大腦皮層MANF和NF-κB p65表達及其在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用

周道英,尹 號,韓明明,楊成偉,李振宇,宋 堯,黃 祥,康 芳,李 娟

腦卒中是臨床常見病,死亡率和致殘率高,其中缺血性腦卒中占60%～70%[1]。目前缺血性腦卒中主要治療方法為靜脈溶栓和血管內治療,但血管再通后缺血性腦卒中區(qū)域血供的恢復會導致一系列不良的生化反應,引起腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)[2]。中腦星形膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)是一種新型的神經(jīng)營養(yǎng)因子,研究認為MANF在CIRI中具有腦保護作用[3],但其具體的作用機制尚不明確。核轉錄因子(NF)-κB是一種重要的轉錄調控因子,其在兔關節(jié)炎癥模型中可通過抑制NF-κB信號通路,降低靶基因表達,減輕關節(jié)炎癥反應。本研究擬觀察腦皮層MANF和NF-κB p65表達在大鼠CIRI中作用,以期為缺血性腦卒中的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物與分組 清潔級健康雄性SD大鼠30只,6～8周齡,體質量200～230 g,購自安徽省立醫(yī)院實驗動物中心。所有大鼠均于實驗前在標準化實驗室鼠籠中適應性喂養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)字表法分成假手術組(Sham組)和缺血再灌注組(I/R組),各15只。所有實驗操作已獲中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準,審批號:2021-N(A)-82。

1.1.2 主要試劑 2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液購自上海生工生物工程股份有限公司;MANF、GAPDH、CHOP抗體購自美國Sigma公司;NF-κB p65抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;SDS-PAGE緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司;HRP標記的羊抗兔/鼠IgG二抗購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司;TUNEL試劑盒購自美國Roche公司;ELISA試劑盒購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大腦中動脈閉塞模型建立 I/R組大鼠采用改良線栓法制備大鼠局灶性CIRI模型[4],1%異氟醚吸入麻醉,取頸部腹側正中切口分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,結扎頸總動脈近心端、頸外動脈根部,將事先頭端鈍化處理后的線栓(直徑為0.235 mm的尼龍線)緩慢從頸總動脈插入頸內動脈,感受到稍有抵抗感時停止(插入深度約18～20 mm),結扎頸外動脈,阻閉大腦中動脈?？p合切口,術后切口周圍局部注射1%利多卡因進行鎮(zhèn)痛,栓塞2 h后,將線栓拔出少許使插入深度約15 mm,開始大腦中動脈再灌注。Sham組不將線栓插入頸內動脈,其余處理方法同I/R組。術中使用保溫毯維持大鼠體溫37～38 ℃,麻醉蘇醒后單籠飼養(yǎng),自由攝食。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分(Longa)法評估神經(jīng)功能 再灌注24 h時各組隨機取6只大鼠,由一位不熟悉分組的實驗人員采用Longa 5分制評分標準[5]對大鼠進行神經(jīng)功能損傷評分,總分0～4分。Longa評分標準:0分,無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分,無法伸直左側前爪,神經(jīng)功能輕度障礙;2分,大鼠走動時向對側(癱瘓側)轉圈,神經(jīng)功能中度障礙;3分,大鼠走動時身體向對側(癱瘓側)傾倒,神經(jīng)功能重度障礙;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失。評分越高,說明神經(jīng)功能損傷越嚴重。建模成功大鼠評分1～3分,去除0分和4分,模型制作成功率93.4%,模型在實驗中隨機補全,以確保每組大鼠的數(shù)量保持不變。

1.2.3 頭顱磁共振掃描(MRI)觀察腦梗死灶 神經(jīng)功能評估后的6只大鼠,在麻醉下以俯臥位放入MRI磁體孔內,頭部固定在7.62 cm的表面線圈內,MRI在美國GE公司3.0T Sigma HDX MRI掃描儀上進行。在T2加權成相上觀察腦缺血梗死灶,證實造模成功。

