賽里木酸奶中乳酸菌的分離鑒定及特性分析

何 齊,馮 倩,李 雪,易鴛鴦,顧美英,朱 靜,孫 建,張志東,

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,烏魯木齊 830052;2. 新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】賽里木鎮(zhèn)位于新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣,賽里木酸奶質地粘稠,拉出的長絲能達到1 m左右,又被稱作賽里木拉絲酸奶[1]。乳酸菌在胃腸道中繁衍增殖, 能夠維持腸道菌群動態(tài)平衡、增強機體免疫力[2]。賽里木酸奶雖然具有良好的風味特征,但關于其中微生物組成的研究還不深入,傳統(tǒng)的發(fā)酵方式該種酸奶的微生物組成復雜,組分及其相互作用也不明確。分離、保藏賽里木酸奶中的乳酸菌對于開發(fā)和利用優(yōu)良菌種資源有著重要意義。【前人研究進展】瑪依諾·木圖拉[3]從賽里木酸奶中篩選得到得到2株產(chǎn)粘乳酸菌,分別為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilic)和瑞士乳酸菌(Lactobacillushelveticus);高冬臘[4]在賽里木酸奶中分離得到1株德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus),均具有較好的益生特性。【本研究切入點】有關賽里木酸奶中乳酸菌的分離鑒定及特性分析文獻較少,近些年來,對賽里木酸奶的相關研究在逐漸增加,但賽里木酸奶中微生物資源豐富,需進一步挖掘利用。【擬解決的關鍵問題】以采集到的12種賽里木酸奶為研究對象,篩選鑒定賽里木酸奶中分離得到的乳酸菌,檢測生理生化特性。篩選益生效果好、食用安全的乳酸菌資源,有效擴大特色乳酸菌資源庫和保護利用相關益生資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

賽里木酸奶樣品:分別采自新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣賽里木鎮(zhèn)周邊。

供試菌株:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、青霉菌(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)菌株,均由新疆微生物資源保藏管理中心(Microbiological Culture Collection Center of Xinjiang,MCCCX)提供。

1.1.2 試 劑

無水乙醇、冰乙酸、溴酚藍、吐溫-80、戈盧氏碘液、剛果紅,均為分析純,由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供。

吲哚試劑:取 0.1 g 對二甲氨基苯甲醛,用 5 mL 95%乙醇溶解,然后再緩慢加入 2 mL 濃鹽酸。

α-萘胺試劑:1 g α-萘胺溶于 20 mL 蒸餾水和 150 mL 200 g/L 的乙酸溶液中。

對氨基苯磺酸試劑:0.5 g 對氨基苯磺酸溶于 150 mL 200 g/L 的乙酸溶液中。

抗生素濾紙片:青霉素 10 IU/片、紅霉素 15 μg/片、四環(huán)素 30 μg/片、鏈霉素 10 μg/片、慶大霉素 10 μg/片、卡那霉素 30 μg/片、諾氟沙星 10 μg/片、氨芐西林 10 μg/片、利福平 5 μg/片、萬古霉素 30 μg/片,購自北京天壇生物制品股份有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和 LB 液體培養(yǎng)基,由青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司提供。

生物胺檢測培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g,胰蛋白胨 5.0 g,酵母粉 5.0 g,葡萄糖 0.5 g,檸檬酸銨 2.0 g,NaCl 2.5 g,K2HPO4·7H2O 2.0 g,吐溫-80 1 mL,MgSO40.2 g,CaCO30.1 g,FeSO40.04 g,MnSO40.05 g,VB10.01 g,5-磷酸吡哆醛 0.05 g,溴甲酚紫 0.06 g,瓊脂 20 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 值 5.8～6.0。

改良氨基脫羧酶檢測培養(yǎng)基:分別在生物胺檢測培養(yǎng)基中加入 10 g/L 的對應前體氨基酸(精氨酸、酪氨酸、尸氨酸、色氨酸、組氨酸)。

蛋白胨水培養(yǎng)基:蛋白胨 20 g,氯化鈉 5 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 7.4～7.6。

1.1.4 儀器與設備

超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);自動高壓滅菌鍋(日本 HIRAYAMA 公司);TS 恒溫振蕩器(德國耶拿分析儀器股份公司);PCR儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);生化培養(yǎng)箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司);立式冷藏柜(海爾 HAIER 公司);電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

賽里木酸奶樣品采自新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣,經(jīng)滅菌的 50 mL 離心管分裝,放入車載低溫冰箱保存,采樣結束后分別放入4℃和-80℃冰箱保存,備用。表1

表1 樣品及來源

1.2.2 菌株分離篩選

在無菌條件下吸1 mL 樣品于9 mL的無菌生理鹽水中, 振蕩混勻, 采用梯度稀釋法,將稀釋液在含有1% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上涂布,37℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的細菌單菌落,進一步劃線純化后,轉接至MRS斜面培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h, 4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

