Tim-3/galectin-9調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞中Th1/Th2細(xì)胞平衡

孫曉麗，張進(jìn)進(jìn)，宋鳳英，黃永莉，陳立力，邢顏超*

1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院 輸血科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)裕民縣人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，新疆 裕民 834700

膿毒癥通常是由多種微生物的感染導(dǎo)致免疫功能失衡和免疫系統(tǒng)的紊亂,最終導(dǎo)致炎性因子和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的表達(dá),從而影響機(jī)體的正常功能[1]。其中T細(xì)胞在人體中發(fā)揮重要作用。眾所周知,T細(xì)胞主要分為輔助性T細(xì)胞(T helper cell, Th)1型細(xì)胞群和2型細(xì)胞群。Th1型細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子[2]。在膿毒癥患者中存在著細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答失衡和Th1/Th2細(xì)胞群的紊亂[3]。雖然膿毒癥患者存在Th1/Th2失衡,但是由何種分子介導(dǎo)的Th1/Th2失衡,目前尚不得知。

T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 3, Tim-3)是Tim家族激活誘導(dǎo)的抑制性受體,主要表達(dá)在分化成熟的Th1細(xì)胞[4]。Tim-3主要分為膜型Tim-3(membrane Tim-3)和可溶性Tim-3(soluble Tim-3)分子。半乳糖凝集素-9(galectin-9)作為Tim-3的配體,與Tim-3特異性結(jié)合后,誘導(dǎo)細(xì)胞的活化、凋亡等[5-6]。研究表明,Tim-3和galectin-9結(jié)合后會引起Th1型細(xì)胞功能喪失,Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)下降,調(diào)節(jié)Th1型免疫反應(yīng)和免疫耐受[5]。

JAK是一組細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶,在膜受體啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[7]。JAK2/STAT3信號通路控制著對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的多種細(xì)胞過程。該軸的改變在癌以及炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用[8-9]。因此,本研究主要通過RT-qPCR、ELISA、Western blot以及體外實(shí)驗(yàn)等對患者外周血的Tim-3、galectin-9、Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子、JAK2/STAT3信號通路的檢測與分析,為膿毒癥患者靶向藥物的研制以及治療提供有限的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料:選取2018年9月至2021年9月新疆軍區(qū)總醫(yī)院就診的102例膿毒癥患者,排除血培養(yǎng)為陰性的膿毒癥患者、合并惡性腫瘤患者、合并糖尿病等嚴(yán)重代謝性疾病的患者、合并自身免疫性疾病與應(yīng)用免疫抑制劑的患者、合并過敏性疾病患者、合并器官移植者等。此外, 對照組來自102名健康體檢者。本研究所有受試者均知情同意,并通過新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(2023RR0204)。抽取患者及健康對照者空腹靜脈血3 mL,3 000 r/min離心10 min,分離患者血清和單個(gè)核細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑:Trizol(Thermo Fisher公司);PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA 合成試劑盒(TaKaRa公司);Tim-3 mAb(Biolegend公司);JAK2、 p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體(CST公司);sTim-3、galectin-9、IL-4、IFN-γ、IL-6和TNF-α等ELISA試劑盒(R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測Tim-3、galectin-9、T-bet、GATA-3的mRNA水平:1 mL抗凝血中加入1×紅細(xì)胞裂解液,室溫裂解10 min后,12 000 r/min離心10 min后,棄上清;總RNA的提取按照Trizol試劑的說明書進(jìn)行?？俁NA反轉(zhuǎn)錄為第1鏈DNA后,使用SYBR Prime Script RT-PCR 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR,根據(jù)相對濃度計(jì)算法計(jì)算Tim-3、galectin-9、T-bet、GATA-3等基因的表達(dá)。引物序列見表1。

