灰棗擴(kuò)展蛋白基因ZjEXPA8的克隆及序列分析

靳 娟,蘇比娜·肖克來(lái)提,阿布都卡尤木·阿依麥提,楊 磊,郝 慶,樊丁宇

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹(shù)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)植物,是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種[1]。棗營(yíng)養(yǎng)豐富,抗逆性強(qiáng)。新疆是我國(guó)最大的優(yōu)質(zhì)干棗產(chǎn)區(qū),其中灰棗是最重要的主栽品種,但其自然坐果率較低[2]。研究灰棗的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理對(duì)改良灰棗品種和提高產(chǎn)量具有重要意義。對(duì)灰棗花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,鑒定到一個(gè)擴(kuò)展蛋白基因(Expansin-A8,ZjEXPA8)在花發(fā)育不同時(shí)期均上調(diào)表達(dá)[3],研究其序列特征,為分析ZjEXPA8基因在灰棗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用和功能奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】擴(kuò)展蛋白是植物中一類重要的細(xì)胞壁蛋白,能夠打斷細(xì)胞壁多糖之間之間的非共價(jià)鍵,使細(xì)胞壁松弛,促進(jìn)細(xì)胞伸展與分裂[4]。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同,擴(kuò)展蛋白基因家族被分為EXPA(Expansin A)、EXPB(Expansin B)、EXLA(Expansin-like A)和EXLB(Expansin-like B)四個(gè)亞家族[5],其中EXPA和EXPB是2個(gè)最大的亞家族[6]。蔡兆琴等[7]以甘薯為材料,對(duì)擴(kuò)展蛋白基因IbEXPA4 進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,結(jié)果表明甘薯IbEXPA4基因的表達(dá)能促進(jìn)塊根縱向和橫向生長(zhǎng),參與了甘薯塊根的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。Bajwa等[8]在當(dāng)?shù)孛藁ㄆ贩NNIAB 846上過(guò)表達(dá)GhEXPA8基因可以明顯促進(jìn)棉纖維的伸長(zhǎng)。趙灣灣等[9]研究發(fā)現(xiàn),隨著果實(shí)成熟軟化程度提高,番木瓜CpEXPA2基因表達(dá)量也相應(yīng)提高,該基因可能參與了番木瓜果實(shí)成熟軟化過(guò)程。擴(kuò)展蛋白在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。【本研究切入點(diǎn)】目前,關(guān)于灰棗擴(kuò)展蛋白基因調(diào)控果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)理研究較少,前期在灰棗轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)ZjEXPA8基因在不同發(fā)育時(shí)期均上調(diào)表達(dá),需該基因與灰棗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)性。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)ZjEXPA8基因進(jìn)行克隆,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在灰棗不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況,研究ZjEXPA8基因在灰棗果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用,為灰棗遺傳改良和新品種培育提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 灰 棗

供試品種為灰棗,采集地點(diǎn)為新疆阿克蘇地區(qū)阿克蘇市試驗(yàn)林場(chǎng),樹(shù)齡10 年生,株行距2 m×4 m,樹(shù)形為自然開(kāi)心形,棗園水肥投入到位,管理水平較好。分別采集蕾黃期、萼片展平期、花絲萎蔫期、子房膨大期和幼果期5個(gè)時(shí)期的棗花和幼果樣本。樣品采集后立即在液氮中冷凍,并保存在-80℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑

植物多糖多酚總RNA提取試劑盒Quick RNA isolation Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fasting RT Kit(With gDNA)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒和DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;南京諾唯贊公司的2×TaqMaster Mix;pEASY-Blunt克隆載體和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司;抗生素卡那霉素(Kan)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒購(gòu)自TAKARA公司;所用引物均在上海生工公司合成。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

采用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒,按照說(shuō)明書中的操作流程進(jìn)行,提取不同發(fā)育時(shí)期灰棗花的總RNA,提取完成后,使用Nanophotometer-N60核酸檢測(cè)儀檢測(cè)所有樣品的RNA濃度與純度,再用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性,篩選出質(zhì)量提取質(zhì)量較高的RNA樣品,保存于-80℃冰箱中。使用Fasting RT Kit(With gDNase)試劑盒將得到的總RNA模板反轉(zhuǎn)錄合成灰棗花的cDNA。