該船船型較小，為了提高軸系安裝的工作效率，選用直線校中方法，按連接法蘭上規(guī)定的偏中值進行校中。采用此法安裝和校中軸系時，通常按照從后往前的順序，先按軸系中心線裝好尾軸，然后以尾軸為基準，從船尾向船頭方向一段一段地調(diào)整各段軸的具體位置，并按照規(guī)范要求調(diào)節(jié)每一對連接法蘭上的偏移值和曲折值，最后，以推力軸的前法蘭作為基準對主機進行定位。具體步驟如下：

1.2.3 菌株分子鑒定

挑取少量新鮮的乳酸菌單菌落,以菌株DNA為模板,使用16S rRNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物在進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測之后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

將測序完成的DNA序列利用SeqMan (DNAStar 6.0)軟件進行序列拼接,將得到的菌株的16S rRNA基因序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/)中比對分析,使用MEGA 7.0進行ClustalX多重比對,構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株分類地位。

1.2.4 菌株的生長特性

以MRS液體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基進行菌株的生長溫度、耐鹽、耐酸特性檢驗,在含0.5%豬膽鹽的乳糖膽鹽培養(yǎng)基上進行膽鹽耐受性檢驗,牛奶胨化實驗參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]進行。

1.2.5 菌株的功能性酶活

將各乳酸菌株點接接種至相應功能酶篩選培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3～5 d,測定菌株的蛋白酶、果膠酶、酯化酶、淀粉酶和纖維素酶活性,其中,蛋白酶、果膠酶和酯化酶篩選直接觀察透明圈;淀粉酶篩選用0.1%的碘液染色后觀察透明圈;纖維素酶篩選用0.1%的剛果紅染色后觀察透明圈[6]。

1.2.6 菌株的抑菌活性

將指示菌株大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌,接種于LB液體培養(yǎng)基中,30℃、120 ×g條件下振蕩培養(yǎng)16 h。取100 μL發(fā)酵菌液,均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基。全部菌液平板吸收后,在設定區(qū)域的中央接種菌株,30℃培養(yǎng)48 h,確定出其產(chǎn)抑菌圈性能,充分的沖洗青霉菌、黑曲霉,根據(jù)要求將孢子懸液涂布后點接待測菌株,30℃環(huán)境條件下充分培養(yǎng)48 h后觀察,判斷出其產(chǎn)抑菌圈。

1.2.7 溶血性測定

將乳酸菌株接種到血瓊脂平板上,在37℃下培養(yǎng)48 h,其附近產(chǎn)生透明的溶血環(huán),對應為β-溶血;觀察出現(xiàn)一定尺度的草綠色環(huán),對應為α-溶血;未出現(xiàn)變化的,對應為γ-溶血。以金黃色葡萄球菌作為陽性對照。

1.2.8 有害代謝物質檢測

①生物胺的測定[7]:將活化后的菌株繼續(xù)進行接種培養(yǎng),分別在改良氨基脫羧酶、無前體氨基酸的平板接種,37℃下培養(yǎng)48 h,觀察其顏色,在發(fā)現(xiàn)紫色情況下判斷為陽性,否則為陰性。②吲哚試驗參照王夢嬌[8]試驗。③硝基還原酶活性檢測參照孟丹實驗[9]進行。

1.2.9 菌株的自聚合能力測定

將乳酸菌接種至MRS液體培養(yǎng)基,37℃,120 ×g條件下培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵后菌液在3 000 ×g、4℃條件下離心10 min,棄去上清液,保留菌體,重懸于無菌生理鹽水中,調(diào)節(jié)600 nm下的OD值至0.5,記為A0h)。振蕩混勻30 s,在酶標板中加入400 μL菌懸液,37℃條件下靜置2 h。靜置完成后,吸取200 μL上清液,測定其在,記為A2h,乳酸菌自凝率測定如下所示,取3次重復試驗的平均值[10]。

自凝率(%)=(1-A2h/A0h)×100.

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品測定 3 次取平均值,采用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 酸奶中分離乳酸菌及其生理生化特性鑒定

研究表明,從賽里木酸奶中分離出4種乳酸菌菌分屬于Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4個屬下的4個種。圖1

圖1 賽里木酸奶中乳酸菌的系統(tǒng)進化樹

2.2 菌株的生長特性

研究表明,其中4株乳酸菌在45℃正常生長,沒有異常;所有菌株在生長過程中對5%的NaCl都有良好的耐受性,其中菌株S5-1能耐受7%的NaCl;pH 3.0時不生長,適當?shù)脑黾铀釅A度在pH為4時,開始微弱的生長。在含0.5%豬膽鹽培養(yǎng)基上4株試驗菌株的生長都沒有受到影響。4株試驗菌株的胨化能力均較好,生長過程中并不析出乳清;菌株H4-2發(fā)酵牛奶可產(chǎn)生濃郁香氣,質地柔和細膩。表2

