4%多聚甲醛固定后使用micro-CT 掃描樣本。參數(shù)：電壓70 kV，電流114 μA，分辨率25 μm/pixel。

8 組織學分析大鼠膝關節(jié)切片 將樣本脫鈣后嵌入石蠟塊中，冠狀位切片(5 μm)。進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色。使用國際骨關節(jié)炎研究學會(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)評分量化關節(jié)軟骨退變和破壞[15]。所有樣本由2 名骨科專業(yè)觀察者獨立打分。

使用免疫組織化學(immunohistochemical，IHC)技術對MMP-13、Ⅱ型膠原α1(collagen typeⅡ alpha 1，COL2A1)、ADAMTS-5 和蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)進行染色并計算其陽性面積比例以指示其表達水平。

結(jié) 果

1 DKK3-loaded HBC 溶液在37℃快速凝膠 環(huán)境溫度為4℃時，HBC 和DKK3-loaded HBC 為澄清透明的溶液。37℃時，HBC 轉(zhuǎn)變?yōu)橥该髂z，DKK3-loaded HBC 為乳白色凝膠(圖1)。17℃恒溫水浴下，DKK3-loaded HBC 溶液經(jīng)過約1 min轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍虘B(tài)；升高溫度縮短了凝膠時間，37℃時僅用時約10 s(圖2)，即關節(jié)腔中DKK3-loaded HBC 溶液可以在10 s 內(nèi)形成水凝膠。

圖1 4℃溶液狀態(tài)和37℃水凝膠狀態(tài)的HBC 和DKK3-loaded HBCFig.1 HBC and DKK3-loaded HBC in solution state at 4℃ and in hydrogel state at 37℃

圖2 溫度對DKK3-loaded HBC 水凝膠形成時間的影響Fig.2 Effect of temperature on the DKK3-loaded HBC hydrogel formation

2 DKK3 從水凝膠中平穩(wěn)釋放 如圖3 所示。DKK3 在24 h 內(nèi)快速釋放約40%，72 h 釋放約60%，接下來釋放速率趨于平穩(wěn)，168 h 時90%的DKK3 從HBC 水凝膠中釋放出來。結(jié)果表明，DKK3被有效包封在HBC 凝膠中，在24 h 內(nèi)快速釋放并平穩(wěn)釋放168 h。

圖3 DKK3 從HBC 水凝膠中隨時間的累積釋放Fig.3 In vitro cumulative release of DKK3 from DKK3-loaded HBC hydrogel

3 HBC 浸取液不影響軟骨細胞活力 培養(yǎng)1 d、3 d、5 d 和7 d 后，暴露于DKK3 或HBC 浸取液的所有軟骨細胞RGR 均大于90%(圖4)。結(jié)果表明，DKK3 和HBC 浸取液僅有極輕微的細胞毒性，對軟骨細胞活力無顯著影響。

圖4 DKK3 或HBC 浸取液干預的軟骨細胞活性Fig.4 Chondrocyte viability treated by DKK3 or HBC extraction solution

4 DKK3-loaded HBC 改善OA 大鼠步態(tài) DKK3和DKK3-loaded HBC 對ACLT 誘導的大鼠步幅的縮短有著程度相當?shù)母纳?P<0.0001)；DKK3-loaded HBC 提高了大鼠通過跑道的平均速度(P<0.05)。DKK3-loaded HBC 相比DKK3 更大程度地改善了造模引起的大鼠后爪與地面接觸時間的縮短(P<0.05)(圖5)。

圖5 DKK3-loaded HBC 治療對OA 大鼠步態(tài)的影響Fig.5 Effect of DKK3-loaded HBC treatment on gait of OA rats

5 DKK3-loaded HBC 減少OA 大鼠骨和軟骨破壞 Micro-CT 顯示造模導致關節(jié)表面粗糙，軟骨下骨和髕骨似骨質(zhì)溶解表現(xiàn)，大量骨贅產(chǎn)生，半月板損傷，這些改變被DKK3 和DKK3-loaded HBC不同水平地抑制(圖6)。

