腦脊液IL-6、IL-10 和TNF-α 檢測(cè)在開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染診療中的臨床價(jià)值*

潘欣芳，迪娜·海沙爾，曲波，周紹波，趙鴻梅（中國醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院＆ 遼寧省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110016）

神經(jīng)外科手術(shù)后發(fā)生顱內(nèi)感染是降低手術(shù)效果、延長(zhǎng)住院時(shí)間、增加病死率的重要原因［1］，主要由細(xì)菌、真菌、病毒、結(jié)核桿菌等病原體入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起。在顱內(nèi)感染發(fā)生早期，各種病原體引起的臨床癥狀和體征相似，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)如白細(xì)胞數(shù)（white blood cell count，WBC）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）等難以明確顱內(nèi)感染的病原體。目前，病原學(xué)培養(yǎng)仍是顱內(nèi)感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)陽性率低，不能快速診斷顱內(nèi)感染的發(fā)生。PCR 檢測(cè)能對(duì)病原體基因或特定核酸序列在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增，具有極高的檢測(cè)靈敏度和特異性，使難培養(yǎng)病原體的檢測(cè)變得迅速又準(zhǔn)確，但由于腦脊液（CSF）樣本的污染，具有較高的假陽性率，加之檢測(cè)方法復(fù)雜、價(jià)格昂貴，限制了其在臨床上的應(yīng)用。宏基因二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）可直接測(cè)定病原體的核酸序列，實(shí)現(xiàn)臨床精準(zhǔn)診療，但其價(jià)格昂貴且無統(tǒng)一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，暫不適合用于常規(guī)感染的初步篩查。有研究發(fā)現(xiàn)［2-3］，CSF 細(xì)胞因子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)患感染性疾病的早期診斷及鑒別診斷至關(guān)重要。本研究回顧性分析了我院收治的開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染患者CSF 和血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α以及炎癥標(biāo)志物WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)、總蛋白（total protein，TP）、PCT 水平，以期為開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的早期診斷、監(jiān)測(cè)及預(yù)后提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021 年4 月至2022 年4 月在遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)外科開顱手術(shù)后細(xì)菌性顱內(nèi)感染患者（自發(fā)性腦出血33 例、顱腦外傷性腦出血4 例、顱腦良性腫瘤9 例、周圍神經(jīng)病變9 例）55例作為感染組，男25 例，女30 例，年齡（58.4±12.4）歲。顱內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國傳染病學(xué)會(huì)（IDSA）的醫(yī)療保健相關(guān)腦室炎和腦膜炎臨床實(shí)踐指南定義［4］，當(dāng)患者符合以下任一診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，即可診斷為細(xì)菌性顱內(nèi)感染：（1）CSF 培養(yǎng)陽性；（2）以下臨床癥狀中的至少一種不能用其他原因解釋（體溫＞38 ℃、頭痛、腦膜征、局灶性神經(jīng)損傷）且滿足以下任意一條：①CSF 中WBC＞100 個(gè)／mm3，蛋白質(zhì)＞50 mg／dL 和／或葡萄糖＜2.5 mmol／L；②CSF 革蘭染色陽性；③血培養(yǎng)陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院前患有其他感染性疾病；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并免疫系統(tǒng)疾??；（4）精神異常。依據(jù)重癥顱內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］將感染組分為輕癥感染組（25 例）和重癥感染組（30 例）；依據(jù)擴(kuò)展格拉斯哥預(yù)后量表（Glasgow Outcome Scale-Extended，GOSE）［6］分為預(yù)后良好組（GOSE 評(píng)分為5～8 分）31 例、預(yù)后不良組（GOSE 評(píng)分為1～4 分）24 例。細(xì)菌性顱內(nèi)感染患者CSF 培養(yǎng)分離菌株如下：表皮葡萄球菌3 株、頭狀葡萄球菌3 株，金黃色葡萄球菌2 株，屎腸球菌1 株，鮑曼不動(dòng)桿菌6 株，皮特不動(dòng)桿菌3 株，肺炎克雷伯桿菌3 株，腸桿菌2 株，銅綠假單胞菌1株，其余31 例培養(yǎng)陰性。選取同時(shí)期開顱術(shù)后未發(fā)生顱內(nèi)感染的患者（自發(fā)性腦出血18 例、顱腦良性腫瘤12 例、周圍神經(jīng)病變17 例、腦梗死5 例、腦積水5 例）57 例作為未感染組，男22 例，女35 例，年齡（54.1±10.3）歲；另選取未手術(shù)的非感染性疾病（脊髓病2 例、吉蘭—巴雷綜合征3 例、周圍神經(jīng)病變6 例、腦梗死5 例、腦積水2 例、癲癇1 例、阿爾茲海默癥1 例）患者20 例作為對(duì)照組，男11 例，女9 例，年齡（56.0±18.1）歲。3 組研究對(duì)象性別、年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.766，P＞0.05和F＝1.567，P＞0.05）。本研究獲得遼寧省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2022KS007），患者及家屬知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司），Cobas e601 電化學(xué)發(fā)光分析儀、Cobas c702 全自動(dòng)生化分析儀（德國Roche 公司），XN-2000 血細(xì)胞分析儀（日本Sysmex 公司）。IL-6、IL-10、TNF-α 檢測(cè)試劑盒（廣州微米公司），PCT 檢測(cè)試劑盒、腦脊液總蛋白檢測(cè)試劑盒（德國Roche公司），XN-2000 血細(xì)胞分析儀配套檢測(cè)試劑盒（日本Sysmex 公司）。

