基于UPLC／LTQ Orbitrap Velos MS 的創(chuàng)傷性腦損傷代謝組學分析*

周惠惠，程桂青，田璐，周愿，李洪春，2（.徐州醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)學院，江蘇徐州 22004；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 22002）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是由外力作用而導致的腦部損傷，具有較高的死亡率和致殘率，是嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一［1］。格拉斯哥昏迷評分（glasgow coma scale，GCS）等認知測試具有快速、低成本、無創(chuàng)、易于應用的特點，但由于受檢查者的主觀判斷影響，通常只作為TBI 的篩查方法［2-3］。顱腦創(chuàng)傷患者腦監(jiān)測技術(shù)中國專家共識［4］指出，強烈推薦影像學檢查作為首選輔助檢查，推薦腦生物學標志物檢測，如膠質(zhì)纖維酸性蛋白和泛素羧基末端水解酶L1 用于識別輕度TBI 患者［5］。但影像學技術(shù)費用昂貴，且使許多患者暴露于不必要的電離輻射，增加急診科的負擔［6］，故而開發(fā)新的血清生物學標志物有助于提高臨床決策規(guī)則的作用。本研究旨在利用非靶向和靶向代謝組學方法探索新的TBI 潛在生物學標志物，用于輔助早期診斷、判斷病情及預后，并加深對TBI 代謝改變的認識，以期尋找治療靶點。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2022年8 月至12 月就診的TBI 患者（TBI 組）和體檢健康者（健康人對照組）各40 例進行非靶向分析篩選和靶向分析驗證。TBI 患者GCS 評分在入院12 h內(nèi)根據(jù)睜眼反應、語言反應和運動反應3 個方面進行評估，分為重型（3～8 分，n＝19），中型（9～12 分，n＝13）和輕型（13～15 分，n＝8）；格拉斯哥預后評分（glasgow outcome scale，GOS）在患者傷后6 個月進行評估，分為預后不良組（1～3 分，n＝27）和預后良好組（4～5 分，n＝13）。收集所有受試者的一般信息和實驗室檢測指標等臨床資料。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準（XYFY2022-KL373-02），所有受試者均知情同意。

1.2 儀器與試劑 Acquity 高效液相色譜儀（美國Waters 公司），LTQ Orbitrap Velos 高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司），5430R 離心機（德國Eppendorf 公司）。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相中A 相：水（含0.1%甲酸+2%乙腈），B 相：乙腈（含0.1%甲酸+2%水）；柱溫：45 ℃；流速：0.2 mL／min；流動相梯度體系：0 min，5% B；0～15 min，5%～95% B；15～15.2 min，95%～5% B；15.2～20 min，5% B。乙腈、甲醇（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 樣本制備 規(guī)范采集TBI 患者創(chuàng)傷12 h 內(nèi)及6 個月后的空腹靜脈血標本，4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，移取100 μL 上清液置于1.5 mL 離心管中，加入300 μL 蛋白質(zhì)沉淀劑（甲醇∶乙腈體積比＝2 ∶1）渦旋震蕩1 min，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，取上清液300 μL 置于離心濃縮儀中干燥，加入100 μL 乙腈∶水（體積比＝1∶1）復溶，13 000 r／min 離心10 min，取上清加入進樣小瓶，用于質(zhì)譜檢測。

1.4 質(zhì)譜檢測 超高效液相色譜-線性離子阱／靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜（UPLC／LTQ Orbitrap Velos MS）步驟：進樣量為5 μL，載氣為氮氣，流速恒定為0.2 mL／min，柱溫為45 ℃。MS 設(shè)置：DDA 模式，電噴霧毛細管電壓（正離子為2.5 kv；負離子為1.5 kv），毛細管溫度為320 ℃，掃描范圍為70～1 000 m／z，錐孔電壓為25 V，錐空氣流速為50 L／h，最大進樣時間為100 ms，動態(tài)排除為50 s，MS 分辨率為30 000，MS2 分辨率為17 500。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析 采用MS-DIAL 5.0軟件對原始光譜進行數(shù)據(jù)預處理獲得峰強度矩陣，將數(shù)據(jù)導入SIMCA 14.1 軟件進行多元變量統(tǒng)計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），交叉驗證采用R2X、R2Y、Q2等參數(shù)評價OPLS-DA模型質(zhì)量，通過200 次置換檢驗評價模型擬合程度。設(shè)置單變量統(tǒng)計分析t檢驗中P＜0.05 和倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）＞2 或＜0.5，OPLS-DA 變量投影重要度（variable influence on projection，VIP）＞1，作為差異代謝物篩選條件。用MetaboAnalyst 5.0軟件將差異代謝物導入京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進行差異代謝物富集通路分析和分層聚類。采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，計數(shù)資料以n和%表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般臨床特征和生化指標分析TBI 組血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖水平顯著高于健康人對照組，前清蛋白、總蛋白、清蛋白、球蛋白、肌酐、尿酸、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平顯著低于健康人對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組受試者年齡、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素和三酰甘油之間的差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 TBI 組和健康人對照組一般臨床特征和生化指標

