氫離子通過(guò)mTOR 通路抑制CD8+T 細(xì)胞功能*

馬麗，黃玲，朱棟煒（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院＆南京市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 0003；.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 03）

由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著極為重要的角色［1］。其中CD8+T 細(xì)胞作為主要的效應(yīng)細(xì)胞，是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，在識(shí)別和清除受感染或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及抗腫瘤過(guò)程中具有重要的作用［2-3］。研究表明，以酸性、缺氧為特征的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是T 細(xì)胞增殖、分化、浸潤(rùn)和功能發(fā)揮的關(guān)鍵障礙［4-6］。本研究擬通過(guò)改變培養(yǎng)基的pH 值，探究TME 中主導(dǎo)酸性環(huán)境的氫離子（H+）對(duì)CD8+T 細(xì)胞的增殖及效應(yīng)功能的影響，旨在闡明酸性TME 抑制T 細(xì)胞抗腫瘤免疫的原因。同時(shí)探究H+對(duì)CD8+T 細(xì)胞中哺乳動(dòng)物雷帕霉素（Rapamycin）靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路的影響，揭示了酸性TME 抑制CD8+T 細(xì)胞抗腫瘤免疫的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）購(gòu)自上海澳賽爾斯生物公司，細(xì)胞培養(yǎng)基RMPI-1640（南京福麥斯生物技術(shù)公司），青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶（上海碧云天生物科技公司），非必需氨基酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、丙酮氨酸、HEPES 緩沖液、β-巰基乙醇、Page Ruler Protein Ladder 預(yù)染蛋白質(zhì)marker、RIPA 細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、胎牛血清（美國(guó)賽默飛公司），PeproTech重組人IL-2、β-actin 單克隆抗體（美國(guó)派普泰克公司），RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒（美國(guó)普洛麥格生物技術(shù)公司），PCR 引物合成（美國(guó)金唯智生物科技公司），SDS 凝膠配制試劑盒（北京索萊寶科技公司），PVDF 膜（美國(guó)默克密理博公司），兔抗人p-AKT（Ser473）抗體、兔抗人AKT 抗體、兔抗人p-S6（Ser240／244）抗體、兔抗人S6 抗體、CD8 免疫磁珠（美國(guó)CST 公司），流式抗體FITC anti-Human-CD8、PE-TNF-α、APC-IFN-γ 及激活抗體Human anti-CD3 和Human anti-CD28（北京Biolegend 公司）。LSR Fortessa 分析型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 醫(yī)療器械公司），Roche LC480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司），164-5052HC 高流電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），F(xiàn)E28pH 酸度計(jì)（美國(guó)梅特勒托利多公司），Countess ⅡAutomated Cell Counter細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、NanoDrop One 微量核酸檢測(cè)儀（美國(guó)賽默飛公司）。

