USP26 負(fù)性調(diào)控RLR 信號(hào)通路對(duì)腸道病毒71 型復(fù)制的影響*

許超，盛成蘭，蔣邦棟，張春秋，史偉峰（.上海市第十人民醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科，上海 050；.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 3003）

腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）是引起兒童重癥手足口病的重要病毒之一，其臨床表現(xiàn)除了典型的在手、足、口、臀等部位出現(xiàn)皰疹以外，還會(huì)繼發(fā)嚴(yán)重的心肌炎、腦膜炎和神經(jīng)源性肺水腫等并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡［1］。目前，對(duì)于重癥手足口病的治療主要是對(duì)癥治療，尚沒(méi)有特效藥物，重癥病例的致死率居高不下。泛素特異性蛋白酶26（ubiquitin-specific protease 26，USP26）是去泛素化酶家族中的重要一員，其誘導(dǎo)底物蛋白活化或失活，達(dá)到調(diào)節(jié)信號(hào)通路的作用，主要功能是影響腫瘤的生成、發(fā)展和男性不育［2-5］，在抗病毒方面國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在探討在EV71 的感染細(xì)胞過(guò)程中USP26 負(fù)性調(diào)控RLR 信號(hào)通路，為人類認(rèn)識(shí)EV71 逃逸宿主免疫應(yīng)答提供一條新思路，以期為相關(guān)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗體、病毒和細(xì)胞來(lái)源 兔抗人USP26 和兔抗EV71／VP1 抗體（美國(guó)Gene Tex 公司），兔抗人MDA5、兔抗人GAPDH 和兔抗人IRF3 抗體（美國(guó)Proteintech 公司），兔抗人磷酸化IRF3 抗體（美國(guó)Affinity 公司），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔lgG 抗體（美國(guó)Proteintech 公司）。EV71 病毒株GDV083（ATCCVR784，基因編號(hào)：U22521）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所，人橫紋肌肉瘤（RD）細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基和10%胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），2.5 g／L 胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone 公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、離心管、凍存管（美國(guó)Corning 公司），Trizol 試劑、Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen 公司），5×SDS 蛋白質(zhì)上樣緩沖液、蛋白質(zhì)提取試劑盒、配蛋白膠試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司），5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)液（北京索萊寶公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）、ECL 化學(xué)發(fā)光顯影液（美國(guó)Millipore 公司），10×PBS（美國(guó)Thermo公司），RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）。CLINX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科技公司），SMA1000超微量紫外分光光度計(jì)（北京普萊恒通科技公司），7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司），低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Bierlofuge 公司），凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。USP26 siRNA 和陰性對(duì)照siRNA 由蘇州金維智公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)表1；USP26（USP26基因ID：83844）、EV71／VP1和GAPDH引物根據(jù)基因序列（EV71／VP1基因ID：KU645338.1），采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，并由蘇州金維智公司合成。見(jiàn)表2。

表2 USP26 和EV71／VP1 引物序列

1.3 EV71 病毒感染RD 細(xì)胞 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RD 細(xì)胞，用10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，用2.5 g／L 胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔4×105個(gè)），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）＝1 的EV71 病毒，室溫溫育1 h 后，更換新的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0、2、4、8、12 和24 h 時(shí)經(jīng)2.5 g／L 胰蛋白酶消化，1 000 r／min 離心5 min，收集細(xì)胞，提取RNA 或蛋白質(zhì)用于目的基因或蛋白質(zhì)檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）取1.3 中各組細(xì)胞，采用Trizol 法裂解細(xì)胞并提取總RNA，SMA1000 超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA 濃度和純度，取濃度為300～500 ng／μL，吸光度（A260nm／A280nm）值為1.80～2.0 的RNA 樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA 樣本置于-20℃保存。PCR 總體系為20 μL，包括SYBR Green Master mix 10 μL，ROX 校正染料Ⅱ0.4 μL，10 μmol／L 上、下引物（根據(jù)表2，針對(duì)目的基因加入對(duì)應(yīng)引物）各0.4 μL，cDNA 2 μL，RNA Free ddH2O 6.8 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，共40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀配套v2.0.6軟件收集熒光信號(hào)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算VP1mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，ΔΔCt ＝（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 Western blot 取1.3 中的各組細(xì)胞，經(jīng)2.5 g／L胰蛋白酶消化，1 000 r／min 離心5 min，加入蛋白質(zhì)裂解液，冰上裂解40 min，12 000 r／min 離心5 min，收集上清液，采用BCA 法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。每孔取35 μg 蛋白質(zhì)加樣，行10 g／L SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后，300 mA 恒流1.5 h 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入50 g／L 脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗人USP26、MDA5、IRF3、磷酸化IRF3、GAPDH 抗體、兔抗EV71／VP1 抗體（均為1 ∶1 000稀釋），4 ℃過(guò)夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，再加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔lgG 抗體（1 ∶1 000稀釋）室溫1 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min，采用ECL 發(fā)光液顯色，在CLINX 化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)及Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描及結(jié)果判讀。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RD 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)40%時(shí)，先混合SiRNA 與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（1 ∶1混合），棄去原培養(yǎng)基，加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，每隔12 h 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)90%時(shí)，即完成轉(zhuǎn)染。

