miR-218-5p/ GTSE1調(diào)控軸抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲

王攀登,劉 濤,2,張 天,吳 鯀

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院 心胸血管外科,廣西 南寧 530001;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸心外科,廣西 南寧 530001)

肺癌作為全球最常見的惡性腫瘤之一［1],主要包括小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩大類,非小細(xì)胞肺癌中最為普遍的為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)［2]。近年來,盡管各種診斷、治療方法均有大幅度的提高,但肺癌患者的5年生存率僅為 16%左右［3]。G2期/S期應(yīng)答相關(guān)蛋白1(G2and S phase-expressed-1,GTSE1)是由人GTSE1基因編碼的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,主要調(diào)節(jié)G1/ S細(xì)胞周期的過渡［4]。研究表明GTSE1在幾種癌癥中都表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào),并且GTSE1的敲除能夠減少癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［5-9]。GTSE1在肝細(xì)胞癌中與不良預(yù)后相關(guān),預(yù)示GTSE1可能代表了有希望的分子靶標(biāo)［10]。但是,GTSE1在肺腺癌中的表達(dá)情況、作用機(jī)制以及生存預(yù)后關(guān)系尚不明確。本研究分析了GTSE1在肺腺癌中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系,挖掘了GTSE1上游調(diào)控miRNA,并且通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GTSE1的作用機(jī)制,目的是探索肺腺癌的發(fā)病機(jī)制,為靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、細(xì)胞外基質(zhì)凝膠購自美國Sigma公司;sh-NC、sh-GTSE1、oe-NC、oe-GTSE1、miR-218-5p mimic和mimic NC、miR-218-5p inhibitor和inhibitor NC均購自美國Genecopoeia公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑、BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國DBI Bioscience公司;SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒購自德國QIAGEN公司;蛋白酶抑制劑購自中國博奧森公司;放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)緩沖液、細(xì)胞增殖試劑CCK8購自中國碧云天公司;PVDF膜上購自美國Millipore公司;一抗兔多克隆抗體GTSE1、雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Proteintech公司;一抗兔單克隆抗體GAPDH及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自英國Abcam公司;pGL3啟動子載體購自中國金斯瑞公司;海腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-TK購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所使用細(xì)胞系信息如下:人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B(BNCC338205)和人肺腺癌細(xì)胞系PC-9(BNCC340767),A549(BNCC341254),PAa(BNCC341415),Calu-3(BNCC338514)均購自中國北納生物公司。所有細(xì)胞系均在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將2×105個肺腺癌細(xì)胞接種于六孔板中,待細(xì)胞生長至60%左右時,根據(jù)說明書,使用Lipofectamine 2000對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR 用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA。取1 μg總RNA合成cDNA,即通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量擴(kuò)增。使用ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)檢測。U6和GAPDH分別作為miR-218-5p和GTSE1的內(nèi)參。引物序列見表1,結(jié)果使用2-ΔΔCt值來量化和歸一化處理。

1.2.4 蛋白免疫印跡 肺腺癌細(xì)胞中的總蛋白在含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)緩沖液中裂解。使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白用15% SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂乳室溫封閉1 h,與一抗4 ℃下過夜。隨后,在室溫下用二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)孵育1 h。最后于光學(xué)發(fā)光儀掃描顯影。抗體信息如下:一抗兔多克隆抗體GTSE1(21319-1-AP,1∶4 000),一抗兔單克隆抗體GAPDH(ab181602,1∶10 000),二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP,ab205718,1∶20 000)。

1.2.5 CCK8實(shí)驗(yàn) 在96孔板中接種100 μL濃度為4×104個/mL轉(zhuǎn)染成功的肺腺癌細(xì)胞懸液,在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 、48 、72 、96 h。在檢測之前,加入10 μL/孔細(xì)胞增殖試劑CCK8并在37 ℃和5% CO2下孵育4 h。根據(jù)制造商說明,使用SpectraMax M5在450 nm波長下測量各組的吸光度。

1.2.6 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系以每孔1 500個細(xì)胞接種到6孔板中,在含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng),培養(yǎng)基每3天更換1次。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)14 d后,用乙醇固定,再用0.1%結(jié)晶紫染色,計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù),重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。

