miR-494-3p 在胃癌患者血清外泌體中的表達及價值*

李金昌，王俊壹，張其德，顧萬建（江蘇省中醫(yī)院.檢驗科，.腫瘤科，.消化內鏡中心，南京 210029）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，每年新發(fā)胃癌病例中早期胃癌占比僅為20%，多數發(fā)現時已至進展期，總體5 年生存率不足50%［1］。為提高早期診斷水平，無創(chuàng)、方便快捷、便于大規(guī)模篩查的血清學新型腫瘤標志物有待被發(fā)現和應用。近年來報道，血清外泌體miRNAs 有望作為腫瘤診斷的候選生物學標志物［2］。miR-494-3p 在多種腫瘤中異常表達，發(fā)揮著不同的調控作用，例如其在肝細胞癌組織中呈高表達，并可通過調控脂質生物合成促進肝癌細胞的生長和轉移［3］；miR-494-3p 在結直腸癌組織和細胞系中呈低表達，且低表達患者的生存率較低［4］。研究表明，前體miR-494 在胃癌組織中呈低表達，并對胃癌細胞具有抑制作用［5］；但關于miR-494-3p 在胃癌組織及其血清外泌體中的研究鮮見報道。本研究旨在檢測miR-494-3p 在胃癌患者組織和血清外泌體中的表達水平，并分析其對胃癌篩查及輔助鑒別診斷的價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取2019 年1 月至2021 年12 月江蘇省中醫(yī)院消化內鏡中心就診的胃癌患者經手術切除的新鮮胃癌組織14 例作為胃癌組，其中男9例，女5 例，年齡（64.6±6.8）歲，Ⅰ／Ⅱ期6 例，Ⅲ期8例，腫瘤大?。? cm 7 例，≤3 cm 7 例；收集同期因胃炎或胃息肉等胃部良性疾病行胃鏡活檢的新鮮胃組織16 例作為相關疾病對照組，其中男4 例，女12 例，年齡（46.9±11.7）歲；另收集同期門診就診的44 例胃癌患者的血清標本，其中男32 例，女12 例，年齡（67.9±7.9）歲；以及同期體檢健康者的血清標本，其中男32 例，女12 例，年齡（68.0±7.9）歲。胃癌組納入標準：（1）胃癌組織樣本為手術切除且經病理組織學明確診斷，患者術前未經放化療治療；（2）胃癌血清樣本來源為本院門診就診的胃癌患者（經本院或他院內鏡或活檢確診），收集血清時未經放化療或手術治療。胃癌組排除標準：（1）合并其他良惡性腫瘤；（2）合并免疫系統(tǒng)疾??；（3）合并心肝腎嚴重功能不全；（4）樣本取樣量少、溶血等樣本不符合實驗要求。胃癌患者診斷和分期符合胃癌診療指南（2022 年版）［1］。本研究通過南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院（江蘇省中醫(yī)院）倫理委員會審核批準（2018NL-KS18），研究對象均知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 ExoQuickTMExosome Isolation Reagent（EXOQ5A-1）血清外泌體提取試劑盒（美國SBI 公司），QuantstudioTMDX 定量PCR 儀、TRlzol 試劑、Taqman 探針法PCR 預混液、TaqmanTMmiRNA assay（hsa-miR-494-3p／hsa-miR-16／cel-miR-39探針引物設計與合成）購自美國ABI 公司，外參線蟲cel-miR-39（序列為UCACCGGUGUAAAUCAGCU UG，南京瑞真生物公司），反轉錄試劑（日本TaKaRa公司），NanoDrop2000 微量分光光度計（美國Thermo Fisher 公司），氯仿、無水乙醇（上海久億化學試劑有限公司），無核酶水（南京凱基生物公司）。

1.3 組織總RNA 提取 取-80 ℃冷凍保存的組織塊，稱取約50 mg，用干凈消毒的剪刀剪碎，加入TRlzol 試劑裂解后，按照說明書采用氯仿、無水乙醇等提取總RNA，提取的總RNA 溶解于20 μL 無核酶水，NanoDrop2000 微量分光光度計檢測RNA純度和濃度，取吸光度（A260nm／A280nm）值在1.8～2.0之間且濃度＞25 μg／μL 的樣本用于后續(xù)試驗，樣本置于-80 ℃保存。