1.7 空斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度 將RD 細(xì)胞密度調(diào)整為1×105／mL，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入2 mL 培養(yǎng)過(guò)夜，次日參照1.6 的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染相應(yīng)的USP26-siRNA（實(shí)驗(yàn)組）或siRNA（對(duì)照組），轉(zhuǎn)染48 h 后感染EV71（MOI ＝1），用1 mL 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；病毒感染24 h 后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，連同上清液一起收集，細(xì)胞碎片及上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將RD 細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)／孔，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%。將收集的病毒液進(jìn)行100～109倍比稀釋，棄去原培養(yǎng)基并將稀釋好的病毒液加入至培養(yǎng)孔中（100 μL／孔），每個(gè)稀釋倍數(shù)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；選取空斑數(shù)目合適的同一稀釋倍數(shù)，棄去病毒液并用PBS 洗滌細(xì)胞，每孔加入30 μL 3%的結(jié)晶紫溶液（稱取結(jié)晶紫3 g 溶于70%乙醇中）染色10 min，棄去染液于生物安全柜中風(fēng)干，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)空斑數(shù)目并計(jì)算病毒滴度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism8 軟件作圖。計(jì)量資料以表示，所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），各均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EV71 感染RD 細(xì)胞后USP26 的表達(dá)情況

2.1.1 RT-PCR 檢測(cè)EV71 感染RD 細(xì)胞后USP26mRNA 及VP1mRNA 的表達(dá)水平 與0 h（1.02±0.02）相比，EV71 感染RD 細(xì)胞2、4、8、12 和24 h時(shí)USP26mRNA 的表達(dá)水平顯著升高（分別為1.17±0.03、2.67±0.32、9.28±0.14、11.39±0.52 和4.61±0.58），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為4.62、4.98、57.23、19.84 和6.22，P均＜0.05）；此外，VP1mRNA在0、2 和4 h 時(shí)均不表達(dá)，而在8、12 和24 h 時(shí)的表達(dá)水平分別為1.64±0.12、6.67±0.48 和9.68±0.58。

2.1.2 Western blot 檢測(cè)EV71 感染RD 細(xì)胞后UPS26 蛋白和VP1 蛋白表達(dá)水平 相對(duì)于0 h（0.21±0.01），EV71 感染RD 細(xì)胞4、8、12 和24 h時(shí)USP26 蛋白的灰度比值（分別為0.25±0.01、0.38±0.01、0.43±0.01 和0.44±0.02）均顯著升高（t分別為3.22、10.35、12.29 和11.18，P＜0.05），而2 h USP26 蛋白的灰度比值（0.23±0.01）與0 h 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.36，P＞0.05）；此外，VP1 蛋白在0、2 和4 h 時(shí)均不表達(dá)，而在8 h、12 和24 h 時(shí)的灰度比值分別為0.24±0.03、0.58±0.06 和0.87±0.06。見(jiàn)圖1。

圖1 EV71 感染誘導(dǎo)USP26 的表達(dá)上調(diào)

2.2 敲減USP26后USP26、VP1mRNA 的表達(dá)

2.2.1 RT-PCR 檢測(cè)敲減USP26后USP26mRNA的表達(dá)水平 與對(duì)照組的USP26mRNA 的表達(dá)水平（1.05±0.07）比較，USP26-siRNA1、USP26-siRNA2 和USP26-siRNA3 敲減后，USP26mRNA 的表達(dá)水平分別為0.27±0.08、0.64±0.03和0.45±0.05（t分別為9.69、5.14 和6.74，P＜0.05），以USP26-siRNA1 敲減效果最明顯，故而用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 RT-PCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（UPS26-siRNA1 敲減組）和對(duì)照組中VP1mRNA 的表達(dá)水平 與0 h 比較，對(duì)照組在8、12 和24 h 時(shí)VP1mRNA 的表達(dá)水平逐漸增多；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組VP1mRNA 表達(dá)水平結(jié)果趨勢(shì)一致，但與對(duì)照組中同一時(shí)間點(diǎn)（8、12 和24 h）比較，VP1mRNA 的表達(dá)水平減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為6.88、5.24 和5.58，P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 UPS26 敲減組和對(duì)照組中VP1 mRNA 的表達(dá)水平

2.2.3 空斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度結(jié)果 與對(duì)照組（轉(zhuǎn)染siRNA 組）病毒滴度［（8.76±0.47）×105PFU／mL］比較，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染UPS26-siRNA 組）病毒滴度［（5.39±0.20）×105PFU／mL］顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.51，P＜0.05）。