1.2 方法

1.2.1 CD8+T 細(xì)胞的分選 取上述PBMC，加入500 μL 分選緩沖液混勻，再加入200 μL CD8 免疫磁珠，混勻后4 ℃避光反應(yīng)30 min，預(yù)冷PBS 洗滌后，1 300 r／min 離心5 min，棄上清，用500 μL PBS重懸細(xì)胞并過(guò)柱。PBS 洗滌分選柱，將分選柱移出磁場(chǎng)，收集洗液即為CD8+T 細(xì)胞。使用FACS 緩沖液（含2% BSA 的PBS）配制FITC anti-Human CD8（1 ∶300稀釋）染液，冰上染色30 min，用FACS 緩沖液洗滌細(xì)胞，收集純度為89%～92%的CD8+T 細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 使用含10%FBS、1%抗生素（青霉素-鏈霉素）、1%非必需氨基酸、1% L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1 mmol／L 丙酮氨酸、0.1 mol／L HEPES 緩沖液、50 μmol／L β-巰基乙醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)CD8+T 細(xì)胞，同時(shí)加入重組人IL-2（100 U／mL）。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行常規(guī)換液、傳代。采用0.1 mol／L HEPES 緩沖液進(jìn)行緩沖，培養(yǎng)過(guò)程中每24 h 更換1 次培養(yǎng)基，并進(jìn)行以下分組。對(duì)照組：pH 值為7.2～7.4；pH 6.7 組：在對(duì)照組培養(yǎng)基中加入濃度為2 mol／L HCl，經(jīng)pH 酸度計(jì)將培養(yǎng)基的pH 值調(diào)為6.7；pH 6.5 組：對(duì)照組培養(yǎng)基中加入濃度為2 mol／L HCl，經(jīng)pH 酸度計(jì)將培養(yǎng)基的pH 值調(diào)為6.5；對(duì)照+雷帕霉素（Rapamycin）組：CD8+T 細(xì)胞在對(duì)照組培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d 后加入Rapamycin（20 nmol／L），繼續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)至第10 天用于后續(xù)試驗(yàn)；pH 6.5+Rapamycin 組：CD8+T 細(xì)胞在pH 6.5 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d 后加入Rapamycin（20 nmol／L），繼續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)至第10 天用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) CD8+T 細(xì)胞經(jīng)Human anti-CD3和Human anti-CD28 以1.5 μg／mL 的劑量刺激3 d，以2×105個(gè)／孔的細(xì)胞數(shù)量重新接種至48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔培養(yǎng)基體積為500 μL），分別置于對(duì)照、pH 6.7 和pH 6.5 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每24 h 更換1 次培養(yǎng)基，并且每3 d（第3、6、9、12、15 天）用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制細(xì)胞增殖曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α 和IFN-γ的表達(dá) CD8+T 細(xì)胞經(jīng)Human anti-CD3 和Human anti-CD28（1.5 μg／mL）共同刺激3 d 后進(jìn)行轉(zhuǎn)板，在對(duì)照、pH 6.5 和pH 6.7 的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，并且每24 h 更換一次培養(yǎng)基。在培養(yǎng)第10 天時(shí)，收集細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基重懸后加入PMA／離子霉素（PMA：50 ng／mL，離子霉素：5 μg／mL），置于96 孔板中刺激6 h 后離心收集細(xì)胞，進(jìn)行流式染色。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、pH 6.7 組和pH 6.5 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置同型對(duì)照管。用FACS 緩沖液（含2%BSA 的PBS）配制活／死染料（1 ∶1 000 稀釋）和FITC anti-Human-CD8（1 ∶300 稀釋），室溫避光染色30 min。FACS 緩沖液洗滌細(xì)胞后，用4%多聚甲醛冰上固定30 min。再次FACS 緩沖液洗滌，用破膜液（Permeabilization buffer）配制細(xì)胞因子抗體PE-TNF-α（1 ∶300 稀釋）和APC-IFN-γ（1 ∶300 稀釋），室溫避光染色30 min，F(xiàn)ACS 緩沖液洗滌后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用Flow Jo 8.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γmRNA 的表達(dá) 采用苯酚-氯仿抽提法，按照Trizol試劑說(shuō)明書提取CD8+T 細(xì)胞總RNA，提取的RNA置于-80 ℃保存，按照NanoDrop One 微量核酸檢測(cè)儀說(shuō)明書對(duì)提取的RNA 測(cè)定濃度及純度。取吸光度（A260nm／A280nm）值為1.8～2.0 的RNA 樣本，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。所有引物均用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)，并由金唯智公司合成，引物退火溫度均為60 ℃。TNF-α上游引物序列：5＇-CACG CTCTTCTGCCTGCT-3＇，下游引物序列：5＇-GCTTGTC ACTCGGGGTTC-3＇；IFN-γ上游引物序列：5＇-CTAA TTATTCGGTAACTGACTTG-3＇，下游引物序列：5＇-ACAGTTCAGCCATCACTTGGA-3＇；ACTB上游引物序列：5＇-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3＇，下游引物序列：5＇-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3＇。根據(jù)SYBR Green qPCR Mixture 試劑說(shuō)明書配制PCR 反應(yīng)體系，總體積為20 μL，包括：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，10 μmol／L 上、下游引物各0.5 μL，DEPC 水8 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，共35 個(gè)循環(huán)。根據(jù)熔解曲線計(jì)算循環(huán)閾值（Ct）。所有樣本均重復(fù)3 次，Ct 值取均值。以ACTB作為內(nèi)參基因，TNF-α和IFN-γmRNA 的 相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，公式：ΔΔCt ＝［（樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因）-（對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct管家基因）］。

1.2.6 Western bolt 檢測(cè)mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白 CD8+T 細(xì)胞經(jīng) Human anti-CD3 和 Human anti-CD28（1.5 μg／mL）共同刺激3 d 后，在對(duì)照、pH 6.7 和pH 6.5 的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，收集細(xì)胞并加入RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行裂解，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將裂解后的蛋白質(zhì)上清液加入適量上樣緩沖液，高溫變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V），將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（250 mA 轉(zhuǎn)膜2 h），用100 g／L 脫脂奶粉封閉2 h 后分別加入兔抗人p-AKT（Ser473）抗體（1 ∶1 000 稀釋）、兔抗人AKT抗體（1 ∶2 000 稀釋）、兔抗人p-S6（Ser240／244）抗體（1 ∶1 000 稀釋）、兔抗人S6 抗體（1 ∶2 000 稀釋），鼠抗人β-actin 單克隆抗體（1 ∶5 000 稀釋），4 ℃過(guò)夜，TBST 洗脫3 次，每次10 min，加入羊抗兔和羊抗鼠IgG 二抗（1 ∶5 000 稀釋），室溫2 h 后TBST 再次洗脫3 次，每次10 min，使用掃描成像儀進(jìn)行掃描成像，以β-actin 作為內(nèi)參，Image J 軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示，兩組均值比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)不同pH 分組中CD8+T 細(xì)胞的增殖能力 隨著CD8+T 細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)的增加，在pH 6.7 和pH 6.5 組中CD8+T 細(xì)胞的增殖速度較對(duì)照組明顯緩慢，且pH 6.5 組增殖速度亦低于pH 6.7 組。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 不同pH 分組中CD8+T 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