1.2.4 TTC染色檢測腦梗死體積 6只大鼠MRI掃描后,在深麻醉下快速斷頭取腦,新鮮腦組織用0.9%氯化鈉溶液沖洗后立即放入-20 ℃冰箱15 min,腦組織去除小腦及低位腦干后,沿著冠狀面將大腦切成2 mm厚度冠狀切片,將腦切片立即放入2%的TTC磷酸鹽緩沖液中,在37 ℃溫箱中避光孵育15 min,正常腦組織被染為紅色,而梗死區(qū)域腦組織不能被TTC染料染色則呈現(xiàn)白色。將已染色的腦切片按順序規(guī)律擺放,掃描儀掃描后用Image J圖像處理軟件分析,測定腦梗死面積。梗死體積百分比=(梗死對側正常腦組織體積-梗死側正常腦組織體積)/梗死對側正常腦組織體積×100%。

1.2.5 HE染色法檢測大腦皮層組織病理學變化 2組各取5只大鼠,在深麻醉下快速斷頭取腦,取腦組織,于4%多聚甲醛溶液中固定,脫水,石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,厚約4 μm,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。取各組大鼠腦組織石蠟切片,進行HE染色,封片后顯微鏡下(×200)觀察缺血區(qū)域大腦皮層的組織病理學變化和細胞損傷情況。

1.2.6 Western blotting法檢測大腦皮層MANF、NF-κB p65表達 于再灌注24 h時,各組隨機取4只大鼠,在深麻醉下快速斷頭取腦,心臟采血待用。取同側大腦皮層缺血半暗帶,稱質量后加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解緩沖液RIPA,于冰上勻漿裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清,按比例加入上樣緩沖液后,90 ℃水浴加熱5 min,-20 ℃冷凍保存。取適量蛋白上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離,濕轉法轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗MANF(1∶1 000稀釋)、NF-κB p65(1∶1 000稀釋)、GAPDH(1∶1 000稀釋),4 ℃下孵育過夜,洗膜后HRP標記的羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h,洗膜后化學發(fā)光顯影,用Image J圖像處理軟件分析,以GADPH為內參,通過與內參的灰度值比,得出目的條帶的相對表達水平,測定MANF與NF-κB p65蛋白表達水平。

1.2.7 免疫組織化學染色法檢測大腦皮層MANF、NF-κB p65、CHOP表達 取2組大鼠腦組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復、封閉后,分別滴加MANF抗體(1∶400稀釋)、NF-κB p65抗體(1∶400稀釋)和CHOP抗體(1∶50稀釋),按免疫組織化學ABC法染色后,DAB顯色,蘇木素復染,二甲苯透明,中性樹膠封片,于光鏡下(×200)觀察。細胞質或細胞核呈棕黃色染色為免疫陽性細胞,每張切片于高倍鏡下隨機選取梗死灶邊緣區(qū)域相互不重疊的5個視野,計數(shù)MANF、NF-κB p65、CHOP表達陽性細胞。

1.2.8 免疫熒光染色法檢測大腦皮層MANF和NF-κB p65亞細胞定位 取各組大鼠腦組織石蠟切片,二甲苯脫蠟,PBS清洗3次,檸檬酸修復液修復抗原,修復后用10%山羊血清封閉(37 ℃,30 min),滴加一抗MANF(1∶50稀釋)及NF-κB p65(1∶800稀釋)混合于腦組織上,4 ℃孵育過夜,室溫復溫30 min,洗去一抗,滴加與一抗同一來源的二抗熒光顯色(MANF綠色、NF-κB p65紅色),37 ℃避光孵育1 h,洗去二抗,加含DAPI(藍色)的抗熒光淬滅劑復染細胞核5 min,最后用甘油封片,共聚焦顯微鏡下(×400)觀察缺血區(qū)域大腦皮層MANF和NF-κB p65亞細胞定位。

1.2.9 TUNEL染色法檢測大腦皮層細胞凋亡 取各組大鼠腦組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復后,將切片與TUNEL試劑混合液室溫避光孵育1 h。PBS洗滌后,用DAPI核染色劑觀標記細胞核。TUNEL染色結束后滴加抗熒光淬滅劑封片,使用熒光顯微鏡觀察(×200)并拍照記錄。在每個切片中隨機選擇缺血區(qū)域大腦皮層5個不同視野記錄TUNEL染色(綠色)陽性細胞數(shù),并計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。觀察缺血區(qū)域大腦皮層的細胞凋亡情況。