1.2.2 細(xì)胞的分組及處理:分離健康人群中的外周血淋巴細(xì)胞, 用含有10%血清的RPMI-1640重懸淋組巴細(xì)胞后,加入1×107個(gè)淋巴細(xì)胞于6孔板中,一加入LPS(0.1 mg/L)(LPS組),體外構(gòu)建炎性反應(yīng)模型,另一組加入等量的PBS(PBS組)作為對照組;LPS組與PBS組每孔均加入ConA(10 mg/L),37 ℃中孵育24 h進(jìn)行體外模擬實(shí)驗(yàn)后,加入galectin-9(LPS+galectin-9組);在LPS組中預(yù)先加入Tim-3單抗阻斷Tim-3的表達(dá)后,再加入1.0 mg/L的galectin-9(LPS+galectin-9+Tim-3組)37 ℃孵育12 h,單獨(dú)加入galectin-9(galectin-9組)和Tim-3 mAb(Tim-3 mAb組),收集細(xì)胞和細(xì)胞上清后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT檢測:1×106/mL細(xì)胞于96孔中,分別加入不同濃度的LPS,使其終濃度分別達(dá)到10 μg/L、100 μg/L、1 mg/L 和10 mg/L,37 ℃中孵育24 h后,棄上清,加入MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,收集細(xì)胞后,每孔加入100 μL的DMSO,10 min后檢測每孔的吸光度值。

1.2.4 ELISA檢測炎性因子的含量:根據(jù)試劑盒中的說明書檢測血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中sTim-3, galectin-9、IL-4、IFN-γ、IL-6和TNF-α的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中和細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)變化。

1.2.5 Western blot檢測JAK/STAT通路蛋白的表達(dá):提取上述單個(gè)核細(xì)胞總蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)定量后取30 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE,快速濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,封閉后孵育JAK2,p-JAK2,STAT3和p-STAT3抗體過夜,再加入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h,以GAPDH為內(nèi)參,ECL熒光成像系統(tǒng)分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般數(shù)據(jù)

本研究共納入了102例膿毒癥患者,其中男性54例,女性48例;共納入102名健康對照,男性51例,女性51例。其中患者外周血中白細(xì)胞(white blood cells, WBC)、中性粒細(xì)胞(neutrophils, NEU)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、降鈣素原(procalcitonin, PCT)均顯著升高(P<0.05或P<0.01);血紅蛋白、血小板均降低(P<0.01)(表2)。

表2 膿毒癥患者的臨床特點(diǎn)Table 2 Clinical characteristics of patients with sepsis

2.2 膿毒癥患者外周血中Tim-3/galectin-9的水平

膿毒癥患者外周血中Tim-3和galectin-9的mRNA的含量均明顯高于對照組(圖1A,B)。血清中sTim-3和galectin-9的水平也明顯高于對照組(圖1C,D)。

A,B.relative mRNA expression of Tim-3 and galectin-9; C,D.levels of sTim-3 and galectin-9 in serum;*P<0.001 compared with control.圖1 外周血Tim-3、galectin-9 mRNA的表達(dá)以及血清中sTim-3、galectin-9的水平Fig 1 The mRNA expression of Tim-3 and galectin-9 in peripheral blood and levels of sTim-3 and galectin-9 in n=102)

2.3 膿毒癥患者存在Th1/Th2細(xì)胞失衡

膿毒癥患者Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的水平明顯低于對照組(圖2A),Th2型細(xì)胞因子IL-4的水平明顯高于對照組(圖2B),并且Th1細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA表達(dá)低于對照組,Th2型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的mRNA表達(dá)高于對照組(圖2C,D)。

A,B.IFN-γ and IL-4 levels; C,D.relative mRNA expression of T-bet and GATA-3;*P<0.001 compared with control.圖2 Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子以及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Fig 2 The expression of Th1 and Th2 cell related cytokines and transcription n=102)

2.4 Tim-3/galectin-9分子調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡

與PBS組相比,0.1 mg/L的LPS刺激后 IL-6和TNF-α的水平均明顯升高(圖3A,B)。與PBS組相比較,LPS組IFN-γ的水平明顯高于PBS組,而IL-4的水平明顯低于PBS組(圖3),LPS+galectin-9組中IFN-γ的表達(dá)明顯低于LPS組,而IL-4的表達(dá)明顯高于LPS組,當(dāng)加入Tim-3 mAb阻斷galectin-9與Tim-3的結(jié)合,LPS+galectin-9+Tim-3 mAb組中IFN-γ的表達(dá)明顯高于LPS+galectin-9組,而IL-4的水平明顯低于LPS+galectin-9組。galectin-9組和Tim-3 mAb組中,IFN-γ和IL-4的表達(dá)沒有明顯變化。

A,B.the secretion of IL-6 and TNF-α in PBMC with different concentrations LPS; C,D.levels of IFN-γ and IL-4 after using Tim-3 mAb; *P<0.05 compared with PBS group or 0 ng/mL; #P<0.05 compared with LPS group; △P<0.05 compared with LPS+galectin-9 group.圖3 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-4的水平Fig 3 The level of IL-6,TNF-α,IFN-γ and IL-4 in cell culture n=102)

