基因組光學(xué)圖譜技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

許伊云，張沁欣，季修慶，周冉，羅春玉，王艷，孟露露，胡平，許爭(zhēng)峰（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004）

基因組光學(xué)圖譜技術(shù)（optical genome mapping，OGM）被稱(chēng)為新一代細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是一種通過(guò)對(duì)超高分子量（ultra-high molecular weight，uHWM）DNA 進(jìn)行熒光特異性標(biāo)記以及線(xiàn)性化高分辨率成像，從而構(gòu)建全基因組物理圖譜的新興技術(shù)。目前認(rèn)為，OGM 以其大于230 kb 的長(zhǎng)讀長(zhǎng)，能夠在單次檢測(cè)中識(shí)別各種主要類(lèi)型的結(jié)構(gòu)變異（structural variation，SV），最高分辨率可達(dá)500 bp［1］，近年來(lái)已逐步被應(yīng)用于生殖遺傳領(lǐng)域［2-3］。然而，OGM 在產(chǎn)前診斷中的相關(guān)研究較少，僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用進(jìn)行了回顧性分析及評(píng)述，認(rèn)為其在未累及著絲粒的染色體變異中的檢測(cè)效能與常規(guī)方法完全一致［4-5］。本研究以染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）聯(lián)合核型分析為對(duì)比，對(duì)OGM 在產(chǎn)前診斷中的可行性及有效性進(jìn)行評(píng)估，以期進(jìn)一步完善OGM 在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用方案，深入剖析其在各類(lèi)染色體變異中的檢測(cè)效能及優(yōu)勢(shì)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2022 年6 月至8 月于南京市婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢(xún)的病例60 例，年齡（29.3±4.1）歲，中位穿刺孕周23+3周（18～31+3周）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胎兒結(jié)構(gòu)畸形；（2）超聲軟指標(biāo)異常，包括頸項(xiàng)透明層（nuchal translucency，NT）增厚（≥3.0 mm）、鼻骨發(fā)育異常和輕度側(cè)腦室增寬（10～15 mm）［6］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多胎妊娠；（2）孤立性室間隔缺損、孤立性右位主動(dòng)脈弓、孤立性永存左上腔靜脈、孤立性足內(nèi)翻；（3）穿刺失敗、樣本量不足、培養(yǎng)或DNA 提取失敗等原因?qū)е聼o(wú)法進(jìn)行OGM、CMA 檢測(cè)。介入性產(chǎn)前診斷指征主要包括NT 增厚15 例，多發(fā)軟指標(biāo)異常13 例，心血管畸形9 例，結(jié)構(gòu)畸形合并軟指標(biāo)異常7 例，其他超聲異常16 例。取得患者知情同意后獲取羊水樣本30 mL，由3 組實(shí)驗(yàn)人員平行進(jìn)行OGM、CMA 檢測(cè)及染色體核型分析，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行盲法分析及致病性評(píng)估。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2021KY-118），患者及家屬知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 羊水細(xì)胞培養(yǎng)基（德國(guó)Cytogen GmbH 公司），Quibit 雙鏈DNA 定量試劑盒、Quibit 熒光定量?jī)x（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），超長(zhǎng)片段DNA 抽提試劑盒、DLS DNA 標(biāo)記試劑盒、Saphyr DNA 單分子成像平臺(tái)（美國(guó)Bionano Genomics 公司），DNA 提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司），基因芯片試劑盒及基因芯片平臺(tái)、雜交爐、洗滌工作站、掃描儀（美國(guó)Affymetrix 公司），F(xiàn)ISH試劑盒（北京金菩嘉公司）。

