整合素α5β1在Hartley豚鼠自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變中的作用研究*

李 遠(yuǎn),李 忠,劉俊才△

(1.遂寧市中心醫(yī)院骨科中心三病區(qū)-關(guān)節(jié)外科,四川 遂寧 629000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科/四川省骨科置入器械研發(fā)應(yīng)用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,四川 瀘州 646000)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是骨科臨床最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病,會導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛并增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于OA的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,臨床僅能以延緩進(jìn)展、緩解癥狀及晚期矯正畸形、改善功能為治療目的。因此,原發(fā)性O(shè)A的防治一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題[1]。 近期研究發(fā)現(xiàn),阻斷整合素α5β1表達(dá)時,有利于抑制大鼠視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)及血管增生,改善視網(wǎng)膜剝脫[2]。α5β1在軟骨細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用最為突出[3]。KHALILI等[3]研究發(fā)現(xiàn),ATN-161是整合素α5β1的拮抗劑,整合素α5β1來源于人纖連蛋白的協(xié)同域(PHSRN),其中半胱氨酸殘基取代了原序列(PHSCN)中的精氨酸。一些研究表明,在幾種腫瘤模型中,無論是作為單一藥物還是與放化療聯(lián)合使用,ATN-161都能抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和延長患者生存期[3-5]。雖然整合素α5β1在OA 及關(guān)節(jié)軟骨中的研究有不少報(bào)道,但其特異性拮抗劑ATN-161在膝OA及軟骨退變中的研究在國內(nèi)外還鮮見報(bào)道。據(jù)此,本研究擬觀察不同月齡豚鼠原發(fā)性 OA模型中疾病進(jìn)展的相關(guān)病理改變,進(jìn)一步研究 ATN-16 對 OA 的治療效果及機(jī)制,從而為臨床運(yùn)用 ATN-161 治療 OA 提供可靠的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物分組 選取3周齡的SPF級Hartely雌性豚鼠24只,進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)并記錄初始體重并對其進(jìn)行編號,然后采用隨機(jī)分配法將24只豚鼠隨機(jī)分為基線組、對照組、ATN-161治療組、生理鹽水治療組,每組6只。其中基線組的豚鼠在實(shí)驗(yàn)開始時處死,對照組的豚鼠正常飼養(yǎng)3個月齡時處死,ATN-161的豚鼠在正常飼養(yǎng)3個月后開始予以ATN-161腹腔注射1 mg/(kg·3 d)直至3個月后處死,生理鹽水治療組的豚鼠在正常飼養(yǎng)3個月后開始予以生理鹽水腹腔注射1 mg/(kg·3 d)直至3個月后處死。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集和處理 膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本的選取及組織蠟塊制作:動物在預(yù)定處死時間用頸椎脫臼法處死。動物處死后馬上在無菌條件下解剖暴露雙后肢膝關(guān)節(jié),肉眼大體觀察關(guān)節(jié)面的色澤、光滑度、滑液性狀及有無關(guān)節(jié)面破損并留取影像資料。依據(jù)Outerbridge標(biāo)準(zhǔn),以稅利手術(shù)刀片在股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)負(fù)重面同一區(qū)域切取軟骨標(biāo)本各6例,大小約1 cm×0.5 cm×0.5 cm,將軟骨標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液內(nèi)固定48 h,流水沖洗2～3 h,混合酸脫鈣液脫鈣24～48 h,直至大頭針能輕松穿透標(biāo)本,再流水沖洗2～3 h,10%中性甲醛溶液內(nèi)固定24 h后,常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋,制成組織塊備用。軟骨標(biāo)本蘇木精-伊紅(HE)及特殊染色,顯微組織學(xué)觀察,Mankin評分及造模成功以及自發(fā)性骨關(guān)節(jié)為進(jìn)行性判定:軟骨組織塊3～5 μm厚度全層垂直切片,HE染色制片、番紅-固綠與阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫(AB-PAS)特殊染色制片及顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察,觀察軟骨表面是否規(guī)則、有無裂隙,細(xì)胞數(shù)量、分布、排列是否規(guī)則,特染著色部位、分布、均勻度及深淺。根據(jù)Mankin評分將軟骨損傷(OA)組織病理學(xué)改變分為4期。正常軟骨 0分;輕度OA 1～<6分;中度OA 6～<10分;重度OA 10～<15分。