1.3 標(biāo)本收集 開顱手術(shù)患者均在術(shù)后24 h 內(nèi)、對(duì)照組在頭痛等癥狀出現(xiàn)時(shí)（無菌操作）行局部麻醉腰椎穿刺術(shù)，收集患者CSF 3 mL 于無菌試管中，1 500×g離心5 min，同時(shí)采集3 mL 靜脈血于無抗凝劑管中，1 610×g離心5 min，將CSF 上清和血清分裝于EP 管中，置于-70 ℃保存，所有標(biāo)本收集均在2 h 以內(nèi)完成。

1.4 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 IL-6、IL-10、TNF-α 細(xì)胞因子測(cè)定 采用流式熒光技術(shù)測(cè)定CSF 和血清中IL-6、IL-10、TNF-α 含量，檢測(cè)上、下限分別為2 500 pg／mL 和2.5 pg／mL，參考區(qū)間分別為0～5.30 pg／mL、4.91 pg／mL 和4.60 pg／mL。

1.4.2 PCT 測(cè)定 采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定CSF 和血清中PCT 含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。PCT 參考區(qū)間為0～0.05 ng／mL。

1.4.3 WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)測(cè)定 采用儀器法檢測(cè)CSF 中WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)，均按照試劑盒說明書操作。WBC 參考區(qū)間為（0～5）×106／L。

1.4.4 TP 測(cè)定 采用比濁法測(cè)定CSF 中TP 含量，按照試劑盒說明書操作。TP 參考區(qū)間為0.15～0.45 g／L。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件分析所有數(shù)據(jù)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，計(jì)量資料兩獨(dú)立樣本比較用t檢驗(yàn)，3 組樣本比較用單因素ANOVA 檢驗(yàn)，率的比較用χ2檢驗(yàn)，如不符合正態(tài)分布，則應(yīng)用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，3 組樣本比較采用K-W 檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test），兩獨(dú)立樣本比較采用M-WU檢驗(yàn)（Mann-WhitneyUtest），采用Spearman 相關(guān)分析CSF 與血清中IL-6、IL-10 和TNF-α 水平的相關(guān)性，采用ROC 曲線計(jì)算各指標(biāo)的曲線下面積（area under curve，AUCROC）、最佳診斷界值（cut-off）及其敏感性、特異性，采用二元Logistic 回歸分析各指標(biāo)預(yù)測(cè)概率并計(jì)算多指標(biāo)的聯(lián)合診斷性能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CSF 和血清中各項(xiàng)指標(biāo)水平比較結(jié)果感染組、未感染組和對(duì)照組之間CSF 和血清中各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），見表1。兩組間比較結(jié)果顯示，感染組CSF和血清中各項(xiàng)指標(biāo)水平均高于未感染組（Z分別為-8.298、-6.703、-4.907、-5.731、-7.980、-8.186、-4.721、-2.465、-2.884、-4.962，P均＜0.05）和對(duì)照組（Z分別為-6.557、-6.554、-5.020、-4.182、-6.594、-6.608、-3.397、-5.529、-2.229、-3.738，P均＜0.05），未感染組CSF IL-6、IL-10、TNF-α、WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)、TP 及血清IL-10 水平亦顯著高于對(duì)照組（Z分別為-5.669、-4.735、-2.098、-6.023、-5.933、-2.423、-4.904，P均＜0.05）。

2.2 感染組CSF 與血清IL-6、IL-10、TNF-α 水平比較及其相關(guān)性 感染組CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平均顯著高于血清水平（Z分別為-8.984、-7.966、-2.424，P均＜0.05）。Spearman 相關(guān)分析顯示，CSF與血清中各細(xì)胞因子水平的相關(guān)性不顯著（r分別為0.123、0.210、0.173，P均＞0.05）。