2.3 USP26 負(fù)性調(diào)控RLR 信號(hào)通路 在EV71 的感染過(guò)程中，對(duì)照組8 h 宿主細(xì)胞中MDA5 蛋白（灰度比值為0.19±0.01）的表達(dá)水平下降［與0 h對(duì)照組（0.28±0.01）比較，t＝6.05，P＜0.05］，實(shí)驗(yàn)組8 h 時(shí)MDA5 蛋白（灰度比值為0.26±0.01）水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［與0 h 實(shí)驗(yàn)組（灰度比值為0.27±0.01）比較，t＝0.20，P＞0.05］；對(duì)照組8 h 時(shí)p-IRF3／IRF3 的相對(duì)比值為0.08±0.02，實(shí)驗(yàn)組p-IRF3／IRF3的相對(duì)比值為0.36±0.03，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝7.71，P＜0.05）；與對(duì)照組8 h 比較，實(shí)驗(yàn)組8 h 宿主細(xì)胞中VP1 蛋白的表達(dá)量明顯減少（0.32±0.06 vs 0.83±0.08，t＝5.08，P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 USP26 負(fù)性調(diào)控RLR 信號(hào)通路

3 討論

VP1 蛋白是構(gòu)成EV71 外殼蛋白主要成分之一，參與病毒的吸附、穿入、脫殼等過(guò)程。在EV71病毒感染RD 細(xì)胞過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)從8 h 時(shí)開(kāi)始表達(dá)VP1，24 h 時(shí)達(dá)到峰值，而Kuo 等［7］報(bào)道VP1可以在感染Hela 細(xì)胞6 h 后表達(dá)。雖然EV71 在Hela 細(xì)胞中更容易增殖，但Hela 細(xì)胞增殖效率明顯低于RD 細(xì)胞，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中不具有優(yōu)勢(shì)。因此，不同的EV71 毒株類型、感染滴度以及細(xì)胞系可能導(dǎo)致VP1 蛋白表達(dá)水平及出現(xiàn)時(shí)間存在差異。

MDA5 受體是識(shí)別EV71 的主要受體之一，可活化干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3，誘導(dǎo)抗病毒蛋白的產(chǎn)生，發(fā)揮細(xì)胞的抗病毒作用［7］。EV71 病毒含有2個(gè)重要蛋白酶，分別為2A 和3C，其可通過(guò)降解細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白，抑制細(xì)胞的免疫反應(yīng)。Feng 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，2A 蛋白酶通過(guò)降解RLR 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白MDA5 和MAVS，從而逃逸機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)EV71 感染能夠抑制宿主細(xì)胞中MDA5 的表達(dá)，但是否為2A 蛋白酶降解作用，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

宿主細(xì)胞可通過(guò)去泛素化酶調(diào)控抗病毒信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子，對(duì)病毒感染檢測(cè)具有重要意義。多項(xiàng)研究證實(shí)了RLR 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白分子受到去泛素化酶的調(diào)節(jié)，例如USP4 可通過(guò)特異性去除RIG-I 蛋白的K-48 泛素連接，從而穩(wěn)定RIG-I 蛋白，發(fā)揮正向調(diào)節(jié)RLR 抗病毒信號(hào)通路的作用［8］；同樣，EV71 也會(huì)利用去泛素化酶調(diào)控RLR 信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞的抗病毒作用，逃逸機(jī)體的免疫應(yīng)答。Gu 等［9］發(fā)現(xiàn)USP19 通過(guò)靶向抑制TRAF3 分子的K-63 多聚泛素化修飾，從而抑制IFN-I 天然免疫信號(hào)中IRF3 的磷酸化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)USP24 能夠特異性結(jié)合TBK1 蛋白，減少與K-63 泛素的修飾，抑制IRF3 的磷酸化，促進(jìn)病毒的復(fù)制［10］。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)隨著EV71 感染時(shí)間延長(zhǎng)，USP26 的表達(dá)也隨之上調(diào)；通過(guò)基因敲減USP26的表達(dá)，細(xì)胞中的VP1mRNA 和VP1蛋白明顯受到抑制，而空斑試驗(yàn)中USP26 的敲減能降低EV71 的病毒滴度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞中USP26 的表達(dá)，能夠抑制病毒降解MDA5 蛋白的作用，同時(shí)IRF3 磷酸化增加。因此，USP26 表達(dá)的增加或降低對(duì)EV71 的復(fù)制具有重要的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，USP26 可能通過(guò)結(jié)合RLR 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白，調(diào)控蛋白質(zhì)的泛素化修飾，引起蛋白質(zhì)活化或失活，進(jìn)而影響EV71 在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，為臨床治療手足口病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題研究仍然還有一些問(wèn)題值得更深入地探討，例如一方面需要尋找作用的靶蛋白；另一方面，本研究的層次僅局限于細(xì)胞水平，那么EV71 在感染小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，是否具有同樣的結(jié)果？USP26 是否還影響其他病毒增殖？這是筆者今后研究工作中的重點(diǎn)。