mNGS 在鸚鵡熱衣原體肺炎中的應用價值*

馬晶，楊舒婷，楊敏，黃國虹，王昌敏（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心，烏魯木齊 830001）

鸚鵡熱衣原體（Chlamydiapsittaci，Cps）是人獸共患病病原體，其感染的肺炎約占社區(qū)獲得性肺炎的1%［1-3］。鸚鵡熱衣原體肺炎發(fā)病率低，臨床癥狀特異性低。常規(guī)檢測方法包括血清學及分子生物學檢驗等［4-5］，上述檢測方法周期長、陽性率低，易受抗生素治療的干擾，不能滿足臨床快速、準確診斷的需求，導致臨床對鸚鵡熱衣原體肺炎診斷困難，常被漏診或誤診。由于宏基因組二代測序技術（metagenomics next generation sequencing，mNGS）［6-8］具有無偏倚、廣覆蓋的優(yōu)勢，目前已廣泛應用于臨床，提高了鸚鵡熱衣原體的檢出率，從而使臨床醫(yī)師能夠對其進行及時有效的針對性治療。本文回顧性總結了17 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者的臨床資料，分析其臨床病理參數及實驗室檢查指標，以期為診斷及治療鸚鵡熱衣原體肺炎提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象 對2021 年7 月至2022 年8 月由新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收治的且經mNGS 檢測為鸚鵡熱衣原體肺炎患者17 例進行回顧性分析，男11 例，女6 例，年齡33～78 歲。對其一般資料、基礎疾病及臨床病理參數進行匯總。納入標準：（1）患者臨床資料完整。（2）患者均經mNGS檢出鸚鵡熱衣原體。排除標準：（1）合并其他系統(tǒng)感染者。（2）合并其他惡性腫瘤者。

1.2 主要儀器及試劑 BC-6800PLUS 全自動細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子公司），ACL TOP750 LAS 全自動血凝分析儀（北京沃芬醫(yī)療器械商貿公司），c16000 全自動生化分析儀（美國Abbott 公司），cobas e411 電化學發(fā)光分析儀（德國Roche 公司），MGISEQ-2000 測序儀（深圳華大智造科技公司），C1000 梯度PCR 儀（美國Bio-Rad公司），QubitTM4 濃度測定儀、Invitrogen QubitTMdsDNA HS Assay 試劑盒、Invitrogen QubitTMssDNA HS Assay 試劑盒（美國賽默飛公司），病原破壁試劑盒（溶壁酶）、核酸提取或純化試劑、基因組DNA 片段化試劑盒、測序反應通用試劑盒（武漢華大智造科技公司）。

1.3 標本采集 患者在抗菌藥物使用前，空腹采集靜脈全血標本2 mL，EDTA-K2抗凝，8 h 內4 ℃、1 600×g離心10 min，收集300 μL 血漿。肺泡灌洗液或氣管抽吸物按照無菌操作要求留取1 mL。標本置于-70 ℃保存。

1.4 血液學指標檢測 采用BC-6800PLUS 全自動細胞分析儀檢測血常規(guī)各項參數，ACL TOP750 LAS 全自動血凝分析儀檢測凝血指標，c16000 全自動生化分析儀和cobas e411 電化學發(fā)光分析儀檢測生化指標。血液學各指標參考區(qū)間：白細胞計數：［WBC：（3.5～9.5）×109／L，電阻抗法］；中性粒細胞百分比（NEUT%：40%～75%，電阻抗法）；淋巴細胞百分比（LY%：20%～50%，電阻抗法）；C 反應蛋白（CRP：0～8 mg／L，免疫比濁法）；纖維蛋白原（Fib：2.0～4.0 g／L，凝固法）；D-二聚體（D-D：0～0.5 mg／L，免疫比濁法）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT：9～60 U／L，速率法）；天冬氨酸氨基轉移酶（AST：15～45 U／L，速率法）；肌酸激酶（CK：50～310 U／L，速率法）；乳酸脫氫酶（LDH：120～250 U／L，速率法）；肌鈣蛋白T（cTnT：0～0.014 ng／mL，電化學發(fā)光法）；B 型鈉尿肽（BNP：0～100 pg／mL，化學發(fā)光法）；清蛋白（Alb：40～55 g／L，比色法）。

