角膜移植術后植片失功患者的病毒學檢測

郭雨欣 孫彬佳 彭榮梅 洪晶

1北京大學第三醫(yī)院眼科 眼部神經(jīng)損傷的重建保護與康復北京市重點實驗室,北京100191;2溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院,溫州325027

角膜植片失功是導致角膜移植手術失敗的直接原因。既往認為,植片失功的主要病因包括角膜移植手術后的免疫排斥反應和植片內(nèi)皮細胞的自然衰竭。隨著角膜移植手術技術及圍手術期用藥的不斷改良和規(guī)范,植片失功的發(fā)生率已明顯下降。然而,近年來有關角膜移植術后病毒感染引起植片失功的報道逐漸增多[1-2],國內(nèi)尚無相關發(fā)病率統(tǒng)計。國外文獻報道,取角膜移植術后失功的植片進行檢測,3.9%～14.3%呈病毒陽性[3-4],可見病毒感染已成為角膜移植手術失敗的重要原因。角膜移植術后病毒感染多為術后數(shù)日至數(shù)年出現(xiàn)的角膜內(nèi)皮炎,其發(fā)病可能與既往隱匿感染漏診、局部組織內(nèi)潛伏病毒激活和角膜植片病毒傳播有關[1-2,5]。裂隙燈顯微鏡下的典型表現(xiàn)為角膜局限或彌漫水腫,并且水腫區(qū)的角膜內(nèi)皮會出現(xiàn)散在或斑塊狀的污穢色素羊脂狀角膜后沉著物(keratic precipitates,KP);部分合并小梁網(wǎng)炎者可出現(xiàn)中度眼壓升高[6]。角膜移植術后患者常規(guī)應用糖皮質激素及免疫抑制劑導致病毒感染的臨床表現(xiàn)往往不典型,臨床診斷時常依賴于房水或角膜組織的病毒PCR檢測。然而,對于病程較長的病例單純應用PCR檢測能否有效診斷病毒感染尚不明確。本研究擬探討角膜移植術后植片失功患者行再次角膜移植手術時病毒學檢測結果以及多種病毒檢測手段的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例對照研究,連續(xù)納入2018年3—12月就診于北京大學第三醫(yī)院眼科、臨床診斷為角膜移植術后植片失功且具有角膜移植手術指征的患者14例作為植片失功組;另外連續(xù)納入同一中心同時期內(nèi)臨床診斷為大泡性角膜病變(bullous keratopathy,BK)且具有角膜移植手術指征的患者15例作為BK組。所有患者入組前根據(jù)自述及既往病歷記錄明確末次角膜移植或內(nèi)眼手術的時間、次數(shù)及具體術式,經(jīng)過最佳矯正視力、iCare回彈式眼壓計、裂隙燈顯微鏡、眼前節(jié)光學相干斷層掃描(anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT)、活體激光掃描共聚焦顯微鏡(invivoconfocal microscopy,IVCM)檢查明確臨床診斷及手術指征,除外前房及角膜內(nèi)皮有明顯炎癥未控制的情況。納入標準:(1)角膜移植術后植片失功 角膜移植術后出現(xiàn)的角膜植片水腫,可伴或不伴KP,AS-OCT檢查顯示角膜均勻水腫、中央厚度>650 μm,IVCM檢查顯示角膜內(nèi)皮細胞密度<500/mm2或測不出。應用試驗性抗病毒、抗排斥治療后未見好轉。(2)BK 內(nèi)眼手術中明確存在角膜內(nèi)皮損傷病史或術后3個月以上出現(xiàn)的角膜水腫,AS-OCT檢查顯示角膜均勻水腫、厚度>600 μm,IVCM檢查顯示角膜內(nèi)皮細胞密度<500/mm2或測不出。排除標準:(1)既往有其他非病毒性角膜或眼內(nèi)感染史;(2)硅油填充眼;(3)患有免疫缺陷性疾病者;(4)BK組中存在既往眼部病毒感染病史者。2個組患者均為單眼發(fā)病,組間性別分布及發(fā)病時間(患者主訴或出現(xiàn)角膜植片水腫/混濁體征至本次角膜移植手術的時間)比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05);植片失功組患者年齡明顯低于BK組,本次發(fā)病距末次角膜移植時間明顯短于BK組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表1)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)北京大學第三醫(yī)院倫理委員會批準(批文號:2017299-02),所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