1.4 血清外泌體的提取、鑒定及外泌體RNA 的提取 按照SBI 外泌體提取試劑盒說明書進行外泌體提取，取冷凍保存的血清樣本恢復至室溫，3 000×g離心15 min 去除細胞和碎片，在干凈無菌的1.5 mL 離心管中加入200 μL 血清和50 μL 外泌體提取試劑充分顛倒混勻，4 ℃靜置30 min，1 500×g離心30 min 后棄上清液，1 500×g離心5 min 后用移液器輕輕吸去殘余上清液，底部沉淀即為獲取的外泌體，用200 μL 無核酶水溶解，4 ℃短時間冷藏保存，用于后續(xù)試驗。重懸的外泌體溶液外送至南京中鏡科儀技術有限公司用于透射電鏡拍攝和粒徑分析以鑒定外泌體。外泌體懸液中加入等量TRlzol 試劑裂解，每份樣本加入1 μL 線蟲cel-miR-39（工作濃度20 nmol／L）作為外部參照，后續(xù)按TRlzol 試劑說明書提取總RNA（純度和濃度的檢測、樣本要求及保存條件同上述組織樣本）。

1.5 反轉錄和PCR 擴增 對于上述提取的總RNA，采用Taqman 探針法，按照TaKaRa 反轉錄試劑盒說明書操作，將RNA 反轉錄成cDNA。按照ABI 定量PCR 試劑盒和QuantstudioTMDX 定量PCR 儀說明書進行PCR 擴增。探針法qPCR 反應體系為20 μL，包括：PCR Mix 預混液10 μL，TaqMan酶1 μL，反轉錄cDNA 2 μL，無核酶水7 μL。qPCR 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，45 個循環(huán)。采用QuantstudioTMDX 定量PCR 儀自帶分析軟件于60 ℃時收集熒光信號并進行熔解曲線分析，自動計算循環(huán)閾值（Ct）。組織樣本后續(xù)qPCR 以has-miR-16作為內部參照，血清樣本后續(xù)qPCR 以線蟲cel-miR-39 作為外部參照，miR-494-3p 的相對表達水平通過內參或者外參標準化后，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ct內參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組，每個樣本重復檢測3 次，取均值Ct。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad prism 8.0 軟件作圖，SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。數據進行正態(tài)分布檢驗符合正態(tài)分布，基因表達量用表示，各組數據比較前均進行方差齊性檢驗，符合方差齊性的兩組均值比較采用獨立樣本t檢驗（雙尾），方差不齊的兩組數據差異比較采用非參數檢驗中的Mann-WhitneyU秩和檢驗。采用ROC 曲線分析并評估目標基因對疾病的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌患者和健康人對照組血清外泌體miR-494-3p的相對表達水平比較 與健康人對照組（1.00±0.36）相比，胃癌組血清外泌體miR-494-3p 的相對表達水平（0.21±0.03）降低，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝3.64，P＜0.01）；胃癌患者血清外泌體miR-494-3p的表達水平在不同性別組（男性組和女性組分別為0.25±0.04 和0.12±0.03，t＝1.91，P＝0.06）、年齡組（＜70 歲組和≥70 歲組分別為0.23±0.04 和0.19±0.04，t＝0.75，P＝0.46）間的差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 血清外泌體miR-494-3p 篩查胃癌的ROC 曲線分析結果 以44 例胃癌患者作為疾病組，44 例健康人作為對照組，根據血清外泌體miR-494-3p的結果繪制ROC 曲線，血清外泌體miR-494-3p 篩查胃癌和健康人的ROC 曲線下面積（AUCROC）為0.725（95%CI：0.622～0.829，P＜0.01），最大約登指數為0.364，當cut-off 值為0.370 時，敏感性為50.0%，特異性為86.4%，陽性預測值為63.3%，陰性預測值為78.6%，準確性為68.2%，見圖1。

圖1 血清外泌體miR-494-3p 篩查胃癌和健康人的ROC 曲線

2.3 胃癌組和相關疾病對照組組織中miR-494-3p的表達水平比較 與相關疾病對照組組織中miR-494-3p的相對表達水平（1.00±0.39）相比，胃癌患者組織中miR-494-3p 的相對表達水平（0.22±0.07）顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝2.66，P＜0.01）。