1.2.10 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平 將收集的大鼠血液室溫靜置40～60 min,靜置待血液析出血清后4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,收集上層無色或淡黃色血清樣品。應用ELISA試劑盒,設置標準品孔、空白孔及樣品孔,標準品孔加50 μL梯度稀釋的標準品,樣品孔加入50 μL適當稀釋的樣品,振蕩混勻后封板,37 ℃孵育30 min,洗滌液清洗5次,除空白孔外每孔加50 μL酶結合工作液,混勻后封板,37 ℃孵育1 h,洗滌液清洗5次,然后每孔加100 μL顯色液,混勻后37 ℃避光顯色20 min,在標準品孔出現(xiàn)顏色梯度變化時,每孔加50 μL終止液,15 min內在酶標儀上于450 nm處以空白孔調零后測各孔吸光度值(OD值),測定血清樣品中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β和IL-6水平,實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗和秩和檢驗。

2 結果

2.1 2組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和組織學表現(xiàn) 2組大鼠術前神經(jīng)功能缺損評分均為0分;術后24 h,Sham組神經(jīng)功能缺損評分仍為0分,I/R組大鼠神經(jīng)缺損功能評分高于Sham組(P<0.05)。大鼠頭顱MRI及TTC染色結果提示,與Sham組比較,I/R組腦梗死體積明顯增加(P<0.01)(見表1)。

表1 2組大鼠Longa評分和腦梗死體積比較[M(P25,P75)]

光鏡下,Sham組大鼠大腦皮層可見大量神經(jīng)細胞,排列整齊密集,形態(tài)規(guī)則,細胞核完整、大而圓,細胞質豐富;I/R組大鼠缺血側大腦皮層可見神經(jīng)細胞數(shù)量減少,排列雜亂疏松,細胞核深染、固縮、碎裂,細胞質腫脹,部分細胞呈空泡樣改變,大腦皮層明顯水腫(見圖1)。神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積比較和HE染色結果均表明I/R組大鼠模型建立成功。

2.2 2組大鼠大腦皮層MANF和NF-κB p65蛋白表達及亞細胞定位 與Sham組比較,I/R組大鼠缺血側大腦皮層MANF和NF-κB p65蛋白表達均上調(P<0.01和P<0.05)(見表2),I/R組大鼠缺血側大腦皮層MANF、NF-κB p65和CHOP免疫陽性細胞數(shù)均明顯增多(P<0.01)(見表3)。Sham組大鼠大腦皮層MANF(綠色)和NF-κB p65(紅色)主要在細胞質中表達;I/R組大鼠缺血側大腦皮層MANF和p65都發(fā)生了細胞核易位,并共定位于細胞核中(見圖2)。

表2 2組大鼠大腦皮層MANF和NF-κB p65蛋白比較

表3 2組大鼠大腦皮層MANF、NF-κB p65和CHOP免疫陽性細胞數(shù)比較個)

2.3 2組大鼠大腦皮層細胞凋亡情況及炎癥反應 I/R組大鼠腦缺血側大腦皮層細胞凋亡率為(54.80±3.88)%,明顯高于Sham組的(8.23±1.10)%(t=25.82,P<0.01)。I/R組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明顯高于Sham組(P<0.01)(見表4)。

表4 2組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

光鏡下,Sham組大鼠大腦皮層可見大量神經(jīng)細胞,排列整齊密集,形態(tài)規(guī)則,細胞核完整、大而圓,細胞質豐富;I/R組大鼠缺血側大腦皮層可見神經(jīng)細胞數(shù)量減少,排列雜亂疏松,細胞核深染、固縮、碎裂,細胞質腫脹,部分細胞呈空泡樣改變,大腦皮層明顯水腫(見圖1)。神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積比較和HE染色結果均表明I/R組大鼠模型建立成功。

3 討論

Longa改良線栓法[4]是目前CIRI研究中最常用的技術,該方法具有恒定的缺血部位,可用于再灌注,模擬人類永久性和暫時性局灶性腦缺血的不同狀態(tài)[6]。本研究建立I/R組大鼠腦缺血模型,結果顯示,Sham組大鼠神經(jīng)功能正常,頭顱MRI及腦組織TTC染色未見梗死灶,I/R組神經(jīng)功能缺損評分高于Sham組,頭顱MRI及腦組織TTC染色可見明顯腦梗死灶,HE染色可見大腦皮層神經(jīng)細胞數(shù)量減少,排列雜亂疏松,皮層明顯水腫,呈液化性壞死,這些結果均表明局灶性腦梗死灶模型建立成功。

