23 株臨床分離單核細胞增生李斯特菌菌株的分子特征*

廖?，|，高碩，張燕，紀靜茹，沈瀚，周萬青，吳超（1.南京醫(yī)科大學鼓樓臨床醫(yī)學院，南京 210008；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院a.檢驗科，b.感染性疾病科，南京 210008）

單核細胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM）是一種在自然界普遍存在的革蘭陽性兼性胞內(nèi)寄生菌，該菌對外界環(huán)境抵抗力強，可在冷藏條件下生存增殖。LM 可經(jīng)被污染的食物傳播導致人畜共患病，造成新生兒、老年人及孕婦等免疫低下人群嚴重感染后果，例如腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)及死胎等［1］。監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，在食源性疾病中李斯特菌病的病死率最高，可達17.6%，且發(fā)病率正不斷增加［2］，逐漸引起公眾的重視。2011 年，我國建立食源性疾病監(jiān)測計劃，而對于李斯特菌病監(jiān)測則是自2013 年開始在部分省份納入監(jiān)測計劃［3-4］。目前我國尚缺乏有關李斯特菌病的多中心、縱向和全國性流行病學研究，關于李斯特菌病發(fā)生的整體信息尚不完整［1］。本研究對23 株臨床分離LM 進行菌株藥物敏感性檢測、血清分型并基于全基因組測序技術分析菌株的毒力基因、耐藥基因、ST 型以及CC 型分布情況以豐富臨床分離菌株分子特征，并為李斯特菌病流行病學研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 從2013 年3 月至2021 年5 月南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科、心胸外科及感染科等多個科室收治的臨床確診為LM 感染住院患者臨床樣本中分離LM 菌株23 株。女19 例，男4 例，年齡25～92 歲。其中，血液樣本20 株、腦脊液樣本2 株、分泌物樣本1 株。采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)及配套GP 鑒定卡對分離菌株進行鑒定，并經(jīng)VITEK MS 質(zhì)譜復核。以金黃色葡萄球菌ATCC29213、肺炎鏈球菌ATCC49619 為藥敏試驗質(zhì)控菌株，上述菌株均為南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科微生物實驗室保存菌株。

1.2 主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)、Bacter／Alert 3D 血培養(yǎng)儀、VITEK MS、GP 鑒定卡、GP67 藥敏卡、FN、FA 培養(yǎng)瓶（法國梅里埃公司），3111 型CO2孵箱、Qubit 熒光分光光度計、M-H 平板、藥敏紙片、哥倫比亞血瓊脂平板（美國Thermo Fisher 公司），T100 PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司），2500 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司），Illumina HiSeq 2000 測序系統(tǒng)（美國Illumina公司），小型高速離心機（Eppendorf 公司）。STM 平板、E-Test 試驗試劑（鄭州安圖公司），2×PCR Premix Taq、DL 2000 Marker（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技公司），AGAROSE G-10 瓊脂糖凝膠（西班牙BIOWEST公司），TBE、磁珠法細菌基因組提取試劑盒（上海生工生物工程公司）。

1.3 菌株藥敏試驗 分別采用E-Test 試驗和紙片擴散法檢測LM 藥物敏感性。其中青霉素、氨芐西林、美羅培南和紅霉素采用E-Test 試驗，復方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、克林霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、頭孢曲松及慶大霉素采用紙片擴散法。參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M45 A3單核細胞增生李斯特菌最低抑菌濃度折點和M100 S32 中葡萄球菌屬的抑菌圈直徑折點進行結(jié)果判讀［5-6］。分別采用肺炎鏈球菌ATCC49619 和金黃色葡萄球菌ATCC29213 作為藥敏試驗質(zhì)控菌株。

1.4 全基因組測序 采用磁珠法提取細菌總DNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。所提取DNA 純度經(jīng)Qubit 熒光分光光度計測定吸光度（A260nm／A280nm）比值在1.8～2.0 之間，并置于-80 ℃保存。委托上海生工生物公司進行全基因組測序。使用Illumina HiSeq 2000 測序系統(tǒng)進行全基因組測序。提取核酸經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及濃度檢測合格后進入文庫構(gòu)建，對樣本DNA 進行雙向測序（paired-end，PE）構(gòu)建450 bp 文庫；對測序結(jié)果進行質(zhì)量剪切后，用SPAdes v3.13.0 軟件（https：／ ／www.patricbrc.org／app／Assembly2）將序列進行拼接，以得到最優(yōu)化組裝結(jié)果。采用RAST tool kit（RASTtk）工具（https：／ ／www.patricbrc.org／app／Annotation）進行基因組注釋。采用GTDB-Tk 軟件進行菌株進化樹分析。獲得的基因測序組裝結(jié)果提交至國家生物信息中心（China National Center for Bioinformation，CNCB），得到序列號（GWHCBGK000 00000-GWHCBGZ00000000，GWHCBHA00000000-GWHCBHG00000000）。