1.2.2干預(yù)后Hartely豚鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的檢測指標(biāo)及方法

1.2.2.1檢測指標(biāo) 大體形態(tài)學(xué)觀察、HE組織學(xué)觀察、氧化應(yīng)急指標(biāo)觀察[基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13]、力學(xué)傳導(dǎo)(整合素α5β1)、細(xì)胞凋亡(Bax、bcl-2)。檢測方法:大體形態(tài)學(xué)觀察:股骨內(nèi)髁負(fù)重關(guān)節(jié)面的大體形態(tài)學(xué)改變,包括關(guān)節(jié)軟骨的光滑度、色澤、表面是否有糜爛及潰瘍、是否有纖維增生及邊緣是否有骨贅形成。HE組織學(xué)觀察參照Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)。血炎癥、力學(xué)傳導(dǎo)、血管生成、細(xì)胞凋亡指標(biāo)觀察參照Chemicon公司購買相應(yīng)檢測檢測試劑盒檢測結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)。為了提高檢測準(zhǔn)確性,整合素α5β1、Bax、bcl-2的檢測采用免疫組化方法。

1.2.2.2免疫組織化學(xué)檢測 采用免疫組化(SP)法染色,其中抗人整合素α5β1抗體1∶100稀釋,二甲聯(lián)苯胺(DAB)室溫下顯微鏡下調(diào)控顯色。SP法結(jié)果判定參照J(rèn)acobs評定方法,由3名病理專業(yè)高級職稱醫(yī)師獨(dú)立讀片,其評定誤差控制在5%以內(nèi),取三者平均值作為最后判定結(jié)果;選取5～10個高倍視野(400×),計(jì)數(shù)每個視野中細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)及著色程度,顯微鏡下胞漿或包膜有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞;用陽性細(xì)胞積分作為整合素α5β1的表達(dá)量。依照陽性細(xì)胞所占比例分為:0～<25%記為弱陽性(+),25%～<50%記為中等陽性(++),50%～100%記為強(qiáng)陽性(+++)。依照細(xì)胞陽性著色程度(抗原含量)分為:弱陽性(+)記為1分,中等陽性(++)記為2分,強(qiáng)陽性(++)記為3分。積分綜合計(jì)量,積分=弱陽性(+)%×1 +中等陽性(++)%×2+強(qiáng)陽性(+++)%×3,積分<1.0者為(+),1.0～1.5者為中等陽性(++),>1.5者為強(qiáng)陽性(+++)。

2 結(jié) 果

HE染色組織學(xué)和 Mankin 評分結(jié)果顯示,對照組豚鼠在3月齡時即發(fā)生了OA樣改變,并且隨著月齡的增長退變逐漸加重,確定造模成功。見表1。組織學(xué)和 Mankin 評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2、表2),對照組豚鼠在3個月時即發(fā)生了OA樣改變,并且隨著年齡的增長退變逐漸加重,通過 ATN-161治療后,ATN-161治療組豚鼠在6月齡時Mankin評分分值明顯減少(P<0.05)。SP法結(jié)果證實(shí),α5β1 的表達(dá)(圖2)在基線組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),之后隨著月齡的增加。生理鹽水組中整合素α5β1 的表達(dá)高于對照組(P<0.05):與生理鹽水組比較,ATN-161組治療后能明顯降低整合素α5β1的表達(dá)(P<0.05);隨著豚鼠年齡的增加,MMP-3 在軟骨中的表達(dá)增多(圖3),對照組明顯高于 BL組,生理鹽水組又顯著高于對照組(P<0.05);細(xì)胞凋亡指標(biāo)(Bax、bcl-2)(圖4、5)免疫組織化學(xué)指標(biāo)均顯示:基線組、對照組、ATN-161治療組三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中Bax在對照組表達(dá)量最低,基線組中最高,ATN-161治療組表達(dá)量明顯高于對照組(NS組)(P<0.05);此外,bcl-2在對照組表達(dá)量最高,基線組中最低,ATN-161治療組表達(dá)量明顯低于生理鹽水治療組(P<0.05)。見表3、4。