1.2.2 灰棗ZjEXPA8基因克隆

根據(jù)前期研究發(fā)布的灰棗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(PRJNA588582)篩選獲得目的基因ZjEXPA8,并在NCBI查找獲得ZjEXPA8基因的CDS序列,利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)克隆引物,上游引物為5’-GTACCATGGCTAATATTTCTGCATA-3’(ZjEXPA8-F),下游引物為5’- GCGTCGACGAATTGGCTACCCTC-3’(ZjEXPA8-R)。以反轉(zhuǎn)錄得到蕾黃期的灰棗花cDNA為模板,利用2×TaqMaster Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:cDNA 0.5 μL,ZjEXPA8-F和ZjEXPA8-R引物各1 μL,2×TaqMaster Mix 10 μL,ddH2O 補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 3 min,95℃ 15 s,57℃ 20 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)。利用DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,并將其連接至pEASY-Blunt載體上,并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑選陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)

通過(guò)在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)灰棗ZjEXPA8編碼的氨基酸進(jìn)行分析,包括蛋白分子量和等電點(diǎn)等;利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析ZjEXPA8編碼蛋白的氨基酸序列的疏水性/親水性;利用NCBI的Conserved domains database數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析ZjEXPA8的結(jié)構(gòu)域;用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)ZjEXPA8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用SWISS-Model(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測(cè)ZjEXPA8蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu);利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜域;利用DNAMAN軟件比對(duì)分析ZjEXPA8序列;用MEGA7.0軟件對(duì)不同物種的ZjEXPA8基因編碼的氨基酸序列以鄰接法來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)已獲得的ZjEXPA8基因序列,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,上游引物為5’- ATGCCGGATCTAAGCCCTCT -3’(QZjEXPA8-F),下游引物為5’-CATACCCACAAGCACCTCCCAT’ (QZjEXPA8-R)。以棗ZjActin為內(nèi)參基因,將不同發(fā)育時(shí)期灰棗花和幼果期的cDNA為模板,采用qTOWER3G熒光定量PCR儀檢測(cè)ZjEXPA8基因在不同發(fā)育時(shí)期灰棗花和幼果中的表達(dá)水平,用內(nèi)參基因檢測(cè)擴(kuò)增效率一致性。熒光定量反應(yīng)體系為cDNA 1 μL,QZjEXPA8-F和QZjEXPA8-R引物各0.5 μL,2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 15 min,95℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 20 s,40個(gè)循環(huán),重復(fù)3次。實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析計(jì)算。用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰棗ZjEXPA8基因克隆

研究表明,灰棗ZjEXPA8基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為762 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼253個(gè)氨基酸,以ATG 為起始密碼子,TAG為終止密碼子。圖1,圖2

注:M.DL2000 DNA Marker;1, 2: ZjEXPA8

2.2 灰棗ZjEXPA8基因的生物信息學(xué)

研究表明,ZjEXPA8蛋白中甘氨酸Gly含量最高,占全部氨基酸的13.8%;而谷氨酸Glu,組氨酸His和甲硫氨酸Met含量相對(duì)較少,分別占全部氨基酸的0.8%,1.6%和1.6%?；覘梈jEXPA8帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為10,帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為13;不穩(wěn)定系數(shù)為30.09,屬于穩(wěn)定蛋白。預(yù)測(cè)ZjEXPA8基因編碼的氨基酸序列的分子式為C1192H1787N327O360S14,分子量為 26.91 kDa,等電點(diǎn)為8.32。表1

表1 ZjEXPA8編碼蛋白的氨基酸組成

灰棗花ZjEXPA8基因編碼的氨基酸中,第13位的氨基酸殘基的疏水性均最強(qiáng),為2.933,第207位的氨基酸殘基親水性最強(qiáng),為-2.322。該蛋白脂肪指數(shù)為66.72,總親水性平均數(shù)為-0.107,預(yù)測(cè)ZjEXPA8屬于親水蛋白。圖3

圖3 ZjEXPA8編碼蛋白親水/疏水性的預(yù)測(cè)

ZjEXPA8基因編碼的253個(gè)氨基酸中,無(wú)規(guī)則卷曲占比最高,為51.78%,α螺旋占15.81%,延伸鏈占23.32%,β-轉(zhuǎn)角占9.09%,與SWISS-MODEL三維建模的結(jié)果相吻合。該蛋白含有DPBB_1和Pollen_allerg_1 2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。該蛋白沒(méi)有跨膜域。圖4～6

圖5 ZjEXPA8蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 ZjEXPA8蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.3 灰棗ZjEXPA8基因的同源序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