表1 不同pH 分組中CD8+T 細(xì)胞數(shù)量（×106 個(gè)）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同pH 分組CD8+T 細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá) 與對(duì)照組相比，pH 6.7 組中TNF-α+CD8+T 細(xì)胞的百分比（%）（25.60±2.69 vs 60.70±2.26，t＝15.97，P＜0.000 1）顯著降低，IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞的百分比（%）（14.60±1.70 vs 34.35±2.62，t＝8.99，P＝0.000 3）亦顯著降低。與pH 6.7組相比，pH 6.5 組中TNF-α+CD8+T 細(xì)胞的百分比（%）（10.95±2.34 vs 25.60±2.69，t＝6.67，P＝0.001 6）顯著降低，IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞的百分比（%）（4.76±1.20 vs 14.60±1.70，t＝4.48，P＝0.012 5）亦顯著降低。見(jiàn)圖2。

圖2 不同pH 分組中CD8+T 細(xì)胞中TNF-α 和IFN-γ 的表達(dá)

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)不同pH 分組CD8+T 細(xì)胞中細(xì)胞因子的mRNA 水平 與對(duì)照組相比，pH 6.7 組TNF-αmRNA 的相對(duì)表達(dá)量（0.883±0.029 vs 1.035±0.018，t＝4.516，P＝0.002 1）顯著降低，IFN-γmRNA的相對(duì)表達(dá)量（0.704±0.068 vs 0.888±0.062，t＝5.450，P＝0.000 4）亦顯著降低；與pH 6.7 組相比，pH 6.5 組TNF-αmRNA 的相對(duì)表達(dá)量（0.671±0.016 vs 0.883±0.029，t＝6.295，P＝0.000 1）顯著降低，IFN-γmRNA 的相對(duì)表達(dá)量（0.580±0.020 vs 0.704±0.068，t＝3.688，P＝0.009 3）亦顯著降低。

2.4 Western blot 檢測(cè)不同pH 分組中CD8+T 細(xì)胞AKT 蛋白和S6 蛋白的磷酸化水平 與對(duì)照組相比，pH 6.7 組中AKT 蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.982±0.125 vs 1.010±0.078，t＝0.623 9，P＝0.898 7），AKT 蛋白在Ser473 位點(diǎn)的磷酸化水平（0.629±0.053 vs 1.055±0.045，t＝9.326，P＜0.000 1）顯著降低。與對(duì)照組相比，pH 6.7 組中S6 蛋白的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.030±0.109 vs 0.985±0.137，t＝0.982 2，P＝0.768 9），S6 蛋白在Ser240／244 位點(diǎn)的磷酸化水平（0.745±0.023 vs 0.991±0.037，t＝5.391，P＜0.000 1）顯著降低。與pH 6.7組相比，pH 6.5 組中AKT 蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.009±0.099 vs 0.982±0.125，t＝0.584，P＝0.910 6），AKT 蛋白在Ser473 位點(diǎn)的磷酸化水平（0.121±0.007 vs 0.629±0.053，t＝11.12，P＜0.000 1）顯著降低，S6 蛋白的表達(dá)水平（1.125±0.075 vs 1.030±0.109，t＝4.042，P＝0.022 8）明顯增加，S6 蛋白在Ser240／244 位點(diǎn)的磷酸化水平（0.246±0.026 vs 0.745±0.023，t＝10.92，P＜0.000 1）顯著降低。見(jiàn)圖3。