注:A.基線組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、完整;B.對照組可見關(guān)節(jié)面稍微粗糙,軟骨表面可見輕微的纖維化樣改變;C.生理鹽水治療組關(guān)節(jié)面粗糙,不平整,軟骨表面出現(xiàn)纖維化改變,切片中細(xì)胞排列紊亂,大小不均;D.ATN-161治療組部分區(qū)域關(guān)節(jié)面較為平整,表層及移行層內(nèi)軟骨細(xì)胞增多,胞體腫大。

注:A.基線組α5β1 表達(dá)較強(qiáng),陽性細(xì)胞數(shù)量多,著色區(qū)域廣、著色深;B.對照組α5β1 著色區(qū)域、顏色較 BL 組都有所減少;C.生理鹽水治療組α5β1 著色區(qū)域少顏色很淺;D.ATN-161治療組α5β1 表達(dá)廣泛,著色深。

注:A.基線組MMP-3 則基本無表達(dá),著色區(qū)域小;B.對照組MMP-3 著色區(qū)域、顏色較 BL 組都有所增加;C.生理鹽水治療組MMP-3 表達(dá)廣泛,顏色深;D.ATN-161治療組MMP-3 在軟骨淺層區(qū)域有表達(dá),范圍小,顏色淺。

注:A.基線組;B.對照組;C.生理鹽水治療組;D.ATN-161治療組。

注:A.基線組;B.對照組;C.生理鹽水治療組;D.ATN-161治療組。

表1 豚鼠體重體重變化情況

表2 Mankin評分結(jié)果分,n=8)

表3 定量分析α5β1和MMP-13指標(biāo)的免疫組化結(jié)果

表4 定量分析BXA和Bcl-2的免疫組化結(jié)果

3 討 論

OA的特征是關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性喪失,軟骨下骨硬化和滑膜炎癥,是當(dāng)今最常見的慢性疾病之一。 因此OA動物模型的制作對于研究疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。Dunkin-Hartley(DH)豚鼠自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎模型在國內(nèi)外文獻(xiàn)中廣泛報(bào)道[6-8]。Hartely豚鼠自發(fā)性 OA 模型的優(yōu)點(diǎn)在于:(1)Hartely豚鼠的OA隨月齡的增加而逐漸加重,這在很大程度上避免了由手術(shù)方式、藥物誘導(dǎo)造OA模型對實(shí)驗(yàn)本身的影響;(2)Hartely豚鼠OA的膝關(guān)節(jié)軟骨在形態(tài)學(xué)、影像學(xué)、生物化學(xué)等方面均與人類OA病理相似,這將更有利于人類OA的研究。本實(shí)驗(yàn)采用Hartely豚鼠作為動物模型,有效模擬了人類OA的發(fā)生發(fā)展過程,為研究ATN-161對 OA的軟骨和軟骨下骨的作用提供有效保障。本研究結(jié)果顯示,隨著豚鼠月齡的增長,體重逐漸增加,這與既往關(guān)于DH豚鼠制作骨關(guān)節(jié)炎模型的研究結(jié)論相吻合[9-10],因此說明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了 OA動物模型。ATN-161是整合素α5β1的拮抗劑,能抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和延長生存期[3-5]。既往研究表明,ATN-161在抑制腫瘤血管生成和其他類型腫瘤轉(zhuǎn)移中有重要作用,但在其特異性拮抗劑ATN-161在膝OA及軟骨退變中的研究在國內(nèi)外還鮮見報(bào)道。