1.5 毒力基因和耐藥基因檢測 使用Center for Genomic Epidemiolog（http：／ ／www.genomicepidemiology.org／；于2022 年7 月3 日訪問）的“毒力”工具檢測所選菌株基因組中的毒力基因。根據(jù)基因存在與否，使用Broad Institute 的Morpheus 矩陣可視化和分析軟件生成熱圖（https：／ ／software.broadinstitute.org／morpheus／；于2022 年9 月3 日訪問）。采用ResFinder-4.1 Sever 檢索耐藥基因攜帶情況（https：／ ／cge.food.dtu.dk／services／ResFinder／；于2022 年7 月3 日訪問），核苷酸最小一致性設定為60%，最小覆蓋設定為90%。

1.6 譜系、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、克隆群（clonal complexes，CCs）分型和血清分型 菌株的序列分型（sequence type，ST）基于全基因組測序結(jié)果，利用MLST 網(wǎng)站（https：／ ／cge.food.dtu.dk／services／MLST／）分析獲得。實驗菌株的CC 分型和譜系均基于全基因組測序結(jié)果，利用BIGSdb-Lm 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／bigsdb.pasteur.fr／listeria／）確定。參照Doumith 等［7］方法，采用多重PCR 擴增LM 血清分型相關基因（lmo0737、lmo1118、ORF2819、ORF2110、prs）。引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。反應體系為50 μL，包括Premix Taq 25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol／L）各1 μL，ddH2O 13 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃3 min；95 ℃40 s，53 ℃60 s，72 ℃60 s，35 個循環(huán)；72 ℃7 min。產(chǎn)物經(jīng)12 g／L 瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物大小及確定菌株血清分型結(jié)果。血清分型結(jié)果判讀：lmo0737和prs均檢出為血清分型1／2a；ORF2819和prs均檢出為血清分型1／2b；ORF2110、ORF2819和prs均檢出為血清分型4b。

表1 血清分型PCR 擴增引物信息

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果 23 株LM 對青霉素、氨芐西林、美羅培南、紅霉素、萬古霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、利奈唑胺及慶大霉素均敏感，對克林霉素、頭孢曲松均耐藥，對四環(huán)素和復方磺胺甲噁唑敏感率均為95.7%（LM3157 對此2 種藥物耐藥）。其中青霉素MIC50和MIC90值分別為0.38 μg／mL 和0.5 μg／mL，氨芐西林MIC50和MIC90值均為0.5 μg／mL，美羅培南MIC50和MIC90值均為0.125 μg／mL，克林霉素MIC50和MIC90值均為0.38 μg／mL。

2.2 毒力基因和耐藥基因結(jié)果 23 株LM 中共檢出89 個不同的毒力基因。1 個分離株有81～88 個毒力基因。所有菌株均攜帶的主要毒力基因包括prfA、ActA、hly、mpl、plcA、plcB、iap，內(nèi)化素基因inlA、inlB、inlC、inlJ以及應激調(diào)控基因sigB。除LM3157和LM5880 外，其余菌株均檢出aut、gtcA、Ami。僅3株檢出vip基因（LM12038、LM11456、LM2516）；13株檢出GadA；5 株缺乏AgrA；12 株存在內(nèi)蛋白基因InlF、Inlk。見圖1。

采用ResFinder-4.1 Sever 數(shù)據(jù)庫檢索耐藥基因攜帶情況，發(fā)現(xiàn)23 株菌株均檢出fosX耐藥基因，其中LM3517 同時攜帶tet（M）和dfrG耐藥基因，基因定位預測分析發(fā)現(xiàn)，上述耐藥基因均存在于菌株染色體上。

2.3 譜系、ST 型、CC 型及血清型分布 23 株LM分屬于2 個譜系（Ⅰ和Ⅱ），以譜系Ⅱ為主，共12 株（52.2%）；分為8 個ST 型，分別為ST8 型9 株（39.1%）、ST3 型、ST87 型和ST451 型各3 株（各13%），ST5 型2 株（8.7%），ST1 型、ST224 和ST515型各1 株（各4.3%）；分為7 個CC 型，包括CC8、CC3、CC87、CC11、CC5、CC1、和CC224，優(yōu)勢CC 型為CC8，共占39.1%（9 株）。見表2。

表2 LM 譜系、分型

經(jīng)多重PCR 擴增及電泳分析顯示，23 株LM被分成3 種血清型，包括1／2a、1／2b 及4b，分別為13 株（56.5%）、8 株（34.8%）和2 株（8.7%）。部分菌株電泳結(jié)果見圖2。