圖3 不同pH 分組CD8+T 細(xì)胞中AKT 蛋白和S6 蛋白的磷酸化水平

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)Rapamycin 作用后不同pH組中S6 蛋白磷酸化以及TNF-α 和IFN-γ 的表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，對(duì)照+Rapamycin 組中S6 蛋白的磷酸化水平顯著降低，pH 6.5 組中S6 蛋白的磷酸化水平亦顯著降低；與pH 6.5 組相比，pH 6.5+Rapamycin 組中S6 蛋白的磷酸化水平顯著降低，見(jiàn)圖4A。與對(duì)照組相比，對(duì)照+Rapamycin 組中TNF-α+IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比（%）（35.10±2.69 vs 54.65±2.19，t＝14.22，P＜0.000 1）顯著降低，pH 6.5 組中TNF-α+IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞的百分比（%）（16.70±1.98 vs 54.65±2.19，t＝27.61，P＜0.000 1）顯著降低；與pH 6.5 組相比，pH 6.5+Rapamycin組中TNF-α+IFN-γ+CD8+T 細(xì)胞的百分比（%）（0.51±0.38 vs 16.70±1.98，t＝11.78，P＜0.000 1）顯著降低，見(jiàn)圖4B。

圖4 抑制mTOR 后H+對(duì)CD8+T 細(xì)胞功能的影響

3 討論

實(shí)體瘤常常伴有酸性TME，對(duì)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的抗腫瘤免疫具有抑制作用［7］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳酸對(duì)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的增殖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，而恢復(fù)pH 后CTL 恢復(fù)至原來(lái)的狀態(tài)，且單獨(dú)的乳酸鹽對(duì)CTL 的增殖沒(méi)有影響［8］。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，將黑色素瘤患者的腫瘤浸潤(rùn)T 細(xì)胞置于pH 6.5 的酸性環(huán)境中，T 細(xì)胞反應(yīng)性下降，IL-2 等細(xì)胞因子分泌受損［9］。由于活化的T 細(xì)胞內(nèi)pH 值的變化會(huì)被T 細(xì)胞自身及時(shí)緩沖，因此酸性TME 對(duì)T 細(xì)胞的影響主要通過(guò)細(xì)胞外pH 值的變化而起作用。本研究利用不同H+濃度的培養(yǎng)基來(lái)模擬酸性TME，發(fā)現(xiàn)H+對(duì)CD8+T 細(xì)胞的增殖能力有明顯的抑制作用，并且隨著培養(yǎng)基的pH 值降低，抑制作用越強(qiáng)。此外，H+在mRNA和蛋白質(zhì)水平上抑制CD8+T 細(xì)胞中TNF-α 和IFN-γ的表達(dá)水平，證實(shí)了H+對(duì)CD8+T 細(xì)胞的功能具有抑制作用。

mTOR 是一種重要的細(xì)胞能量代謝信號(hào)通路，能夠整合來(lái)自細(xì)胞內(nèi)外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及各種生長(zhǎng)因子，參與調(diào)節(jié)T 細(xì)胞增殖與分化［10］。那么H+對(duì)T細(xì)胞功能的抑制作用是否與mTOR 信號(hào)通路有關(guān)呢？本研究發(fā)現(xiàn)H+抑制CD8+T 細(xì)胞中mTOR 信號(hào)通路的上游蛋白AKT 在Ser473 位點(diǎn)以及下游蛋白S6 在Ser240／244 位點(diǎn)的磷酸化，證實(shí)H+對(duì)T 細(xì)胞功能的抑制作用與mTOR 信號(hào)通路有關(guān)，且H+對(duì)mTOR 信號(hào)通路具有抑制作用。那么，H+能否通過(guò)mTOR 信號(hào)通路來(lái)抑制CD8+T 細(xì)胞的功能？筆者利用Rapamycin 對(duì)mTOR 信號(hào)通路進(jìn)行了抑制，發(fā)現(xiàn)當(dāng)H+和Rapamycin 共同作用時(shí)，與Rapamycin 或H+單獨(dú)作用相比，CD8+T 細(xì)胞中TNF-α 和IFN-γ的表達(dá)量以及mTOR 下游蛋白S6 在Ser240／244 位點(diǎn)的磷酸化程度進(jìn)一步降低，表明H+能夠通過(guò)mTOR 信號(hào)通路抑制CD8+T 細(xì)胞的功能。

本課題組前期的研究已證實(shí)酸性TME 對(duì)T 細(xì)胞的功能具有抑制作用，本研究進(jìn)一步探討了TME中主導(dǎo)酸性環(huán)境的H+抑制T 細(xì)胞功能的機(jī)制，但未進(jìn)行更深入的機(jī)制探究。此外，H+通過(guò)mTOR 信號(hào)通路調(diào)控何種對(duì)T 細(xì)胞功能起抑制作用的基因尚缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。在后續(xù)研究中，筆者將對(duì)于H+通過(guò)mTOR 信號(hào)通路下游靶基因影響T 細(xì)胞功能進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)探究，旨在為靶向酸性TME 的干預(yù)策略治療腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。