MANF是一種進化保守的新型神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等作用[7-9]。正常生理狀態(tài)下,MANF主要表達在細胞質中,而在自身免疫性疾病和炎癥疾病中,MANF表達上調并且由細胞質轉移至細胞核內發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用[10-11]。NF-κB是一種重要的轉錄調控因子,最常見的是p65和p50異源二聚體結構,在炎癥的起始階段起關鍵的調控作用[12]。NF-κB蛋白進入細胞核,通過結合到特定的DNA位點(κB位點),激活或抑制靶基因的轉錄,促進細胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α等)以及趨化因子(如IL-8、MIP-1α和MCP-1等)基因表達,影響炎癥反應程度和持續(xù)時間[13]。本研究結果顯示,與Sham組相比,I/R組大鼠缺血側大腦皮層MANF與NF-κB p65蛋白含量均增加,免疫組織化學也顯示I/R組大鼠缺血側大腦皮質MANF和NF-κB p65免疫陽性細胞數(shù)明顯增多,表明CIRI促進了腦皮層MANF與NF-κB p65表達的上調,可見抗炎和促炎因素在CIRI時均有所增長。

在正常大鼠的大腦皮層,MANF和NF-κB p65主要表達在細胞質內,本研究中CIRI大鼠腦組織免疫熒光結果顯示,大腦皮層中的MANF與NF-κB P65共定位于細胞核,MANF和NF-κB p65出現(xiàn)了核易位,另外,I/R組大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6表達水平也明顯增加。有研究[14]發(fā)現(xiàn),在CIRI體外實驗中,外源性MANF通過TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制炎癥反應,恢復老年小鼠CIRI后血腦屏障完整性。也有研究[15]表明,內源性和外源性MANF抑制了兔的關節(jié)炎癥,具有抗炎作用。因此,推測發(fā)生CIRI時,如增加MANF表達和核易位,能與易位到細胞核內的NF-κB p65相互作用,發(fā)揮其抗炎作用,減輕CIRI。

內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是內質網(wǎng)內穩(wěn)態(tài)亞細胞損傷的病理過程,也是真核細胞的一種保護性應激反應。諸如缺血再灌注、營養(yǎng)不足、脂質過度負荷、鈣濃度變化以及氧化應激等生理病理情況均能誘導內質網(wǎng)內蛋白質的錯誤折疊,誘發(fā)ERS[16]。CHOP是一種應激誘導的核蛋白,通常被用作ERS的標志物[17-18],ERS可以通過上調CHOP啟動細胞凋亡[19]。有研究發(fā)現(xiàn),在大鼠帕金森模型中,神經(jīng)細胞體外過表達MANF后,CHOP表達降低,神經(jīng)元凋亡減輕,細胞活力提高,表明外源性MANF可以通過抑制ERS對帕金森大鼠黑質紋狀體多巴胺能系統(tǒng)有長期的神經(jīng)保護和神經(jīng)再生作用[20],促進神經(jīng)元的存活[21]。也有研究[22]顯示,在阿爾茲海默病體外試驗中,β淀粉樣蛋白(Aβ)處理特異性MANF基因敲除的神經(jīng)元后,CHOP和cleaved-caspase-3水平明顯升高,TUNEL陽性細胞的數(shù)量也明顯增加,細胞凋亡程度加重,提示內源性MANF在神經(jīng)元通過抑制ERS起抗凋亡作用。本研究中,I/R組大鼠缺血側腦組織MANF和CHOP表達增多,TUNEL陽性細胞的數(shù)量增加,推測在CIRI中,內源性MANF增加可以部分抵消ERS引發(fā)的神經(jīng)元凋亡,緩解CIRI惡化。

綜上,內源性MANF與NF-κB p65及CHOP表達在大鼠體內處于一種動態(tài)平衡,在CIRI中,MANF與NF-κB p65在大腦皮層中表達上調并發(fā)生核易位,可能在細胞核內相互作用,抑制炎癥反應進一步惡化,減輕CIRI。此外,MANF還可能通過抑制ERS,減輕神經(jīng)元凋亡,從而緩解CIRI。