2.2 兩組代謝模式對比結(jié)果 根據(jù)峰強度進行PCA 和OPLS-DA 分析。PCA 分析顯示（圖1A、1B）兩組樣本代謝物存在顯著差異，陽離子模式R2X（cum）和Q2分別為0.831 和0.621；陰離子模式R2X（cum）和Q2分別為0.971 和0.996。OPLS-DA分析顯示組間存在顯著差異（圖1C、1D），陽離子模式R2X（cum）＝0.808，R2Y（cum）＝0.942，Q2＝0.754；陰離子模式R2X（cum）＝0.939，R2Y（cum）＝0.936，Q2＝0.874。200 次置換試驗（圖1E、F）陽離子模式R2Y和Q2分別為0.203 和-0.479，陰離子模式R2Y和Q2分別為0.319 和-0.364?；鹕綀D用于反映血清中差異代謝物的總體分布情況，見圖2。

圖1 TBI 組與健康人對照組代謝譜

圖2 TBI 組與健康人對照組差異代謝物火山圖

2.3 TBI 患者差異代謝物的篩選結(jié)果 根據(jù)VIP＞1、P＜0.05、FC＞2 或＜0.5 篩選出74 個差異代謝物，選擇豐度變化最大的前50 個差異代謝物繪制熱圖，觀察代謝物的全局表達量和聚類關(guān)系。見圖3。

圖3 TBI 組與健康人對照組差異代謝物熱圖

2.4 TBI 患者差異代謝物KEGG 富集通路分析結(jié)果表明，與健康人對照組相比，TBI 組存在6 個顯著代謝富集通路，分別為：（1）不飽和脂肪酸生物合成；（2）氨酰基-tRNA 生物合成；（3）精氨酸生物合成；（4）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；（5）檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）；（6）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。見圖4。

圖4 TBI 組與健康人對照組代謝富集通路分析

2.5 TBI 患者候選生物學標志物的篩選和驗證將74 個差異代謝物繪制ROC 曲線，根據(jù)AUCROC＞0.7 篩選出14 個候選生物學標志物，再對所有血清樣本進行靶向定量分析，最終明確谷氨酸、乳酸、尿酸和肌酐與非靶向代謝結(jié)果一致。見表2。

表2 TBI 組和健康人對照組候選生物學標志物篩選結(jié)果

2.6 不同嚴重程度TBI 組與健康人對照組差異代謝物水平比較 TBI 組不同嚴重程度的血清谷氨酸和乳酸水平均顯著高于健康人對照組，尿酸和肌酐水平均顯著低于健康人對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；隨著TBI 病情加重，患者血清谷氨酸和乳酸濃度逐漸升高，尿酸和肌酐濃度逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同嚴重程度TBI 組與健康人對照組差異代謝物水平比較

2.7 預后良好組與預后不良組差異代謝物水平比較 預后不良組血清谷氨酸和乳酸濃度高于預后良好組，尿酸和肌酐濃度低于預后良好組（P＜0.05）。見表4。

表4 TBI 患者預后良好組與預后不良組差異代謝物水平比較

2.8 相關(guān)性分析結(jié)果 40 例TBI 患者Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果見表5。其中谷氨酸和乳酸水平與入院12 h 的GCS 評分和傷后6 個月的GOS 評分呈負相關(guān)，而尿酸和肌酐與其呈正相關(guān)（P＜0.05）。

表5 TBI 患者Pearson 相關(guān)性分析（r）

2.9 影響預后不良的ROC 曲線分析 谷氨酸、乳酸、尿酸、肌酐單項和四者聯(lián)合的代謝物組AUCROC分別為0.691、0.732、0.688，0.677 和0.818，聯(lián)合檢測提高了預測TBI 預后不良的敏感性（76.9%）和特異性（81.5%）。見表6。

