劍葉鳳尾蕨不同極性部位活性評價及有效成分分離鑒定分析★

韋瑞松，賴紅芳

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院學(xué)院，廣西 河池 546300）

0 引言

劍葉鳳尾蕨（圖1）是鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物，植株各部分均具有一定的藥用價值。該植物在我國南方多地廣泛分布，全年均可采集，鮮用或曬干均可，該植物入藥后，有清熱利濕、涼血止血、消腫解毒等多項(xiàng)功能，以往多用于外用藥物[1-2]。近年來，部分研究人員發(fā)現(xiàn)，劍葉鳳尾蕨中含有多種有機(jī)化合物，其中部分有機(jī)化合物在抗腫瘤活性上較為優(yōu)異，因此有必要對這些化合物作進(jìn)一步分離提純和分析探究，以進(jìn)一步發(fā)揮劍葉鳳尾蕨的藥用價值。

圖1 劍葉鳳尾蕨

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

原材料：劍葉鳳尾蕨全草植株，采集自南方某山區(qū)，并經(jīng)由相關(guān)專家鑒定為劍葉鳳尾蕨全草；實(shí)驗(yàn)試劑：無水甲醇、無水乙醇，分析純；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備如表1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

2 實(shí)驗(yàn)方法與有效成分分析結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)流程

稱取一定量的干燥后的劍葉鳳尾蕨全草，使用95%乙醇對其進(jìn)行提取，此環(huán)節(jié)提取共進(jìn)行3 次，每次提取時間為1 h，提取完成后，對提取液進(jìn)行減壓回收，直至提取液乙醇?xì)馕断橹埂?/p>

在獲得回收的提取液后，將提取液過聚酰胺柱色譜，依次使用去離子水、30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙醇溶液、50%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙醇溶液和無水乙醇進(jìn)行洗脫操作，獲得4 個洗脫部位。而后將這4 個洗脫部位再次過MCI 柱色譜，仍依次使用去離子水、30%乙醇溶液、50%乙醇溶液和無水乙醇進(jìn)行洗脫操作，再將其過MPLC 色譜柱，使用甲醇洗脫后，獲得23 個流分，再將上述流分分別過制備型HPLC[3-4]，該色譜柱中以20%甲醇為流動相，以此得到10 種化合物。

2.2 化合物分析

在通過實(shí)驗(yàn)操作提取得到10 種化合物后，實(shí)驗(yàn)人員對化合物的形狀進(jìn)行觀察和記錄，同時根據(jù)EMI-MS 進(jìn)行對照分析，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，對所獲得的10 種化合物進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果如表2 所示。

表2 化合物鑒定結(jié)果

在本次分離到的10 種化合物中，化合物1～6 為鳳尾蕨屬中特有的化學(xué)物質(zhì)，而化合物7～10 則為劍葉鳳尾蕨中獨(dú)有的化學(xué)物質(zhì)。

2.3 活性初步評價

在分離得到以上10 種化合物后，根據(jù)已有的研究假設(shè)，本環(huán)節(jié)針對劍葉鳳尾蕨中的上述化合物的腫瘤抑制活性進(jìn)行測試，以初步明確其在抗腫瘤藥物應(yīng)用方面的價值。此環(huán)節(jié)中，研究人員分別提取等量的化合物1～10 號，并引入紫杉醇作為陽性藥進(jìn)行對照分析，將以上化合物分別放置于HCT-116、HepG2 和BGC-823 三種典型的腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行測試，測試過程如下：

1）將上述3 種腫瘤細(xì)胞加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞懸濁液含量為1×104個/mL，并在溫度為37 ℃，含5%二氧化碳的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行3 h 的培養(yǎng)。

2）培養(yǎng)完成后，每孔中分別加入不同濃度的待測樣品（本次待測樣品濃度依次為0.32、1.6、8.0、40.0、200.0 mol/L），繼續(xù)培養(yǎng)96 h。

3）培養(yǎng)完成后，取出各個孔的溶液，分別對其進(jìn)行離心處理，再吸去培養(yǎng)液，使用PBS 進(jìn)行一次洗滌。

4）每孔內(nèi)加0.1 mL PBS 和10 μL 的MTT 染液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

5）在每孔中分別加入100 μL 的Formanzan 溶解液。

在上述實(shí)驗(yàn)完成后，使用酶標(biāo)儀對500 nm 處的吸收度進(jìn)行測定，并應(yīng)用Reed-Muench 法進(jìn)行分析計算，分析結(jié)果如表3 所示。

表3 10 種化合物的腫瘤抑制活性測試結(jié)果（取IC50 值） 單位：mol/L

通過表3 中的數(shù)據(jù)可知，在本次提取的劍葉鳳尾蕨中的10 種化合物當(dāng)中，化合物5～8 號這4 種化合物在抑制上述3 種腫瘤細(xì)胞的過程中，發(fā)揮出了中等強(qiáng)度的抑制能力，證明劍葉鳳尾蕨中的部分成分對于腫瘤細(xì)胞抑制方面具有一定功效。

3 不同極性部位的活性評價

雖然劍葉鳳尾蕨中含有一定量的腫瘤細(xì)胞抑制活性成分，但由于劍葉鳳尾蕨植株中各組成部分存在一定的差異性[5]，因此可推斷出，植株各部分的腫瘤細(xì)胞抑制活性成分含量存在一定差異，為此，研究人員嘗試對劍葉鳳尾蕨的不同部位進(jìn)行活性評價。

在此環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)中，研究人員主要根據(jù)劍葉鳳尾蕨的植株結(jié)構(gòu)，將其分解為葉片、莖部和根部3 個部分進(jìn)行對比分析，同時，基于上文的研究結(jié)果，本次只對化合物5～8 號這4 種化合物進(jìn)行測試分析。

在本環(huán)節(jié)的測試分析中，分別選取等量的劍葉鳳尾蕨的葉片、莖部和根部三部分，并按照章節(jié)2.1 的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行化合物的分離和提取，本次針對提取出的化合物5～8 號的含量進(jìn)行比較分析，分析結(jié)果如表4 所示。

表4 劍葉鳳尾蕨不同部位的化合物質(zhì)量 單位：mg

從表4 中的數(shù)據(jù)可見，針對具有抗腫瘤活性的4 種化合物而言，劍葉鳳尾蕨根部的化合物含量最高，莖部次之，而葉片部位的這幾種化合物的含量則最低。由此也可推斷出，劍葉鳳尾蕨的根部具有相對更高的抗腫瘤活性，也最具藥用價值。當(dāng)然，由于根部和莖部的抗腫瘤化合物含量差異不明顯，因此可初步認(rèn)為，劍葉鳳尾蕨莖部和根部在抗腫瘤藥物研究中均具有相對較高的價值，后續(xù)的研究也可在此基礎(chǔ)上加以進(jìn)行。

4 結(jié)語

整體來看，在本次研究中，基于劍葉鳳尾蕨的提取實(shí)驗(yàn)，首先對其提取到的多種化合物進(jìn)行了初步鑒定，并通過化合物細(xì)胞毒活性測試，明確了劍葉鳳尾蕨中具有顯著抗腫瘤活性的幾種化合物，確定了劍葉鳳尾蕨在抗腫瘤藥物研究中的價值。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了劍葉鳳尾蕨不同部位的活性，結(jié)果顯示，劍葉鳳尾蕨的根部與莖部具有相對更高的活性，這也為后續(xù)的研究提供了一定的參考借鑒。