2.5 JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

膿毒癥患者外周血中磷酸化的JAK2和STAT3表達(dá)均高于對照組(圖4A),加入Tim-3單抗后,磷酸化的JAK2和STAT3表達(dá)均下降(圖4B)。

*P<0.05 compared with control group or PBS group; #P<0.05 compared with LPS group; △P<0.05 compared with LPS+galectin-9 group.圖4 JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 4 The expression of JAK2/STAT3 signaling pathway associated n=3)

2.6 Tim-3/galectin-9與Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)因子的相關(guān)性分析

Tim-3與galectin-9、Tim3與IL-4、IL-4與galectin-9具有明顯正相關(guān)性(P<0.05),IFN-γ與galectin-9、Tim-3與IFN-γ具有負(fù)相關(guān)性(P<0.01)(圖5)。

圖5 Tim-3/galectin-9與Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)因子的相關(guān)性分析Fig 5 Correlation analysis of Tim-3/galectin-9 with Th1 and Th2 cell associated factors

3 討論

膿毒癥的主要病理生理過程是機(jī)體的促炎性反應(yīng)和抗炎性反應(yīng)的失衡,一旦平衡被破壞,疾病往往會加重。T細(xì)胞作為細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要成分,參與了多種疾病的病理生理過程,尤其是Th1、Th2型細(xì)胞。本研究收集了膿毒癥患者外周血及血清,分析了血清中IFN-γ和IL-4以及外周血中Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者體內(nèi)存在Th1/Th2細(xì)胞失衡。但是引起這種失衡的機(jī)制目前尚不清楚。

T細(xì)胞的活化依賴于共刺激分子。T細(xì)胞在接受刺激信號后,發(fā)揮相應(yīng)的免疫應(yīng)答或免疫抑制作用。Tim-3作為負(fù)性共刺激分子,特異性表達(dá)于Th1細(xì)胞上,負(fù)責(zé)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[10]。而galectin-9廣泛存在于多種細(xì)胞中,屬于可溶性糖蛋白之一,主要黏附于細(xì)胞膜上,在免疫細(xì)胞的動態(tài)平衡、炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用[11]。Tim-3與其配體galectin-9結(jié)合,傳遞負(fù)性刺激信號,確保在過度免疫應(yīng)答的情況下誘導(dǎo)免疫耐受,實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答的平衡[12]。 高水平的Tim-3表達(dá)與T細(xì)胞反應(yīng)的抑制和T細(xì)胞功能障礙相關(guān),并且Tim-3被認(rèn)為是控制T細(xì)胞對各種慢性病毒感染如HBV、HCV等的免疫檢查點(diǎn)的受體[21]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者Tim-3和galectin-9的mRNA表達(dá)明顯升高,血清中sTim-3和galectin-9的水平均明顯升高,說明了Tim-3/galectin-9信號參與了膿毒癥的疾病進(jìn)程,并且Tim-3的升高可能導(dǎo)致了T淋巴細(xì)胞的功能障礙。作為Tim-3的配體,galcetin-9可能與Tim-3結(jié)合來調(diào)控這一過程。

眾所周知,CD4+T細(xì)胞主要分為Th1和Th2細(xì)胞,Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子,Th2細(xì)胞主要分泌IL-4等細(xì)胞因子。Tim-3與galectin-9結(jié)合后,可抑制或下調(diào) Th1 細(xì)胞的活化和相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生,促進(jìn)免疫抑制[13]。本研究的結(jié)果與此相一致,表明Tim-3與 galectin-9結(jié)合,抑制了Th1細(xì)胞的活化,減少IFN-γ的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)膿毒癥炎性過程中淋巴細(xì)胞Th1/Th2的平衡。

一些細(xì)胞因子如IL-4、IL-6、IL-31等都可以激活JAK2/STAT3通路[14]。因此通過對膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路相關(guān)因子的分析,發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者外周血中磷酸化的JAK2和STAT3表達(dá)均升高,加入Tim-3單抗阻斷galectin-9的結(jié)合后,磷酸化的JAK2和STAT3表達(dá)均下降。這表明galectin-9結(jié)合Tim3通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮作用。

總之,Tim-3作為一種負(fù)性共刺激分子在維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)的平衡中發(fā)揮著重要作用。