1.2.7 遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn):胰蛋白酶分離肺腺癌細(xì)胞后,PBS洗滌,在無血清培養(yǎng)基中重懸。上室接種肺腺癌細(xì)胞(1×104/孔),在下室添加含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后,去除過濾器上表面未遷移的細(xì)胞,用0.5%結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并拍照。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致,不一樣的是侵襲實(shí)驗(yàn)需要在上室涂20 μg細(xì)胞外基質(zhì)凝膠。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將野生型GTSE1 3′UTR序列和突變型GTSE1 3′UTR序列插入pGL3啟動子載體,構(gòu)建GTSE1-WT和GTSE1-MUT報(bào)告基因質(zhì)粒。海腎熒光素酶表達(dá)載體pRL-TK作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染36 h后,使用雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.2.9 生信分析 從TCGA-LUAD中下載肺腺癌的mRNA的表達(dá)量數(shù)據(jù)(正常樣本為46,腫瘤樣本為521)、miRNA成熟體數(shù)據(jù)(正常樣本為59,腫瘤樣本為535)和臨床數(shù)據(jù),利用“edgeR”包miRNA進(jìn)行正常樣本組和腫瘤樣本組的差異分析(|logFC|>1.5,padj<0.05)獲得差異miRNA,利用“survival”對目標(biāo)mRNA進(jìn)行生存分析,利用starBase(http://starbase.sysu.edu. cn/index.php)數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因mRNA的上游miRNA,并與下調(diào)的DEGs取交集,通過Pearson相關(guān)性分析確定目標(biāo)基因miRNA。

2 結(jié)果

2.1GTSE1在肺腺癌細(xì)胞系中高表達(dá) 由TCGA-LUAD中肺腺癌的mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,GTSE1在肺腺癌組織中顯著高表達(dá)(圖1A),與stage Ⅰ+Ⅱ組相比,stage Ⅲ+Ⅳ組肺腺癌患者的GTSE1表達(dá)顯著升高(圖1B),且生存分析顯示與GTSE1低表達(dá)患者相比,GTSE1高表達(dá)的患者生存率顯著降低(圖1C)。為了探討GTSE1在肺腺癌惡性進(jìn)展中的潛在作用,檢測了GTSE1在不同人肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。qRT-PCR檢測結(jié)果如圖1D所示,與人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)相比,GTSE1在人肺腺癌細(xì)胞系(PC-9、 A549、 PAa、Calu-3)中的mRNA表達(dá)量均顯著升高。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺腺癌細(xì)胞系中GTSE1的蛋白表達(dá)水平與人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)相比顯著增加(圖1E),結(jié)果證實(shí)GTSE1在肺腺癌中高表達(dá)。之后,選擇表達(dá)相對較高的PC-9和表達(dá)相對較低的A549進(jìn)行后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)。

A:GTSE1在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況,藍(lán)色箱圖表示正常樣本,紅色箱圖表示腫瘤樣本;B:stage Ⅰ+Ⅱ組和stage Ⅲ+Ⅳ組肺腺癌患者的GTSE1的表達(dá)情況,藍(lán)色小提琴圖表示stage Ⅰ+Ⅱ組患者,橙色小提琴圖表示stage Ⅲ+Ⅳ組患者;C:GTSE1表達(dá)量對肺腺癌患者生存期的影響,紅色為高表達(dá)組,藍(lán)色為低表達(dá)組;D:qRT-PCR檢測在肺腺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞中GTSE1的mRNA表達(dá)水平;E、F:Western blot檢測在肺腺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞中GTSE1的的蛋白表達(dá)水平。圖1 GTSE1在肺腺癌中高表達(dá)與患者生存預(yù)后相關(guān)