表2 菌株的生長情況

2.3 菌株的自聚合能力測定

研究表明,4種菌株均表現(xiàn)出良好的自聚合能力,自凝率最高的為H4-2,達到83.46%,最低為S5-1,達到67.1%。 圖2

圖2 菌株的自凝率變化

2.4 菌株的功能酶活性

研究表明,4株菌均具有蛋白酶活性,但不具有其他功能酶活性。表3

2.5 菌株的抑菌活性

研究表明,4株菌均對大腸埃希菌有抑制作用,其中D1-3與H4-2的抑菌活性較強;4株菌對金黃色葡萄球菌有抑制作用,其中H4-2的抑菌活性較強;3株菌對枯草芽孢桿菌有抑制作用;僅有H4-2對白色念珠菌有抑制作用,所有菌均不抑制青霉菌和黑曲霉。表4

表4 菌株的抑菌活性

2.6 菌株的生物安全性

研究表明,4株菌的生物安全性都達到較高水平,其中H5-4菌株在含L-色氨酸的平板上陽性,由此可判斷出其產(chǎn)胺性能強,可轉換前體形成色胺,其他的菌株都為陰性。在硝基還原酶檢測結果表明,除H5-4菌株外都不產(chǎn)生硝基還原酶。所有菌株在吲哚實驗中均為陰性結果,并且均不具有溶血性。表5

表5 菌株的有害代謝物質檢測

3 討 論

3.1傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品的品質和與所處地理條件之間存在密切聯(lián)系,是因為當?shù)氐臍夂?、環(huán)境等因素對乳制品中微生物的種群特征會產(chǎn)生明顯影響[11]。在食品風味物質形成過程中,微生物群落的作用很重要,同時也和食物的儲藏密切相關[12]。研究傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的微生物菌群結構,在分析發(fā)酵進程方面也有較高的應用價值,同時也可為產(chǎn)地溯源系統(tǒng)的建立提供依據(jù)和支持[13]。

3.2賽里木酸奶獨特風味的形成與其復雜的微生物組成有著直接的關系,高冬臘[4]在賽里木酸奶中利用高通量測序發(fā)現(xiàn),酸奶中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門,優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬和鏈球菌屬。王子涵[14]利用高通量測序技術在賽里木酸奶中得到的結果基本相同,酸奶中鏈球菌屬為優(yōu)勢菌屬,其次為乳桿菌屬。研究在阿克蘇地區(qū)賽里木鎮(zhèn)周邊收集到12份賽里木酸奶樣品,分離篩選得到36株乳酸菌,經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定為Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4個屬下的4個種,分別為S5-1(Eremococcuscoleocola)、H4-2(Lentilactobacilluskefiri)、H5-4(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)及D1-3(Streptococcusthermophilus)。

3.3乳酸菌作為典型的益生菌,具有多種益生特性,但乳酸菌需要經(jīng)過胃腸道轉運,粘附在宿主腸道的上皮細胞表面實現(xiàn)腸道定植,是乳酸菌能夠更好發(fā)揮其益生功能的關鍵。由于胃腸道中存在的胃酸及膽汁,乳酸菌必須具有一定的耐酸和耐膽鹽能力[15, 16]。研究中4株乳酸菌在生長過程中對5%的NaCl都有良好的耐受性,其中菌株S5-1能耐受7%的NaCl,并均具有一定的耐酸能力。自聚合能力也是評價乳酸菌粘附性能的重要因素之一,也是益生菌粘附于腸道,作為生物屏障發(fā)揮功能的基礎[10],4種菌株均表現(xiàn)出良好的自聚合能力,自凝率最高的為H4-2,達到83.46%,最低為S5-1,達到67.1%。

3.4乳酸菌的抗菌能力,是其眾多益生功能中的一個重要特性,能夠避免胃腸道感染的出現(xiàn)[17]。王融等[18]在研究魚類腸道乳酸菌時發(fā)現(xiàn),腸道乳酸菌在生長過程中會分泌出胞外物質,這種物質可以將病原菌與胃腸道黏膜隔絕開來,此外腸道乳酸菌還會與病原菌競爭營養(yǎng)物質,同時分泌出具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物,進而達到抑制病原菌生長繁殖的效果。蔡靜靜等[19]在新疆伊犁地區(qū)乳制品中分離得到7株對大腸埃希氏菌具有較好抑制性的乳酸菌。研究中4株乳酸菌均對大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用,其中H4-2的抑菌活性較強;3株菌對枯草芽孢桿菌有抑制作用;僅有H4-2對白色念珠菌有抑制作用。不同乳酸菌之間抑菌范圍及抑菌效果均存在較大差異,可能是由于不同乳酸菌所產(chǎn)生的的代謝產(chǎn)物不同,仍需進一步研究。

3.5生物胺是一種含氮化合物,具有一定的生物活性[20],生物體內(nèi)普遍存在著微量的生物胺,并且承擔著重要的生理功能[21-23],但生物胺攝入過量會引起多種不良反應[24-26]。

4 結 論

在12種賽里木酸奶樣品中篩選得到4種乳酸菌,分屬于Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4個屬下的4個種,試驗菌株可耐受0.5%膽鹽,0.5%NaCl,且具有較好耐高溫、牛奶胨化和抑制細菌等特性,并展現(xiàn)出良好的自聚合能力。4株乳酸菌均不溶血,且吲哚檢測試驗均呈陰性,除H5-4外均不產(chǎn)生硝基還原酶及生物胺。