1.3 OGM 檢測(cè)及分析取約5 mL 羊水接種于T25 培養(yǎng)瓶中，經(jīng)培養(yǎng)及分瓶傳代至鋪滿(mǎn)2 個(gè)培養(yǎng)瓶后進(jìn)行細(xì)胞凍存，其中約1／2 細(xì)胞用于uHMW DNA 提取，剩余細(xì)胞凍存?zhèn)浞?。按照超長(zhǎng)片段DNA 抽提試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程從＞50 萬(wàn)的羊水細(xì)胞中提取uHMW DNA，并利用Quibit 雙鏈DNA 定量試劑盒、熒光定量?jī)x以及脈沖場(chǎng)凝膠電泳完成基因組DNA 的定量及長(zhǎng)度質(zhì)控，要求大部分DNA 分子長(zhǎng)度＞500 kb，濃度36～150 ng／μL。DLS技術(shù)（Direct Label and Stain）序列特異性標(biāo)記使用DLS DNA 標(biāo)記試劑盒完成，其主要流程包括基因組CTTAAG 6 個(gè)堿基序列標(biāo)記，游離熒光基團(tuán)的清除，均質(zhì)化及DNA 骨架染色過(guò)夜，標(biāo)記后產(chǎn)物定量。濃度4～12 ng／μL、標(biāo)準(zhǔn)差＜0.25 的樣本可直接上機(jī)。標(biāo)記后的樣本置于4 ℃避光保存。標(biāo)記后DNA 載入Saphyr 芯片，在Saphyr DNA 單分子成像平臺(tái)中實(shí)現(xiàn)線(xiàn)性化及成像。下機(jī)數(shù)據(jù)符合Bionano官方推薦的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（https：／ ／bionanogenomics.com／wp-content／uploads／2018／04／30223-Saphyr-

Molecule-Quality-Report-Guidelines.pdf）：N50 讀長(zhǎng)＞230 kb，比對(duì)率≥70%，每100 kb 14～17 個(gè)標(biāo)記，有效數(shù)據(jù)深度＞80×，陽(yáng)性標(biāo)記偏差率3%～10%，陰性標(biāo)記偏差率6%～15%。在芯片掃描完成后，利用Bionano Access 軟件（v1.7）進(jìn)行基因組的從頭組裝，并通過(guò)與參考基因組（hg19）比對(duì)，實(shí)現(xiàn)各種類(lèi)型SV 的檢出。數(shù)據(jù)分析前設(shè)置過(guò)濾條件如下：（1）CNV 算法：CNV 置信度＞95%，CNV 大小≥500 kb，關(guān)閉CNV masking 過(guò)濾器；（2）SV 算法：SV在對(duì)照人群中發(fā)生頻率≤1%，關(guān)閉SV masking 過(guò)濾器。過(guò)濾后檢索國(guó)際公認(rèn)數(shù)據(jù)庫(kù)，包括ClinGen數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、Ensemble 數(shù)據(jù)庫(kù)、DECIPHER 數(shù)據(jù)庫(kù)、DGV 數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)變異進(jìn)行注釋及分析，并根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南［7］完成變異致病性的判讀。

1.4 CMA 檢測(cè)及分析 按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)從10 mL 羊水中提取基因組DNA。根據(jù)Affymetrix 基因芯片平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行酶切、接頭連接、PCR 擴(kuò)增、磁珠純化、純化產(chǎn)物測(cè)定、DNA片段化、片段末端標(biāo)記、雜交、洗滌染色、掃描。利用ChAS 軟件（v3.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢索UCSC 基因?yàn)g覽器、ClinGen 數(shù)據(jù)庫(kù)、DECIPHER 數(shù)據(jù)庫(kù)、gnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)、DGV 數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)等國(guó)際公認(rèn)數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)ACMG 指南［7-8］將拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）分為致病、可能致病、臨床意義未明（variants of uncertain significance，VOUS），可能良性和良性，并主要報(bào)告＞100 kb 的致病、可能致病的CNV、VOUS 以及涉及明確印記基因致病的6、7、11、14、15、20 號(hào)染色體上＞10 Mb的純合區(qū)域。

1.5 染色體核型分析 取15 mL 羊水接種于2 個(gè)T25 培養(yǎng)瓶中雙線(xiàn)培養(yǎng)。按照G 顯帶染色體核型分析的常規(guī)流程［9］進(jìn)行試驗(yàn)，并參考國(guó)際細(xì)胞遺傳命名系統(tǒng)（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）2020 對(duì)染色體核型進(jìn)行分析［10］。