表1 2個組患者基線特征比較Table 1 Comparison of demographics between two groups組別例數(shù)/眼數(shù)年齡(x±s,歲)a性別構成比(男/女,n)b發(fā)病時間(x±s,個月)a本次發(fā)病距末次角膜移植時間(x±s,個月)a植片失功組14/1442.7±28.17/715.0±24.616.3±17.7BK組15/1562.9±17.09/612.3±11.662.0±58.1t值 -2.326-0.475-2.908P值 0.0300.7150.6390.010 注:(a:獨立樣本t檢驗;b:Fisher精確檢驗) BK:大泡性角膜病變;-:無數(shù)據(jù) Note:(a:Independent samples t-test;b:Fisher exact test) BK:bullous keratopathy;-:no data

1.2 方法

1.2.1標本采集 角膜移植手術當日采集患者靜脈血清標本。角膜移植前通過前房穿刺收集至少0.2 ml房水標本,在植床制備過程中獲取患者全層角膜或內(nèi)皮/后彈力層組織。所有標本均置于無RNA/DNA酶的離心管[愛思進生物技術(杭州)有限公司],-80 ℃保存。

1.2.2手術方法 所有手術均由同一醫(yī)師完成。(1)角膜內(nèi)皮移植術應用于中央角膜厚度<1 000 μm且無明顯基質混濁的患者。術前30 min術眼點用2%毛果蕓香堿3次縮瞳,成年患者采用球后麻醉,兒童采用全身麻醉。植床、植片直徑均為8.0 mm。于上方角膜緣外1.0 mm處制作3.0 mm隧道切口及2～3個1.0 mm側切口,前房內(nèi)注入黏彈劑后,應用反向晶狀體勾剝除標記植床范圍內(nèi)后彈力層,手動注吸吸除前房內(nèi)黏彈劑。應用人工前房及自動微型角膜刀完成厚度為100～120 μm的植片制作,10-0尼龍線牽引輔助植入植片。通過角膜表面擠壓輔助展開、居中內(nèi)皮植片后,前房注入空氣泡支撐、固定植片。(2)穿透角膜移植術應用于中央角膜厚度≥1 000 μm的患者。術前30 min術眼點用2%毛果蕓香堿3次縮瞳,靜脈輸注20%甘露醇250 ml,采用全身麻醉。植床直徑為7.5～8.0 mm,應用角膜環(huán)鉆鉆取角膜深度1/2～3/4,行前房穿刺,前房內(nèi)注入少量黏彈劑,用角膜剪完成植床制作,沖洗眼內(nèi)黏彈劑。植片直徑較植床大0.5 mm,采用10-0尼龍線間斷縫合16針。

1.2.3病毒檢測 檢測病毒種類包括單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)和巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)。(1)實時PCR檢測房水、角膜標本中病毒DNA 應用試劑盒QIAamp DNA Microkit (50)(德國Qiagen公司)提取房水及角膜組織核酸。采用Prism 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行PCR檢測。HSV-1/2、VZV和CMV的引物及探針由標準核酸測定試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)提供。擴增條件:37 ℃預變性2 min,94 ℃變性2 min;93 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)40次;單點熒光檢測在60 ℃,反應體系為40 μl。(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清及房水中病毒抗體含量 由實驗室另一不知曉PCR檢測結果的技術員進行抗體檢測。應用ELISA試劑盒分別檢測房水及血清中HSV-1/2、VZV、CMV的特異性IgG抗體水平(德國維潤賽潤研發(fā)有限公司)以及總IgG抗體水平(美國BD公司),并計算Goldmann-Witmer系數(shù)(Goldmann-Witmer coefficient,GWC)。GWC=(房水特異性IgG抗體滴度/房水總IgG抗體滴度)/(血清特異性IgG抗體滴度/血清總IgG抗體滴度)。若房水標本中某一病毒特異性抗體滴度>9 U/ml且其GWC>3,則認為眼內(nèi)有特異性病毒抗體生成。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 病毒檢測