2.2 高表達(dá)的GTSE1能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖 在肺腺癌細(xì)胞系PC-9和A549中分別過表達(dá)和抑制GTSE1的表達(dá),并用qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示與sh-NC組相比,肺腺癌細(xì)胞的sh-GTSE1組中GTSE1表達(dá)顯著下調(diào);與oe-NC組相比,oe-GTSE1組中GTSE1表達(dá)顯著上調(diào)(圖2A),說明轉(zhuǎn)染效果較好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。接著,通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)分析GTSE1對肺腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,在GTSE1表達(dá)抑制的肺腺癌細(xì)胞系中,細(xì)胞活力顯著降低(圖2B);而過表達(dá)GTSE1后,細(xì)胞活力顯著提升(圖2C)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,在GTSE1表達(dá)抑制的PC-9和A549細(xì)胞中,細(xì)胞增殖被顯著抑制(圖2D);反之,在GTSE1過表達(dá)的PC-9和A549細(xì)胞中,細(xì)胞增殖能力顯著提升(圖2E),與CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由此可見GTSE1可能在肺腺癌進(jìn)展過程中發(fā)揮促癌作用,影響癌癥進(jìn)程。

A:通過qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的PC-9和A549細(xì)胞系中GTSE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平;B:CCK8檢測sh-GTSE1組及對照組的細(xì)胞活力;C:CCK8檢測oe-GTSE1組及對照組的細(xì)胞活力;D:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測sh-GTSE1組及對照組的細(xì)胞克隆形成能力;E:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測oe-GTSE1組及對照組的細(xì)胞克隆形成能力;與sh-NC組、oe-NC組比較,*:P<0.05;**:P<0.01。圖2 高表達(dá)的GTSE1能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖

2.3 高表達(dá)的GTSE1能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲 癌癥的重要特征之一就是癌細(xì)胞能夠向遠(yuǎn)處擴(kuò)張,而細(xì)胞遷移和侵襲是這一過程中的重要步驟。因此,在實(shí)驗(yàn)中分別使用了沒有基質(zhì)凝膠和有基質(zhì)凝膠的Transwell方法來研究細(xì)胞的遷移和侵襲。從圖3A中可以看到,與sh-NC相比較,轉(zhuǎn)染sh-GTSE1的PC-9和A549細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)量顯著下降;反之,轉(zhuǎn)染oe-GTSE1的PC-9和A549細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)量顯著多于oe-NC組。同樣地,與sh-NC組相比,sh-GTSE1組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力受到顯著抑制;而與oe-NC組相比,oe-GTSE1組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)(圖3B)。由此可見,GTSE1參與了肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控,可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲。

2.4GTSE1是miR-218-5p下游調(diào)控的靶點(diǎn) 為進(jìn)一步探究GTSE1對肺腺癌的分子調(diào)控機(jī)制,從TCGA-LUAD中下載肺腺癌的miRNA成熟體,并利用“edgeR”包分別對正常樣本組和腫瘤樣本組的miRNA進(jìn)行差異分析(|logFC|>1.5,padj<0.05),共獲得184個差異miRNA(其中上調(diào)145個,下調(diào)39個,圖4A)。 接著,通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測GTSE1的上游目標(biāo)miRNA,將預(yù)測結(jié)果與下調(diào)的39個差異miRNA取交集,獲得3個與GTSE1具有靶向結(jié)合位點(diǎn)的差異miRNA(圖4B)。對GTSE1與這3個miRNA進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-218-5p與GTSE1負(fù)相關(guān)性最高(圖4C),且分析發(fā)現(xiàn)miR-218-5p在肺腺癌組織中極顯著低表達(dá)(圖4D)。與stage Ⅰ+Ⅱ組相比,stage Ⅲ+Ⅳ組肺腺癌患者的miR-218-5p表達(dá)無顯著差異(圖4E),生存分析結(jié)果表明miR-218-5p低表達(dá)的肺腺癌患者與高表達(dá)患者相比生存率無顯著差異(圖4F)。同時,通過qRT-PCR在細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)對照比較,miR-218-5p在4株肺腺癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)出顯著低表達(dá)(圖4G),這與在組織中的分析結(jié)果一致。因此選擇miR-218-5p作為后續(xù)研究對象。

A:Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測sh-GTSE1及sh-NC,oe-GTSE1及oe-NC處理肺腺癌細(xì)胞系(PC-9和A549)后對細(xì)胞遷移能力的影響(×100);B:Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測sh-GTSE1及sh-NC,oe-GTSE1及oe-NC處理肺腺癌細(xì)胞系(PC-9和A549)后對于細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)。圖3 高表達(dá)的GTSE1能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲

為了驗(yàn)證miR-218-5p與GTSE1的靶向結(jié)合關(guān)系,本研究構(gòu)建了野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體,并將這些質(zhì)粒和NC mimic、miR-218-5p mimic共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中,隨后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-218-5p會顯著降低野生型GTSE1 3′-UTR熒光素酶活性,而對突變型GTSE1 3′-UTR熒光酶素活性沒有影響(圖4H)。接著,將mimic NC,miR-218-5p mimic,inhibitor NC,miR-218-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)染至肺腺癌細(xì)胞PC-9和A549中,檢測細(xì)胞中GTSE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-218-5p時GTSE1的表達(dá)顯著下降,而抑制miR-218-5p表達(dá)時GTSE1的表達(dá)則顯著上升(圖4I～J)。因此,認(rèn)為在肺腺癌中,miR-218-5p靶向下調(diào)GTSE1的表達(dá)。

2.5 miR-218-5p通過下調(diào)GTSE1來抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲 在肺腺癌細(xì)胞系中,已經(jīng)證實(shí)了miR-218-5p為低表達(dá),接著為了更好的驗(yàn)證miR-218-5p在肺腺癌細(xì)胞中是否發(fā)揮抑癌作用及對GTSE1的調(diào)控作用,本研究進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。首先,構(gòu)建了以下分組:mimic NC+oe-NC,mimic NC+oe-GTSE1,miR-218-5p mimic+oe-NC,miR-218-5p mimic+oe-GTSE1,并用qRT-PCR和Western blot檢測GTSE1的表達(dá)情況,結(jié)果顯示單獨(dú)過表達(dá)GTSE1后GTSE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上升,單獨(dú)過表達(dá)miR-218-5p后GTSE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),而同時過表達(dá)miR-218-5p和GTSE1后GTSE1表達(dá)得到恢復(fù)(圖5A)。CCK8和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中,可以看到轉(zhuǎn)染oe-GTSE1后腫瘤細(xì)胞的活力和克隆形成能力顯著升高,轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimic的PC-9和A549細(xì)胞系中,癌細(xì)胞的活力與克隆形成能力均顯著下降;但是,在miR-218-5p和GTSE1同時過表達(dá)時,細(xì)胞的增殖和克隆形成能力得到了明顯的恢復(fù),恢復(fù)到mimic NC+oe-NC組水平(圖5B、C)。此外,本研究也對各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移與侵襲能力也進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖5D、E所示,與mimic NC+oe-NC組相比,mimic NC+oe-GTSE1組的遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng),miR-218-5p mimic+oe-NC組的遷移與侵襲能力均被顯著抑制,而在轉(zhuǎn)染組miR-218-5p mimic+oe-GTSE1中,癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力恢復(fù)至mimic NC+oe-NC組水平相當(dāng)。因此,認(rèn)為miR-218-5p能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲,而GTSE1過表達(dá)處理可以恢復(fù)部分抑制作用。

A:肺腺癌數(shù)據(jù)集中正常樣本組和腫瘤樣本組的差異miRNA火山圖,紅點(diǎn)代表上調(diào)基因,綠點(diǎn)代表下調(diào)基因;B:GTSE1預(yù)測的上游miRNA和差異下調(diào)miRNA的維恩圖;C: GTSE1和差異miRNA的Pearson相關(guān)性分析;D: miR-218-5p在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況,藍(lán)色箱圖表示正常樣本,紅色箱圖表示腫瘤樣本;E:stage Ⅰ+Ⅱ組和stage Ⅲ+Ⅳ組肺腺癌患者的miR-218-5p的表達(dá)情況,藍(lán)色小提琴圖表示stage Ⅰ+Ⅱ組患者,橙色小提琴圖表示stage Ⅲ+Ⅳ組患者;F:miR-218-5p表達(dá)量對肺腺癌患者生存期的影響,紅色為高表達(dá)組,藍(lán)色為低表達(dá)組;G: qRT-PCR檢測miR-218-5p在肺腺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平;H: 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證GTSE1能否靶向結(jié)合miR-218-5p;I:qRT-PCR檢測過表達(dá)/敲低miR-218-5p對GTSE1的mRNA表達(dá)的影響;J: Western blot檢測過表達(dá)/敲低miR-218-5p對GTSE1蛋白表達(dá)水平的影響。圖4 miR-218-5p能夠靶向下調(diào)GTSE1的表達(dá)