圖6 膝關節(jié)矢狀位3D 圖像(比例尺=1 mm)Fig.6 3D Micro-CT images of the knee joints on the sagittal views (bar=1 mm)

HE 染色顯示，假手術組關節(jié)面光滑；軟骨細胞在軟骨基質(zhì)內(nèi)均勻分布，同源細胞群呈特征性單層縱向排列；潮線完整連續(xù)，與鈣化層軟骨分界清晰。與之形成鮮明對比的是，經(jīng)過造模的關節(jié)，其光滑的軟骨表面消失，可見部分因損傷而骨化；肥大軟骨細胞數(shù)量異常增多；潮線不連續(xù)，與鈣化層軟骨分界不清。DKK3 和載有DKK3的HBC 抑制了軟骨的退行性表現(xiàn)(圖7)，降低了OARSI 評分(P<0.05)(圖8)，但HBC 的參與帶來了輕微的炎癥反應。

圖7 HE 染色(比例尺=200 μm)Fig.7 HE staining results (bar=200 μm)

圖8 OARSI 評分Fig.8 OARSI score

6 DKK3-loaded HBC 抑制MMP-13 和ADAMTS-5 的表達并減少COL2A1 和ACAN 的損失 相比假手術組組，OA 模型組軟骨基質(zhì)成分COL2A1和ACAN 急劇減少(P<0.0001)，相應的，MMP-13 和ADAMTS-5 表達顯著增加(P<0.0001)。這些改變被DKK3 和DKK3-loaded HBC 不同程度地恢復(P<0.05) (圖9)，表明它們對OA 軟骨的分解代謝具有強烈的抑制作用。

圖9 膝關節(jié)軟骨免疫組化染色(比例尺=200 μm)Fig.9 IHC stain results of the cartilage of OA knees (bar=200 μm)

討 論

OA 的治療仍是一個臨床難題。探索用于關節(jié)腔新藥物的同時，需要開發(fā)合適的材料，緩慢釋放包載其中的藥物，同時提供適宜軟骨生長的微環(huán)境。正常的關節(jié)軟骨是具有雙相性質(zhì)的液固結(jié)構，軟骨細胞包埋在以Ⅱ型膠原為主的膠原原纖維交織排列形成網(wǎng)狀結(jié)構，嵌入帶負電荷的蛋白聚糖構成的軟骨基質(zhì)中[16]。殼聚糖的單體與蛋白聚糖主干透明質(zhì)酸的單體一致，在關節(jié)腔內(nèi)不會產(chǎn)生排異反應，其正電性使其可以很容易地包載負電性的蛋白質(zhì)類藥物，以保護其免受酶的降解，延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的生物活性[17]。但其難溶的性質(zhì)阻礙了更廣泛的應用，通過合適的改性，使殼聚糖衍生物具有良好的溶解性，進一步構建水凝膠，是一種使其得到更廣泛應用的有效策略。

HBC 是對殼聚糖分子鏈的羥基和氨基進行羥丁基化的衍生物，在細胞和動物中均表現(xiàn)出了較好的生物相容性[12,18]。在低溫下，HBC 為黏度較低的液體，方便與藥物混合，在關節(jié)腔注射過程中侵入較小，并且可以精準注射至病變較重部位，進入關節(jié)腔后，負載藥物的HBC 在10 s 內(nèi)凝膠，轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍虘B(tài)的藥物貯庫，方便應用于臨床。該凝膠系統(tǒng)不需要添加額外的交聯(lián)劑，因而毒性較小，在溶脹狀態(tài)下，水凝膠柔軟呈橡膠狀，在很大程度上與活組織相似，提供幾乎正常的軟骨細胞生長環(huán)境，包載其中的藥物在擴散作用和水凝膠崩解的雙重作用下緩慢釋出，將局部的藥物濃度長期平穩(wěn)保持在治療窗口內(nèi)，避免了峰谷現(xiàn)象。