表6 谷氨酸、乳酸、尿酸和肌酐預測預后不良的ROC 曲線模型參數(shù)

3 討論

TBI 機制復雜多樣，與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系尚未闡明，不同嚴重程度的TBI 也需要不同的治療策略。目前TBI 的檢測主要依賴于影像學，但存在早期漏檢的問題。本研究以血清樣本為研究對象，探討了TBI 患者代謝譜的差異，結(jié)果證實谷氨酸、乳酸、尿酸、肌酐為可靠的差異代謝物，不飽和脂肪酸的生物合成是TBI 受影響最大的代謝富集通路，并將代謝物與病情嚴重程度和預后聯(lián)系起來。筆者選擇了40 例TBI 患者，將其按照入院12 h GCS評分和傷后6 個月GOS 評分進行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4 種差異代謝物在不同嚴重程度和預后的患者之間也存在差異，四者聯(lián)合預測預后的AUCROC為0.818，敏感性和特異性分別為76.9%和81.5%。

谷氨酸和乳酸是糖類代謝的重要中間產(chǎn)物。TBI 后腦組織損傷中斷大腦有氧氧化過程，導致機體代償性生成谷氨酸和乳酸。谷氨酸與草酰乙酸轉(zhuǎn)氨基生成α-酮戊二酸，維持三羧酸循環(huán)能量供應［7］，并轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺進入神經(jīng)元，參與神經(jīng)傳遞［8］；另一方面，谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸大量釋放后激活相應的N-甲基-D-天冬氨酸受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體，介導鈣流入神經(jīng)元調(diào)控蛋白的信號轉(zhuǎn)導和磷酸化／去磷酸化，導致線粒體功能障礙和神經(jīng)元凋亡［9-10］；同時鈣促進活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生激活了磷脂酶A2 介導的炎癥反應［11］。有文獻報道大量谷氨酸的興奮性毒性是導致進行性神經(jīng)功能衰退的重要因素［12］；另有研究表明，外源性乳酸可能成為腦損傷和神經(jīng)退行性疾病的潛在治療干預手段［13-14］。本研究中TBI 患者谷氨酸和乳酸升高，且隨著病情加重逐漸增加，谷氨酸的神經(jīng)毒性可能繼發(fā)一系列神經(jīng)退行性改變，乳酸對抗腦損傷引起的腦水腫、腦細胞死亡和神經(jīng)代謝異常，故而在創(chuàng)傷早期提高血清乳酸水平可能緩解早期腦水腫癥狀，預防損傷進一步發(fā)生。

尿酸和肌酐是人體內(nèi)的抗氧化劑，具有對抗氧化應激保護神經(jīng)，激活神經(jīng)干細胞增殖，參與神經(jīng)損傷修復的作用［15］。He 等［16］發(fā)現(xiàn)TBI 患者和腦腫瘤手術(shù)患者血清尿酸水平均下降，且下降水平與GCS 評分相關(guān)；還有研究表明，帕金森患者血清尿酸水平隨著疾病的進展而下降［17］；Zheng 等［18］發(fā)現(xiàn)血清尿酸和肌酐聯(lián)合其他預后因素可幫助預測男性TBI 患者的預后；此外，另有研究證實血清肌酐水平與全因癡呆相關(guān)［17］。上述研究與本研究結(jié)果相一致，TBI 患者血清尿酸和肌酐水平低于健康人對照組，且病情越嚴重，尿酸和肌酐水平越低，與入院12 h GCS 評分和傷后6 個月GOS 評分呈正相關(guān)，生化結(jié)果也一致顯示尿酸水平降低，因此聯(lián)合測定肌酐和尿酸水平對創(chuàng)傷后評價腎臟功能、疾病嚴重程度及預防并發(fā)癥具有重要意義。曹朝梁［19］研究認為TBI 后血尿酸升高且隨著嚴重程度增加，尿酸水平越高，患者預后越差。與本研究結(jié)果相反，但具體原因有待收集更多樣本進一步驗證。

本研究存在以下不足之處：首先，TBI 的診斷是基于臨床癥狀和影像技術(shù)，可能會遺漏低能損傷患者；其次，腦脊液是反映血腦屏障破壞最理想樣本，由于是有創(chuàng)操作，本實驗僅收集血清樣本進行代謝組學分析，后續(xù)將擴大樣本量并收集多元化樣本進行比較。