2.4 胃癌患者組織中miR-494-3p 表達水平與臨床病理參數的關系 胃癌患者組織中miR-494-3p 的表達水平在不同性別、年齡、腫瘤浸潤、淋巴轉移、腫瘤大小、腫瘤分期亞組中的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 胃癌患者組織中miR-494-3p 表達水平與臨床病理參數的關系

3 討論

miR-494-3p 前體是位于14 號染色體上的miR-494，miR-494-3p 在多種腫瘤中異常表達，但在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同，通過相應的調控機制發(fā)揮癌基因［3，8］或者抑癌基因［4］作用，也可參與調控腫瘤耐藥［6］。早在2014 年有文獻［7］報道，miR-494在胃癌中通過靶向c-myc 發(fā)揮抑癌基因作用，在胃癌組織和細胞中的表達水平降低，且與不良預后相關；該作者通過小鼠實驗進一步證實miR-494 對胃癌具有抑制作用。近年來，國內文獻［5］也表明miR-494 在胃癌組織中的表達水平顯著降低，過表達miR-494 可以抑制胃癌細胞的增殖和侵襲。本研究結果顯示，相較于胃良性疾病組織，胃癌組織中miR-494-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），這與上述文獻［5，7］報道的其前體miR-494在胃癌組織和細胞中表達水平降低的結論相符。另據一項肺癌的研究［8］表明，組織中前體miR-494 的表達水平與成熟體miR-494-3p 水平存在直接相關性，故而在一定程度上證實miR-494-3p 在胃癌中也可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。然而，本研究結果顯示胃癌患者組織中miR-494-3p 的表達水平在不同腫瘤分期、淋巴轉移亞組中未見顯著差異，這與文獻［7］中發(fā)現miR-494存在顯著差異的結果不符，分析原因可能與本研究納入的胃癌組織樣本數較少導致亞組分析代表性不強有關，后續(xù)有待擴大樣本量進一步研究。有文獻報道，腫瘤患者miR-494-3p的表達水平與對應的circRNA 呈負相關，miR-494-3p 表達水平降低可能與其作為環(huán)狀RNA 的靶點而發(fā)揮海綿作用有關，例如Circ_0007142 通過海綿miR-494-3p參與調節(jié)食管癌的耐藥［6］，Circ_0000745 還可通過海綿miR-494-3p 調控miR-494-3p／NET1 軸，促進急性淋巴細胞白血病的進展［9］。本研究尚未進行胃癌中miR-494-3p 功能機制的研究，后續(xù)有待進一步探究。

本研究發(fā)現胃癌患者血清外泌體中miR-494-3p的相對表達水平顯著低于健康人對照組（P＜0.05），這與本研究胃癌組織中miR-494-3p 的表達水平降低一致，且與文獻報道胃癌患者血漿miR-494水平降低［9］及胃癌組織和細胞中miR-494表達降低［5，7］相符。上述結果表明，胃癌患者血清外泌體中miR-494-3p 水平可以反映其在胃癌腫瘤組織中的表達水平，這為應用于無創(chuàng)的血清學腫瘤標志物檢測胃癌提供了實驗依據。血清外泌體可能來源于腫瘤組織親本細胞的釋放，且在外泌體脂質膜的富集和保護下，外泌體中miRNAs 信息在一定程度上能反映腫瘤組織的生物學信息，比血清或者血漿游離miRNAs 在液體活檢中發(fā)揮腫瘤標志物作用方面更有意義。本研究中血清外泌體miR-494-3p區(qū)分胃癌患者和健康人的ROC 曲線下面積為0.725（95%CI：0.622～0.829，P＜0.01），當cut-off 值為0.370 時，敏感性為50.0%，特異性為86.4%，陽性預測值為63.3%，陰性預測值為78.6%，準確性為68.2%，說明血清外泌體miR-494-3p 對胃癌具有一定的篩查價值。本研究數據表明該指標特異性尚可，但敏感性不高，故不宜單獨用于胃癌診斷，可結合傳統(tǒng)腫瘤標志物或影像學檢查等其他檢查指標，作為未來潛在的胃癌篩查和輔助診斷生物學標志物。