2.4 菌株進化樹分析 采用gtdbtk 軟件對23 株LM 菌株進行進化樹分析，可見23 株LM 菌株基因組進化上分為2 個主要分支。見圖3。

圖3 LM 菌株基因組進化樹圖譜

3 討論

本研究中23 株LM 對氨芐西林、青霉素、美羅培南以及萬古霉素均敏感，與其他報道相一致［8］。因此，臨床疑似LM 感染患者可經(jīng)驗性使用氨芐西林和青霉素，亦可根據(jù)藥敏試驗結(jié)果調(diào)整治療藥物或升級抗生素為美羅培南或萬古霉素。本次藥敏試驗檢出1 株同時對四環(huán)素和復方磺胺甲噁唑耐藥菌株（耐藥率為4.3%），經(jīng)全基因組測序證實耐藥表型分別由tet（M）和dfrG基因介導，提示本院臨床分離LM 耐藥率較低，與其他地區(qū)報道不同［8-9］，可能與地域性差異或與研究菌株來源不同有關。

根據(jù)基因組系統(tǒng)進化，LM 可分為Ⅰ～Ⅳ4 個譜系。其中譜系Ⅰ與LM 臨床感染相關，而譜系Ⅱ多與食品污染密切相關。本次調(diào)查結(jié)果顯示，23 株臨床分離LM 分為譜系Ⅰ（CC87、CC1、CC3、CC5 和CC224）和譜系Ⅱ（CC8 和CC11），其中以譜系Ⅱ為主（12 株，52.1%），表明譜系ⅡLM 也可能是臨床主要流行型別。目前全球流行LM 的CC 型包括CC1、CC3、CC87 和CC8［3，10］，國內(nèi)多見CC8（ST8）［3］。本研究結(jié)果以CC8（ST8）型菌株最多，與報道一致［11］；其他分型包括CC87（ST87）、CC1（ST1、ST515）、CC3（ST3）、CC5（ST5）、CC224（ST224）和CC11（ST451）等在本院亦有檢出，與其他國家或地區(qū)分布有所不同［10-12］，提示臨床分離LM 的CC 型及ST 型具有多樣性及地區(qū)分布差異性。23 株LM分屬1／2a、1／2b 和4b 3 種血清型，其中1／2a 型占比最高（占56.5%），其次為1／2b（占34.8%），與國內(nèi)多地報道相符［13-14］，但與國外血清型分布存在一定差異［10，15］，體現(xiàn)出LM 的遺傳差異性。雖然1／2a型菌株數(shù)占比最高，但分離菌株的患者之間缺乏暴發(fā)證據(jù)，相似的結(jié)論與意大利一項研究相同［16］，表明1／2a 血清型為散發(fā)病例常見的血清型。

有文獻表明inlA和inlB毒力基因分別與LM入侵宿主腸上皮細胞和肝細胞有關；LIPI-1基因（包括ActA、hlyA、mpl、plcA、plcB和prfA）與黏附侵入細胞、在宿主細胞胞漿中運動以及逃逸宿主細胞吞噬等侵襲能力密切相關［17］。本研究中的LM 分離株全部攜帶LIPI-1、inlA和inlB，與文獻報道一致［15］，說明菌株能夠更好適應宿主環(huán)境并且具有較強的致病潛力。由inlC和inlJ基因編碼的內(nèi)化蛋白inlC 和inlJ 均與腸道感染相關［18］，Iap編碼p60 細胞外蛋白，與LM 在細胞內(nèi)運動和細胞間擴散有關［19］。本研究中所有菌株均檢出上述3 種基因，而從各種食品和環(huán)境分離的菌株亦攜帶上述基因［18-19］。因此，食用被此類菌株污染的食品可能是人類患李斯特菌病的重要風險因素。耐藥基因的發(fā)現(xiàn)有助于指導臨床抗菌藥物的選擇，本研究中所有菌株均攜帶fosX耐藥基因，與既往文獻相符［20］，其介導磷霉素耐藥，故而對于LM 感染患者不建議使用磷霉素治療。

本研究通過對臨床分離LM 菌株血清分型以及基于全基因組測序技術的毒力因子、耐藥基因、ST 型及CC 型分布進行分析，豐富了臨床分離LM分子特征的多樣性，亦為臨床防治LM 感染及其分子流行病學研究提供了重要基礎數(shù)據(jù)。但由于樣本量局限性，本研究未能明確LM 分離株相關毒力基因和耐藥基因與分型之間的關系，后續(xù)將加大樣本量進一步探究。