植片失功組4眼因前房淺在角膜移植術中未獲得足量房水,僅行房水及角膜組織PCR檢測;其余10眼及BK組15眼均進行病毒DNA及抗體檢測。

植片失功組共9眼(9/14)發(fā)現(xiàn)至少一項病毒檢測結果陽性,其中CMV陽性6眼(6/14),VZV陽性3眼(3/14)。植片失功組中,房水PCR陽性5眼(5/14),角膜組織PCR陽性5眼(5/14),房水病毒抗體GWC升高3眼(3/10);其中,存在2種檢測結果陽性者2例(2/10),3種檢測結果均陽性者僅1例(1/10),各檢測方法間一致性差(表2)。BK組2眼(2/15)房水CMV GWC升高,其GWC分別為3.02和4.91,其余均為陰性。植片失功組病毒檢測陽性率為64.2%(9/14),明顯高于BK組的13.3%(2/15),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)。

表2 植片失功組的臨床特征及病毒檢測Table 2 Clinical characteristics and virological analysis results in graft failure group編號性別年齡(歲)眼別發(fā)病時間(個月)本次發(fā)病距末次角膜移植時間(個月)眼部臨床特征病毒檢測陽性術后高眼壓多次角膜移植手術史a既往病毒性角膜炎b房水PCR角膜組織PCRGWC[病毒(數(shù)值)]1男52右123------2男76右30--+CMV--3男65左654------4女50左62+-+--CMV(3.18)5男5左1224++-CMVCMVCMV(9.72)6女6左1248+--VZVVZV-7女59左3612+++-CMVCMV(37.49)8男62左630--+--N/A9女79右618-----N/A10女1左126----CMVN/A11女4右126++--CMVN/A12女29左21+-+---13男51左13---VZV--14男59右951+-+VZV-- 注:a:指本次角膜植片失功前即存在≥2次角膜移植手術史;b:指在首次角膜移植手術前即存在病毒性角膜炎病史;PCR:聚合酶鏈式反應;GWC:Goldmann-Witmer系數(shù);CMV:巨細胞病毒;VZV:帶狀皰疹病毒;N/A:不適用 Note:a:at least twice keratoplasty experience before this graft failure;b:diagnosed with viral keratitis before the initial keratoplasty;PCR:polymerase chain re-action;GWC:Goldmann-Witmer coefficient;CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;N/A:not applicable

2.2 植片失功組病毒檢測陽性與臨床特征的一致性分析

植片失功組中7眼(7/14)出現(xiàn)角膜植片失功前有高眼壓表現(xiàn),3眼(3/14)在本次角膜移植術前即存在≥2次的角膜移植手術史,6眼(6/14)在首次角膜移植術前即存在病毒性角膜炎病史,與術中病毒檢測結果一致性均差(kappa=0.143、-0.155、-0.286)。

3 討論

對于植片失功患者,再次行角膜移植時明確病因至關重要。既往有角膜移植手術史者,對于排斥反應或內(nèi)皮細胞自然衰竭繼發(fā)的植片失功,再次行角膜移植后均建議適當增加糖皮質激素及免疫抑制劑應用強度和時間[7]。而對于病毒感染繼發(fā)的植片失功,大量糖皮質激素及免疫抑制劑反而增加潛伏病毒再激活風險。通過聯(lián)合多種檢測手段,本研究在植片失功患者中發(fā)現(xiàn)9眼(9/14)存在至少一項病毒檢測結果陽性,其中CMV為主要致病原。本研究中病毒陽性率明顯高于既往研究[3-4],分析可能原因為:(1)檢測病毒種類和手段不同。本研究聯(lián)合多種檢測手段篩查HSV、VZV及CMV感染情況,而文獻[3-4]僅通過PCR或免疫組織化學方法檢測HSV-1;(2)本研究中主要致病原為CMV,其所致角膜內(nèi)皮炎在亞洲人群中發(fā)病率明顯高于其他人群。例如,有英國研究者回顧篩查失功角膜植片均未發(fā)現(xiàn)CMV感染[8],而中國臺灣研究者在角膜移植術中行病毒檢測發(fā)現(xiàn)CMV感染率高達36.7%[5]。鑒于CMV感染致植片失功病例報道也多集中在東南亞地區(qū)[9-10],不排除發(fā)病存在種族差異可能。