1.6 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）將備份的羊水細(xì)胞培養(yǎng)至分裂中期，加入秋水仙素破壞紡錘體，再經(jīng)低滲、預(yù)固定和固定后，根據(jù)OGM 提示的易位片段選擇商業(yè)化FISH探針與細(xì)胞雜交。選擇特異性熒光染料復(fù)染后進(jìn)行觀察和分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SPSS 23.0 軟件完成。對(duì)病例的一般資料及OGM 檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料根據(jù)是否符合正態(tài)分布用或中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或率表示。采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間率的比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGM 基因組組裝信息及變異檢出情況 60例樣本DNA 分子平均長(zhǎng)度為（291.65±19.05）kb，平均DNA 分子N50 長(zhǎng)度為（309.41±30.66）kb。經(jīng)過(guò)濾后，單個(gè)樣本中CNVs 的中位檢出量為1（0～6）個(gè)，SVs 的平均檢出量為（76.9±11.0）個(gè)，累及基因的SVs 的平均檢出量為（39.2±6.4）個(gè)。

2.2 OGM 與CMA 聯(lián)合核型分析的檢測(cè)效能 60例病例中各類(lèi)染色體變異的檢出情況見(jiàn)表1。OGM 和CMA 聯(lián)合核型分析的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以hg19 為參考基因組進(jìn)行組裝，OGM 漏檢1 例15q11.2 區(qū)段約507 kb 的致病性微缺失，其在染色體非整倍體、CNV、三倍體檢測(cè)中的敏感性為93.8%，特異性為100.0%。將該漏檢病例的OGM 數(shù)據(jù)再次以hg38 為參考基因組進(jìn)行組裝，該例CNV 能夠被OGM 檢出。

表1 OGM 與CMA 聯(lián)合核型分析在染色體非整倍體、拷貝數(shù)變異及三倍體中的檢出率比較［n（%）］

2.3 OGM 明確重復(fù)插入的位置及方向 在60 例病例中，共檢出6 例病例存在染色體微重復(fù)。OGM提示該6 例病例均為原位串聯(lián)重復(fù)。6 例病例的CMA、OGM 結(jié)果及OGM 提示的斷點(diǎn)區(qū)間見(jiàn)表2。以病例059 為代表病例，OGM 圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 染色體微重復(fù)代表病例（病例059）的OGM 檢測(cè)結(jié)果

表2 染色體微重復(fù)病例CMA 及OGM 結(jié)果及斷點(diǎn)區(qū)間

2.4 OGM 額外檢出隱匿性易位 在60 例病例中，OGM 較CMA 聯(lián)合核型分析額外檢出了2 例（3.3%）隱匿性易位，包括1 例隱匿性非平衡易位和1 例隱匿性平衡易位（表3），且均經(jīng)FISH 驗(yàn)證證實(shí)。其中病例039 孕婦既往曾有2 次稽留流產(chǎn)史。經(jīng)親代溯源，該平衡易位被證實(shí)為父源遺傳。病例039 的OGM 及FISH 驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 隱匿性平衡易位病例（病例039）OGM 及FISH 驗(yàn)證結(jié)果

表3 OGM 額外檢出隱匿性易位的斷點(diǎn)信息

2.5 OGM 檢測(cè)周期及檢測(cè)成功率 用于OGM 檢測(cè)的中位初始羊水投入量為5.5（4～8.5）mL，羊水細(xì)胞培養(yǎng)的中位天數(shù)為12（11～19）d。OGM 檢測(cè)及分析周期約為5 d。OGM 檢測(cè)成功率為100%。

3 討論

OGM 是一種能夠一站式識(shí)別各種主要類(lèi)別SVs 的綜合性檢測(cè)技術(shù)。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，以hg19為參考基因組，OGM 漏檢1 例15q11.2 區(qū)段的復(fù)發(fā)性CNV，該CNV 兩側(cè)斷點(diǎn)位于片段重復(fù)區(qū)。DNA分子在該區(qū)段組裝困難，無(wú)法生成跨越兩側(cè)斷點(diǎn)的OGM 圖譜，因此導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。但總體而言，本研究中OGM 與CMA 聯(lián)合核型分析的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其在以hg38 為參考基因組組裝后，OGM 的敏感性和特異性均達(dá)到100%。本研究再次證實(shí)了OGM 在產(chǎn)前診斷中的有效性及可靠性。