2.3 CSF 和血清IL-6、IL-10、TNF-α 及PCT 水平與感染嚴(yán)重程度、預(yù)后及菌株類型的關(guān)系 重癥感染組CSF IL-6、IL-10、TNF-α、PCT 及血清IL-6、PCT 水平均顯著高于輕癥感染組（Z分別為-3.842、-3.905、-3.085、-4.159、-2.941、-2.603，P均＜0.05），預(yù)后不良組CSF IL-6、IL-10、TNF-α、PCT 及血清IL-6、PCT 水平均高于預(yù)后良好組（Z分別為-4.401、-4.464、-3.471、-4.820、-2.698、-2.444，P均＜0.05），見表2。感染G-細(xì)菌組CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平［18 448.04（17 573.62，19 369.70）、51.81（25.77，415.95）、10.78（4.11，14.87）］ pg／mL 顯著高于感染G+細(xì)菌組［15 702.76（2 054.45，16 085.28）、23.35（7.63，45.37）、3.11（1.91，4.98）］ pg／mL 和CSF 培養(yǎng)陰性組［16 743.85（8 162.99，17 860.01）、14.25（9.16，23.93）、2.03（1.66，5.61）］ pg／mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z分別為-3.855、-2.117、-2.475，P均＜0.05；Z分別為-3.381、-3.937、-3.163，P均＜0.05），而感染G+細(xì)菌組與CSF 培養(yǎng)陰性組之間各項(xiàng)指標(biāo)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 感染組患者不同病情、不同預(yù)后CSF 和血清IL-6、IL-10、TNF-α、PCT 水平比較［M（P25，P75）］

2.4 各項(xiàng)指標(biāo)診斷開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的ROC 曲線分析 以未感染組和對(duì)照組為對(duì)照，繪制CSF（圖1A）和血清（圖1B）各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)診斷開顱手術(shù)顱內(nèi)感染的ROC 曲線。CSF IL-6、IL-10、TNF-α診斷開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的AUCROC均大于血清中相應(yīng)的細(xì)胞因子（P＜0.05）；CSF IL-6、IL-10、WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)的AUCROC分別為0.966、0.901、0.954和0.962，均大于0.900，其中CSF IL-6 的AUCROC最高，敏感性和特異性分別為92.7%和89.6%；在傳統(tǒng)炎癥標(biāo)志物中，CSF 中性粒細(xì)胞數(shù)的AUCROC最高（P＜0.05），為0.949，敏感性和特異性分別為94.5%和80.7%；聯(lián)合檢測(cè)CSF IL-6、IL-10、WBC 和中性粒細(xì)胞數(shù)（圖1C）診斷開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的AUCROC可提升至0.976，見表3。

圖1 各項(xiàng)指標(biāo)診斷開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的ROC 曲線

表3 各項(xiàng)指標(biāo)診斷開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的效能評(píng)價(jià)

3 討論

隨著無菌術(shù)和抗菌術(shù)的不斷發(fā)展使開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的發(fā)生率顯著降低，但仍有0.8%～8.9%的發(fā)生率［7］，術(shù)后一旦發(fā)生顱內(nèi)感染，會(huì)使患者病情惡化，住院時(shí)間延長(zhǎng)，病死率升高。當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染后，細(xì)菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在局部釋放菌體蛋白質(zhì)等炎性成分，可刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子，故而細(xì)胞因子對(duì)顱內(nèi)感染患者的免疫反應(yīng)具有重要影響。