角膜移植術中進行病毒檢測的另一目的是明確患者眼內(nèi)是否仍存在活動性感染。既往研究中發(fā)現(xiàn),角膜移植時植片或受體若病毒檢測陽性,其術后角膜細胞丟失率明顯升高,且術后植片失功比例更高[1-2,11]。Fernndez López等[9]報道CMV房水陽性病例在角膜內(nèi)皮移植后其植片存活時間僅為(8.0±3.8)個月,而這主要與病毒感染在角膜移植術后復發(fā)有關。Ang等[10]報道,對于既往有CMV性角膜內(nèi)皮炎病史的患者,即使在經(jīng)過成功抗病毒治療、房水PCR檢測轉陰的情況下,角膜內(nèi)皮移植術后1年內(nèi)也仍有60%的復發(fā)率。盡管目前房水的PCR檢測是診斷多種眼內(nèi)病毒感染性疾病的金標準,但我們認為對于慢性病程患者,其實際診斷效能有限。本研究植片失功組中,過半患者(9/14)至少一項病毒檢測結果陽性,其中僅5例(5/14)房水PCR陽性,多種病毒檢測結果一致性較差,這可能為病毒感染在角膜移植術后發(fā)病率高提供了一種解釋。一方面,有3例房水PCR檢測陰性而角膜組織標本檢測陽性。由于角膜移植術中常規(guī)僅涉及中央8～9 mm直徑范圍內(nèi)中央全層或板層角膜,植床或前房內(nèi)的感染灶可能在后期累及植片。另外,2例病例房水PCR檢測結果為陰性但抗體GWC升高,這可能與病毒感染病程后期病理過程已由病毒復制轉為免疫反應有關。文獻報道,病毒性葡萄膜炎發(fā)病超過2個月后也存在房水中難以檢測出病毒核酸的情況[12]。此外,房水中本身細胞含量低也可能導致PCR出現(xiàn)假陰性結果。與單純行房水病毒PCR檢測相比,角膜移植術中聯(lián)合多種檢測手段發(fā)現(xiàn)漏診的活動性感染更有助于指導術后的抗病毒治療及隨訪。

角膜移植術后的病毒感染一直是臨床診療中的難點。近年來,隨著相關病例報道的累積,有研究者試圖總結其臨床表現(xiàn)特點,為診斷提供幫助[6]。例如典型病例常伴發(fā)病毒性前葡萄膜炎,可出現(xiàn)輕中度眼壓升高;既往的病毒性角膜炎病史或反復的角膜移植手術史也可能提示植片失功與病毒感染有關。但在本研究的植片失功組內(nèi),以上因素與病毒檢測結果之間一致性差,這可能與本研究中發(fā)病時間較長有關。角膜移植術后眼壓升高較常見,且病因復雜,難以作為獨立的鑒別點。而既往病毒感染史以及多次角膜植片失功、角膜移植病史,可能會由于早期臨床上病毒檢測手段相對受限,存在一定的誤診、漏診,導致其在鑒別診斷時參考價值有限。綜上,盡管部分病毒感染所致的植片失功可能存在一些特征性臨床表現(xiàn),在考慮再次行角膜移植時,仍建議聯(lián)合多種病毒檢測手段以明確病因。

此外,本研究結果顯示,BK組中2例(2/15)CMV GWC升高,表現(xiàn)為彌漫角膜水腫而不伴明顯前房炎癥反應。偽裝為BK的非典型內(nèi)皮炎文獻中也有報道[13],本研究中2例患者也可能實為內(nèi)皮炎病例。另一可能則是目前通用的GWC陽性閾值(>3.0)設定偏低,對于角膜內(nèi)皮炎或葡萄膜炎的診斷特異性不足。

本研究的局限性主要在于樣本量較小,部分患者在角膜移植術前已應用抗病毒治療,因此病毒檢測結果與角膜植片失功早期的病毒感染發(fā)病情況存在一定差異。另外,由于患者房水量有限,部分病例無法兼顧多種病毒核酸及抗體檢查。若疾病早期能夠通過檢測明確感染的病原體,在后續(xù)角膜移植中則能夠選擇特定病原體的多種檢測手段綜合診斷。

綜上所述,病毒感染為角膜植片失功的常見病因。由于病程較長且臨床表現(xiàn)不典型,再次行角膜移植術中聯(lián)合多種病毒檢測手段有助于明確病因及病毒感染狀態(tài),指導后續(xù)治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明郭雨欣:設計試驗、分析/解釋數(shù)據(jù)、論文撰寫;孫彬佳:設計試驗、實施研究、采集數(shù)據(jù);彭榮梅:分析/解釋數(shù)據(jù)、論文修改審查;洪晶:研究指導、論文修改審查