WANG 等[11]研究結(jié)果表明,軟骨細(xì)胞自噬的功能可能至少部分涉及糖原的分解代謝。 因此,在患有OA的豚鼠中,脛骨平臺軟骨細(xì)胞自噬水平降低,軟骨細(xì)胞無法將細(xì)胞內(nèi)糖原降解為葡萄糖,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞能量減少,細(xì)胞凋亡增加。大量研究表明,Notch信號通路在調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、分化,維持軟骨表型及軟骨基質(zhì)代謝方面有重要作用。MOQBEL 等[12]研究發(fā)現(xiàn)線粒體融合促進(jìn)軟骨祖細(xì)胞(CPSCs)的軟骨形成分化。mitofusin 2(Mfn2) 通過 Notch2 加速 CPSCs 的軟骨形成分化。 在體內(nèi),rCPSCs 片中的 Mfn2-OE 改善了大鼠模型中的 OA。ZAMLI等[13]研究認(rèn)為,在Hartely豚鼠自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎模型中,骨關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展同軟骨細(xì)胞凋亡的增加有關(guān)。吳紹軍等[14]研究發(fā)現(xiàn),Notch信號通路的激活與抑制可以通過凋亡途徑改變Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況從而影響大鼠OA的進(jìn)展。本研究中發(fā)現(xiàn),ATN-161組豚鼠關(guān)節(jié)軟骨免疫組化結(jié)果也出現(xiàn)了凋亡指標(biāo)BXA的下調(diào)和Bcl-2上調(diào)的變化,充分表明該阻斷劑能在一定程度上減緩骨關(guān)節(jié)軟骨退變速度,可抑制Notch信號通路發(fā)揮作用。有研究將Notch 信號傳導(dǎo)的下游效應(yīng)物確定為疾病改善骨關(guān)節(jié)炎藥物的潛在靶標(biāo)[15]。本研究表明,ATN-161能對整合素α5β1起到直接的抑制作用,減少M(fèi)MP-13的表達(dá),減輕軟骨的降解,下調(diào) Bax 蛋白,上調(diào) Bcl-2 蛋白,從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨,減緩關(guān)節(jié)軟骨的退變速度。ATN-161 可能是一種骨關(guān)節(jié)炎治療候選藥物。

AMRUTA等[16]通過ATN-161 處理(10 μmol/L) 通過減少整合素α5、MMP-9和纖連蛋白的表達(dá),以及通過減少線粒體超氧化物自由基、細(xì)胞內(nèi)ROS、炎癥來減少氧化應(yīng)激,有效抑制OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積通過減少NLRP3炎性體,通過降低claudin-5和ZO-1表達(dá)水平導(dǎo)致緊密連接丟失,通過抑制線粒體去極化導(dǎo)致線粒體損傷,通過調(diào)節(jié)磷酸化黏著斑激酶(p-FAK)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)水平導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。SUN等[17]研究表明,咖啡酸苯乙酯(CAPE)增加聚集蛋白聚糖和膠原蛋白Ⅱ的表達(dá),以及降低MMP-3、MMP-13和具有整合素α5β1和金屬蛋白酶的表達(dá)來減弱細(xì)胞外基質(zhì)的降解?？赡苁穷A(yù)防或治療OA的潛在治療劑。總之,本研究結(jié)果進(jìn)一步支持用ATN-161治療性靶向抑制整合素α5β1改善豚鼠關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài),降低氧化應(yīng)急性損傷,抑制軟骨基質(zhì)中金屬蛋白酶MMP-13的表達(dá),進(jìn)而對骨關(guān)節(jié)炎起到一定治療作用。

整合素是廣泛存在于人體免疫細(xì)胞中的跨膜受體,參與慢性炎癥、血栓形成、惡性腫瘤形成等病理過程。它們主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附,協(xié)調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)成分的攝取,調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的形成,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)[18-19]。TAO 等[20]從小鼠的膝蓋軟骨分離細(xì)胞,并在各種濃度的纖連蛋白(FN)存在下進(jìn)行培養(yǎng)并在體外進(jìn)行增殖,遷移和軟骨形成分化測定發(fā)現(xiàn),FN通過整合素α5β1依賴性信號通路增強(qiáng)軟骨形成祖細(xì)胞(CPC)增殖,遷移和軟骨形成分化?；谶@些結(jié)果,可以開發(fā)出一種針對FN靶向激活軟骨形成祖細(xì)胞(CPC)的新穎而有前途的療法,以在臨床環(huán)境中治療軟骨損傷。ATN-161作為整合素α5β1的特異性阻斷劑。本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組豚鼠整合素α5β1明顯下降,且關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)和組織化學(xué)染色評分均高于對照組,這表明ATN-161可能是一種潛在的治療藥物。本研究著重觀察了 ATN-161對 DH 豚鼠自發(fā)性 OA 軟骨改變和保護(hù)作用,其具體的作用機(jī)制還需要今后進(jìn)一步研究;此外,鈣化軟骨是軟骨的一部分,也是軟骨和軟骨下骨重要的連接組織,在OA 中也起著至關(guān)重要的作用,ALN 對軟骨都具有保護(hù)作用,然而ALN 對鈣化軟骨的作用和機(jī)制,也是以后的研究需要補(bǔ)充完善的內(nèi)容。