OGM 能夠明確重復(fù)插入的位置及方向。染色體微重復(fù)的致病性可能與三倍劑量敏感、基因內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致閱讀框破壞、基因間復(fù)制斷裂點(diǎn)破壞基因或?qū)е禄蛉诤舷嚓P(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，83%的重復(fù)為原位串聯(lián)重復(fù)，另有17%為易位插入、復(fù)雜結(jié)構(gòu)重排等其他類(lèi)型的重復(fù)，提示了在對(duì)染色體微重復(fù)的致病性評(píng)估中結(jié)合斷點(diǎn)分析的重要性［10］。相較于CMA，OGM 的一大突出優(yōu)勢(shì)為SV 算法的直觀性，其能夠可視化描繪重排模式。本研究中，OGM 提示6 例染色體微重復(fù)均為原位串聯(lián)重復(fù)。盡管本研究未發(fā)現(xiàn)重復(fù)導(dǎo)致基因破壞或基因融合的病例，但已有相關(guān)研究報(bào)道提示了OGM 在全面評(píng)估重復(fù)插入片段致病性中的優(yōu)勢(shì)所在［11］。

OGM 能夠檢測(cè)核型分析無(wú)法識(shí)別的隱匿性染色體重排。平衡性結(jié)構(gòu)重排能夠通過(guò)破壞基因或影響遠(yuǎn)程調(diào)控相互作用而導(dǎo)致表型。近年來(lái)，已有多篇研究［2-3］將OGM 用于不明原因多次不良孕產(chǎn)史以及不孕不育患者的診斷，揭示了OGM 在精細(xì)化斷裂點(diǎn)區(qū)間的優(yōu)勢(shì)所在，認(rèn)為其可作為臨床檢測(cè)隱匿性平衡性染色體重排的一線(xiàn)方法。本研究通過(guò)OGM 診斷了1 例隱匿性平衡易位，并描繪了斷裂點(diǎn)區(qū)間，提示5 號(hào)染色體斷點(diǎn)位于WWC1基因內(nèi)，但該基因與胎兒異常表型無(wú)關(guān)。此外，經(jīng)過(guò)溯源，發(fā)現(xiàn)該平衡易位為父源遺傳，從而為該孕婦兩次稽留流產(chǎn)找到了原因。此對(duì)夫妻再生育可考慮植入前遺傳學(xué)檢測(cè)，從而避免不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。由此可見(jiàn)，OGM 在SV 檢測(cè)中的另一大優(yōu)勢(shì)為高分辨率檢測(cè)隱匿性染色體重排、精細(xì)化斷裂點(diǎn)區(qū)間協(xié)助SV 致病性判讀。

目前OGM 對(duì)產(chǎn)前樣本的要求仍然較高，無(wú)法使用未經(jīng)培養(yǎng)的羊水樣本直接提取DNA。本研究中羊水細(xì)胞中位培養(yǎng)天數(shù)為12 d，檢測(cè)成功率為100%，提示了OGM 應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的可行性。目前OGM 檢測(cè)的限速步驟主要在于羊水細(xì)胞培養(yǎng)以及上機(jī)后數(shù)據(jù)產(chǎn)出及分析過(guò)程。本研究中初始羊水投入量較少，臨床應(yīng)用時(shí)可通過(guò)增加初始羊水投入量以及羊水細(xì)胞接種面積縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。此外，Saphyr 系統(tǒng)若能實(shí)現(xiàn)通量的提升，則可進(jìn)一步縮短診斷周期，以利于OGM 的產(chǎn)前應(yīng)用。

目前OGM 產(chǎn)前應(yīng)用限制主要在于以下幾個(gè)方面。首先，羊水細(xì)胞培養(yǎng)存在失敗風(fēng)險(xiǎn)，診斷周期有待進(jìn)一步縮短；其次，對(duì)于檢出的部分SV 無(wú)法直接進(jìn)行致病性評(píng)估，需結(jié)合測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析；再者，其檢測(cè)效能，尤其是對(duì)于斷點(diǎn)位于片段重復(fù)區(qū)的SV 檢測(cè)的準(zhǔn)確性仍需更多前瞻性數(shù)據(jù)積累及評(píng)估。然而，隨著技術(shù)的完善、算法的優(yōu)化以及Saphyr 系統(tǒng)的進(jìn)一步升級(jí)，OGM 有望成為產(chǎn)前SV檢測(cè)的一線(xiàn)方案。