A:通過qRT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后PC-9和A549細(xì)胞系中GTSE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平;B:CCK8檢測肺腺癌細(xì)胞系PC-9和A549中各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力;C:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測肺腺癌細(xì)胞系PC-9和A549中各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞克隆形成能力;D、E:Transwell用來評估肺腺癌細(xì)胞系PC-9和A549中各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移與侵襲能力(×100);與mimic NC+oe-NC組比較,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;與mimic NC+oe-GTSE1組比較,#:P<0.05;##:P<0.01;###:P<0.001。圖5 miR-218-5p通過下調(diào)GTSE1抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

3 討論

研究顯示,GTSE1在多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［4],但是GTSE1在肺腺癌進(jìn)程中的研究鮮有報(bào)道。本研究通過從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載肺腺癌的mRNA的表達(dá)量數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù),通過差異分析和生存分析確定靶基因GTSE1為研究對象。通過qRT-PCR和Western blot證實(shí)GTSE1在肺腺癌細(xì)胞系中高表達(dá),這與其他研究人員在肝癌［10]、乳腺癌［5]、膀胱癌［11]等腫瘤中的研究結(jié)果一致。通過檢測GTSE1對肺腺癌細(xì)胞功能變化的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GTSE1后,肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力得到了顯著增強(qiáng)。因此,我們認(rèn)為GTSE1在肺腺癌的惡性進(jìn)程中可能作為一個促癌因子發(fā)揮重要作用。

接著,為了進(jìn)一步探究GTSE1在肺腺癌中的分子調(diào)控機(jī)制,我們對其上游調(diào)控基因進(jìn)行挖掘。通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測GTSE1的上游調(diào)控基因,發(fā)現(xiàn)miR-218-5p在肺腺癌組織中低表達(dá),與GTSE1相關(guān)性最高,并通過生信靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)加以驗(yàn)證兩者的結(jié)合關(guān)系。miR-218-5p在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá),并影響癌癥的進(jìn)程［12-15]。例如,Yang等［13]的研究表明,miR-218-5p通過靶向SHMT1抑制NK細(xì)胞對LA細(xì)胞的殺傷作用,并通過改善NK細(xì)胞的功能為LA治療提供了潛在的靶點(diǎn)。Yang等［14]通過實(shí)驗(yàn)得到miR-218的過表達(dá)在體外可降低細(xì)胞增殖、侵襲,集落形成和腫瘤球形成,并且miR-218宿主基因的水平和IL-6/STAT3途徑的成分均與肺癌患者的預(yù)后相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們的研究結(jié)果證明了miR-218-5p在肺腺癌細(xì)胞和組織中下調(diào)表達(dá),并且過表達(dá)miR-218-5p能夠抑制肺腺癌的惡性進(jìn)展,但這種抑制作用能夠被GTSE1過表達(dá)處理所恢復(fù)。這進(jìn)一步揭示了miR-218-5p在肺腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中很可能作為一個抑癌因子。

綜上所述,本研究證實(shí)了GTSE1在肺腺癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào),且GTSE1的表達(dá)與患者預(yù)后具有相關(guān)性,并發(fā)現(xiàn)了miR-218-5p是GTSE1 的上游調(diào)控基因,低表達(dá)的miR-218-5p參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程?；诒狙芯坑兄诹私鈓iR-218-5p/GTSE1調(diào)控軸在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中的生物學(xué)功能,對miR-218-5p/GTSE1檢測在肺腺癌患者的早期診斷及預(yù)后判斷中具有一定的參考價(jià)值,有望為肺腺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。