本研究中，DKK3 和HBC 浸取液在體外對軟骨細胞的生存率幾乎不造成影響，奠定了其用于關節(jié)腔的基礎。DKK3-loaded HBC 水凝膠表現(xiàn)出了在第1 天迅速釋放并在7 d 內(nèi)持續(xù)釋放的優(yōu)良性能，且未觀測到常見藥物緩釋系統(tǒng)中突釋的現(xiàn)象。

內(nèi)側(cè)間室最常在膝OA 中受累，表現(xiàn)為內(nèi)翻畸形和內(nèi)收力矩增加，為了減輕內(nèi)側(cè)間室的負荷，患者傾向于向外旋轉(zhuǎn)腿部，降低步行速度[19-21]。疼痛和結(jié)構性異常共同作用于步態(tài)，患者往往因疼痛減少支撐時間并縮短步幅[22]。在本研究中DKK3 和DKK3-loaded HBC 對這些指標不同程度的改善反映了其對骨關節(jié)炎結(jié)構性病變的延緩和對疼痛的改善。

Micro-CT 和HE 染色從軟骨、軟骨下骨、髕骨面的平整程度和半月板的損傷等方面反映了治療組骨OA 的延緩。為了更確切地反映軟骨基質(zhì)的改變同時挖掘這種改變的成因，我們進行了免疫組化實驗。結(jié)果顯示，ACAN 和COL2A1 在OA 進程中的劇烈減少被DKK3 挽救，HBC 的參與放大了這一作用。MMPs 是炎癥性和退變性關節(jié)疾病組織破壞的重要調(diào)節(jié)因子，MMP-13 在整個MMPs 家族中，作用底物最廣，對Ⅱ型膠原的降解能力最強，在正?；?、軟骨組織中無表達或極少量表達，其表達量與關節(jié)軟骨的組織破壞程度一致[23-24]。IHC 顯示DKK3-loaded HBC 對OA 模型中MMP-13 升高的抑制效果優(yōu)于DKK3，可能是HBC 的緩釋作用使DKK3 的局部濃度長期保持在治療窗口內(nèi)導致了這一結(jié)果。ADAMTS-5是關節(jié)軟骨內(nèi)降解ACAN 的主要因素，其表達水平在OA 進展過程中顯著增加，是OA 潛在的治療靶點[25-26]。有趣的是，在本實驗中，雖然DKK3-loaded HBC 對ACAN 的保護相較于DKK3 顯示出了有統(tǒng)計學差異的優(yōu)化，但兩者對ADAMTS-5 表達的抑制沒有顯著差異，可能是由于單體結(jié)構與ACAN 相似的HBC 為ACAN 的生成和保護提供了適宜的微環(huán)境。

本研究仍有一些局限性：(1) HBC 在體內(nèi)和體外的特性可能存在差異，在關節(jié)腔內(nèi)凝膠的DKK3-loaded HBC 可能隨著運動和酶的降解緩釋作用削弱，使DKK3 的釋放快于預期；(2)盡管HBC 有著相當可靠的生物相容性，我們?nèi)钥蓮牟糠智衅锌吹捷p微的炎癥反應，提示需要對制劑進一步優(yōu)化?？偟膩碚f，本研究的數(shù)據(jù)表明HBC有著優(yōu)秀的載藥和緩釋能力，在前交叉韌帶離斷術誘導OA 的大鼠關節(jié)腔注射DKK3-loaded HBC可能通過減少MMP-13 和ADAMTS-5 等軟骨基質(zhì)分解酶的表達延緩骨關節(jié)炎的進展，改善大鼠的疼痛和運動表現(xiàn)。關節(jié)腔注射DKK3-loaded HBC是一種有前景的OA 治療方法。

作者貢獻李眾利：策劃總體研究目標和目的；郭正、趙之棟、高劃一：設計并完成實驗，收集數(shù)據(jù)，撰寫論文。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：guozcn@foxmail.com。