研究表明,灰棗ZjEXPA8基因編碼的氨基酸序列與大豆(Glycinemax,XP_003523276.1,GmEXPA8)的相似性最高,為93.13%;與蔓花生(Arachisduranensis,XP_015945084.1,AdEXPA8)、木薯(Manihotesculenta,XP_021617395.1,MeEXPA8)、柱花草(Stylosanthesguianensis,QHQ74416.1,SgEXPA8)、橡膠(Heveabrasiliensis,XP_021684783.1,HbEXPA8)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula,XP_013461515.1,MtEXPA8)、麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas,XP_012091147.1,JcEXPA8)、巨桉(Eucalyptusgrandis,XP_018732353.2,EgEXPA8)、番櫻桃(Syzygiumoleosum,XP_030441410.1,SoEXPA8)、阿月渾子(Pistacia vera,XP_031271261.1,PvEXPA8)、甜橙(Citrus sinensis,KAH9702866.1,CsEXPA8)、楊梅(Morellarubra,KAB1217588.1,MrEXPA8)、番木瓜(Caricapapaya,XP_021904225.1,CpEXPA8)和棉花(Gossypiumhirsutum,XP_016686328.1,GhEXPA8)的相似性分別為92.03%、90.76%、90.44%、90.12%、90.04%、89.60%、89.24%、88.93%、88.80%、88.58%、88.40%、87.80%和7.80%。與模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_181593.1,AtEXPA8)的相似性最低,為78.74%。圖7

圖7 ZjEXPA8的氨基酸序列與其他植物EXPA8氨基酸序列比對(duì)

灰棗ZjEXPA8基因與橡膠(Heveabrasiliensis,XP_021684783.1,HbEXPA8)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_181593.1,AtEXPA8)的親緣關(guān)系最近。圖8

圖8 ZjEXPA8蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化

2.4 灰棗ZjEXPA8基因表達(dá)

研究表明,灰棗ZjEXPA8基因在棗花發(fā)育不同時(shí)期(蕾黃期、萼片展平期、花絲萎蔫期、子房膨大期)和幼果期均有表達(dá),蕾黃期表達(dá)量最高,萼片展平期次之,該基因可能主要在蕾黃期和萼片展平期發(fā)揮作用。圖9

注:L.蕾黃期;H.萼片展平期;S.花絲萎蔫期;G.子房膨大期;Y.幼果期

3 討 論

3.1棗(ZiziphusjujubaMill.)是我國(guó)重要栽培果樹(shù)和生態(tài)樹(shù)種[10]。目前在全疆59個(gè)縣市區(qū)廣泛種植。2019年底[11]新疆紅棗種植面積44.52 ×104hm2(含兵團(tuán)10.04×104hm2)、產(chǎn)量372.77×104t(含兵團(tuán)200.33×104t)?；覘検切陆耘嗝娣e最大的主栽品種,其花量大,但落花落果嚴(yán)重,自然坐果率極低[2]。

3.2ZjEXPA8基因在花發(fā)育不同時(shí)期均上調(diào)表達(dá),其可能在灰棗果實(shí)生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]。研究利用RT-PCR方法克隆獲得灰棗擴(kuò)展蛋白ZjEXPA8基因,該基因全長(zhǎng)為762 bp,編碼253個(gè)氨基酸,蛋白分子量為 26.91 kDa,不穩(wěn)定系數(shù)為30.09,總親水性平均數(shù)為-0.107,屬于穩(wěn)定親水蛋白。ZjEXPA8蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析含有DPBB_1和Pollen_allerg_1兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,與甘薯IbEXPA4蛋白的結(jié)構(gòu)相似[7],其屬于EXPA 亞家族。同源序列比對(duì)結(jié)果顯示,ZjEXPA8蛋白與大豆GmEXPA8的相似度最高,達(dá)93.13%,蔓花生AdEXPA8次之,相似度達(dá)92.03%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,ZjEXPA8基因與橡膠HbEXPA8和擬南芥AtEXPA8基因的親緣關(guān)系最近。

3.3擴(kuò)展蛋白在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中扮演著重要角色[12]。擴(kuò)展蛋白參與種子萌發(fā)[13]、葉片生長(zhǎng)[14]、根系發(fā)育[15]、花芽發(fā)育[16]、果實(shí)成熟[17]等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。研究中,灰棗ZjEXPA8基因在棗花發(fā)育不同時(shí)期均有表達(dá),蕾黃期表達(dá)量最高,萼片展平期次之,該基因可能主要在蕾黃期和萼片展平期發(fā)揮作用。研究探明了灰棗ZjEXPA8的基因序列和結(jié)構(gòu)特征,但是該基因在灰棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用和功能還有待于進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié) 論

克隆獲得了灰棗擴(kuò)展蛋白ZjEXPA8基因,開(kāi)放閱讀框?yàn)?62 bp,編碼253個(gè)氨基酸,蛋白分子量為 26.91 kDa。ZjEXPA8基因編碼的蛋白與大豆GmEXPA8的同源性最高,親緣關(guān)系上與橡膠HbEXPA8和擬南芥AtEXPA8最近。ZjEXPA8基因在灰棗花蕾黃期表達(dá)量最高。