本研究結(jié)果表明，感染組CSF IL-6、IL-10、TNF-α水平均顯著高于未感染組和對(duì)照組（P＜0.05），其水平升高可能與顱內(nèi)感染后患者免疫系統(tǒng)被病原菌釋放的絲裂原等激活，致使IL-6、IL-10、TNF-α 等多種細(xì)胞因子被大量釋放出來，促使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈且持久的免疫應(yīng)答有關(guān)。此外，未感染組CSF IL-6、IL-10、TNF-α 和中性粒細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組（P＜0.05），表明開顱手術(shù)引起的炎癥反應(yīng)會(huì)使CSF 中性粒細(xì)胞增加，繼而導(dǎo)致CSF IL-6、IL-10和TNF-α 濃度升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，感染組患者CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平均高于血清中的水平（P＜0.05），說明顱內(nèi)感染時(shí)細(xì)胞因子是由神經(jīng)細(xì)胞如星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，而不僅僅是血液來源，CSF 細(xì)胞因子檢測(cè)能更早反應(yīng)顱內(nèi)感染的發(fā)生。感染組患者CSF 與血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α 水平的相關(guān)性均不顯著（P＞0.05），說明顱內(nèi)局部產(chǎn)生的IL-6、IL-10、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子不易透出血腦屏障進(jìn)入血液，血清細(xì)胞因子檢測(cè)不能替代CSF 細(xì)胞因子檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)重癥顱內(nèi)感染患者CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平顯著高于輕癥顱內(nèi)感染患者（P＜0.05），與以往的報(bào)道相一致［8-9］；預(yù)后不良患者CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平顯著高于預(yù)后良好患者（P＜0.05），提示CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平與顱內(nèi)感染的嚴(yán)重程度及患者的預(yù)后情況密切相關(guān)，其主要機(jī)制是機(jī)體受到炎癥刺激后炎癥細(xì)胞被大量激活，從而促進(jìn)體內(nèi)大量促炎因子（如IL-6、TNF-α）釋放并相互作用，加重患者病情；另外炎癥刺激后可啟動(dòng)代償性抗炎反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而刺激抗炎因子IL-10 不斷釋放，而大量的IL-10 會(huì)引起免疫系統(tǒng)失衡，抑制細(xì)胞功能，導(dǎo)致過度抗炎反應(yīng)，從而加重病情，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。本研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性顱內(nèi)感染患者CSF 培養(yǎng)陽性率為43.6%（24／55），顯著高于曹藝耀等［10］報(bào)道的27.7%，其余31 例CSF 培養(yǎng)陰性，可能是檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)不足、操作不當(dāng)、預(yù)防性抗生素的使用等原因造成的。其中G+菌占37.5%（9／24），G-菌占63.5%（15／24），以G-菌感染為主，與熊自超等［11］研究結(jié)果一致。G-菌感染組CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平顯著高于G+菌感染組和CSF 培養(yǎng)陰性組（P＜0.05），其機(jī)制可能是G-菌入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，其胞壁肽和內(nèi)毒素刺激單核-巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等釋放大量的IL-6、IL-10、TNF-α，從而導(dǎo)致CSF IL-6、IL-10、TNF-α 水平的升高。

PCT 是一類非特異性炎癥介質(zhì)，在正常人體內(nèi)通常檢測(cè)不到或含量甚微。當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，多種細(xì)菌成分可刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)PCT 大幅升高，而病毒感染或非感染性疾病時(shí)正?；蜉p微升高，可用于鑒別細(xì)菌性和其他類型的顱內(nèi)感染［12］。本研究中感染組CSF 和血清PCT 水平顯著高于未感染組和對(duì)照組，而在未感染組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與劉美等［13］研究結(jié)果一致，但仍有18.2%（10／55）、20.0%（11／55）的患者存在假陰性結(jié)果。因此，CSF 和血清PCT 水平顯著增加可能表明感染的發(fā)生，但正常的PCT 水平不能排除感染的發(fā)生。CSF 中WBC、中性粒細(xì)胞水平被認(rèn)為是鑒別細(xì)菌性顱內(nèi)感染與病毒性顱內(nèi)感染的重要標(biāo)志，一般中性粒細(xì)胞升高表明細(xì)菌感染。在本研究中，感染組CSF WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于未感染組，并且診斷細(xì)菌性顱內(nèi)感染的AUCROC僅次于CSF IL-6，說明CSF WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)在細(xì)菌性顱內(nèi)感染的診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，仍有11.7%（9／77）、14.3%（11／77）未感染患者的WBC 和中性粒細(xì)胞數(shù)存在假陽性結(jié)果，可能導(dǎo)致臨床誤診而過度治療。

ROC 曲線分析表明，CSF IL-6 診斷開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的AUCROC最高，當(dāng)CSF IL-6 水平超過2 702.91 pg／mL 時(shí)，敏感性和特異性分別為92.7%和89.6%，與García-Hernández 等［14］研究結(jié)果一致。進(jìn)一步聯(lián)合CSF IL-6、IL-10、WBC 和中性粒細(xì)胞數(shù)可將AUCROC提高至0.976?？梢娡ㄟ^聯(lián)合檢測(cè)CSF 細(xì)胞因子IL-6、IL-10 和傳統(tǒng)炎癥標(biāo)志物WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)可進(jìn)一步提高對(duì)開顱手術(shù)后顱內(nèi)感染的診斷價(jià)值。

本研究的局限性主要在于樣本量較少，部分樣本在送檢前已經(jīng)使用抗生素等影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，本研究為一項(xiàng)橫斷面研究，筆者僅研究了生物學(xué)標(biāo)志物與開顱手術(shù)后細(xì)菌性顱內(nèi)感染之間的關(guān)聯(lián)，但沒有對(duì)患者進(jìn)行隨訪以確定長(zhǎng)期結(jié)果。未來希望可以擴(kuò)大樣本量，并通過縱向研究對(duì)上述生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行分析，使研究結(jié)果更準(zhǔn)確，應(yīng)用范圍更廣。