1.5 mNGS 檢測 取患者的肺泡灌洗液或氣管抽吸物450 μL，加入7.2 μL 溶壁酶溫浴（30 ℃、10 min），加入玻璃珠進行物理破壁，混合震蕩后取300 μL 進行DNA 提取，陰、陽性質控品處理同實驗標本。提取后的DNA 使用QubitTM4 濃度測定儀測定濃度，取43 μL 濃度檢測合格的核酸標本進行酶切片段化、構建文庫（末端修復、接頭連接及PCR擴增）。按照QubitTMdsDNA HS Assay 試劑盒說明書進行文庫濃度的質控，根據檢測后的濃度將構建好的文庫按照等質量進行pooling，將pooling 混合后的文庫經環(huán)化形成單鏈環(huán)形結構，再經滾環(huán)復制（RCA）生成DNB 納米球，制備好的DNB 納米球加載至測序芯片，使用MGISEQ-2000 測序儀進行測序。測序數據下機后去除低質量的序列以獲得高質量的數據。通過BWA（BWA：http：／／bio-bwa.sourceforge.net／）比對，高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除，剩下的數據在去除低復雜度reads 后與華大PMDB 病原數據庫進行比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數，根據序列數的高低以及臨床其他檢測判讀可能的病原體。對于實驗檢測結果，先根據序列數的多少及種屬的排列位置，選取排名靠前的種屬且有致病性的病原體，結合臨床癥狀和其他實驗檢測結果，綜合判定致病微生物［6-10］。

2 結果

2.1 鸚鵡熱衣原體肺炎患者基本信息與臨床病理參數 17 例診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎患者中，除6例無基礎病史外，其余均有高血壓、腦梗等病史。5例有鳥類、禽類接觸史，3 例不詳。臨床表現除2 例外其余均有發(fā)熱現象。見表1。

表1 17 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者的臨床病理參數

2.2 各項實驗室檢查結果 17 例患者中，有3 例患者白細胞計數升高，6 例患者中性粒細胞百分比明顯增高，17 例患者C 反應蛋白、纖維蛋白原、D-二聚體均升高，11 例患者乳酸脫氫酶和7 例患者B 型鈉尿肽升高，15 例患者淋巴細胞百分比和14 例患者清蛋白降低。見表2。

表2 17 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者實驗室檢查結果分析

2.3 鸚鵡熱衣原體肺炎患者mNGS 檢測結果 17例鸚鵡熱衣原體肺炎患者的mNGS 檢測結果見表3。其中9 例患者只檢出鸚鵡熱衣原體，另有部分患者還檢出金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌等細菌，煙曲霉等真菌以及皰疹病毒。

表3 17 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者mNGS 檢測結果

3 討論

鸚鵡熱衣原體是人畜共患病病原體［11］，主要宿主為鸚鵡、鴿子等鳥類。人類多因吸入鳥類排泄物的氣溶膠引起肺炎［12］，患者年齡多集中于中年人，且男性發(fā)病率高于女性［13］。本研究中感染者平均年齡為57 歲；男性占比64.71%，女性占比35.29%；其中29%的感染者有鳥類接觸史；88%的感染者有發(fā)熱癥狀，符合該病的流行病特征［14］。由于該病臨床癥狀不典型，因此對于有鳥類或禽類接觸史的發(fā)熱患者，需警惕鸚鵡熱衣原體感染，盡早進行診斷。

研究表明，鸚鵡熱衣原體肺炎患者通常白細胞計數正?；蜉p微升高、中性粒細胞百分比、C 反應蛋白、降鈣素原、肌酸激酶、乳酸脫氫酶明顯升高。如果合并系統(tǒng)性疾病，患者可出現轉氨酶升高、低蛋白血癥、低鈉血癥和腎功能損害［15］。本研究的實驗室檢查結果證實，患者的白細胞計數、C 反應蛋白均升高，可作為感染的客觀指標。而淋巴細胞百分比下降，提示鸚鵡熱衣原體可能易于在免疫功能低下的宿主中引起感染。

本研究中17 例患者mNGS 檢出鸚鵡熱衣原體核酸序列，結合臨床表現及接觸史明確診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎。患者從出現臨床癥狀到檢出鸚鵡熱衣原體平均時間為5 d，部分病例檢出鸚鵡熱衣原體核酸序列數較多，這可能與檢測的標本類型、病情嚴重程度等有關。本次研究中還檢出其他病原體，但需結合患者臨床病理參數、實驗室檢查結果及檢出的序列數等綜合判定是否為感染的致病菌。17 例患者在mNGS 檢測結果顯示為鸚鵡熱衣原體感染后，根據患者病情嚴重程度、治療效果、病程時間等選擇性加用其他抗菌藥物治療，均好轉出院。這充分說明應用mNGS 技術在17 例患者的診治過程中顯示出了特有的優(yōu)勢，提高了鸚鵡熱衣原體肺炎診斷的準確性，提示臨床應盡早進行精準的抗感染治療，減少不必要抗菌藥物的使用，改善了患者預后。然而，目前mNGS 技術的結果解讀尚無統(tǒng)一的標準，致病菌和背景菌區(qū)分較難。本次實驗納入的病例數較少，這是本研究的不足之處，后期將繼續(xù)擴大樣本量對其進行更深入研究，以期更好地指導臨床診斷及治療。