RDH5對(duì)肺腺癌惡性生物學(xué)行為及預(yù)后的影響*

劉海君,張洪巖,湯 雋,任開明,趙俊剛

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胸外科,沈陽 110004)

2020年癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,肺癌是全球第二大高發(fā)惡性腫瘤,約有220萬新發(fā)病例,約有180萬病例死于肺癌[1]。根據(jù)細(xì)胞學(xué)類型,肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌,其中肺腺癌是NSCLC的最常見病理亞型[2]。早期肺腺癌患者缺乏特異性臨床表現(xiàn),易錯(cuò)過最佳診斷時(shí)間,中晚期患者常發(fā)生局部浸潤甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療效果不佳,5年總生存(overall survival,OS)率長期低于20%[3]。目前,靶向治療和免疫治療是肺腺癌治療的主要手段,在部分患者中取得了良好的臨床效果[4-5],但由于腫瘤異質(zhì)性,臨床上受益人群仍有限[6]。

視網(wǎng)膜脫氫酶5(retinol dehydrogenase 5,RDH5)屬于RDH家族,通過催化維生素A氧化為視黃醛成為視覺循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶[7-8]。近年來有報(bào)道指出RDH5在多種癌癥中存在異常表達(dá):在結(jié)直腸癌中RDH5的表達(dá)水平降低,通過影響細(xì)胞生長和分化來促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]。胃癌患者的外顯子組測(cè)序表明RDH5的突變可能與早期癌變有關(guān)[10-11]。RDH5在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),其低表達(dá)與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[12]。但在雌激素受體陰性乳腺癌中,RDH5的表達(dá)升高被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和耐藥的原因之一[13]。目前RDH5在肺癌中的表達(dá)情況,功能和作用機(jī)制仍不清楚。所以探究RDH5在肺癌中的相關(guān)信息對(duì)于預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后情況,開展針對(duì)肺癌的特異性治療及提高治愈率有著重要的理論和臨床意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1437和支氣管上皮細(xì)胞系16HBE購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。所有細(xì)胞系均在含10%胎牛血清(美國Hyclone公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.1.2組織標(biāo)本

選取2012年1月至2014年12月于本院行根治性切除的139例肺腺癌患者為研究對(duì)象。所有患者均未接受術(shù)前放化療,無重大疾病史及其他腫瘤病史。病理診斷符合美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版標(biāo)準(zhǔn),其中男103例,女36例;AJCC分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期34例,Ⅲ期78例。收集研究對(duì)象腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm以上,避免腫瘤中心明顯鈣化或壞死部分),保存于液氮中,隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。本研究所有研究對(duì)象簽署知情同意書,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)

Trizol法分別提取組織和細(xì)胞中RNA。加入適量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10～15 min)。在260～280 nm處獲得吸光度(A)值評(píng)估濃度。依據(jù)說明書,通過Advantage?RT-for-PCR 試劑盒 (日本Takara公司) 使用2 μg RNA合成cDNA。將cDNA稀釋,使用 HiScript?Ⅱ One Step qRTPCR SYBR?Green Kit(日本Takara公司)進(jìn)行RT-qPCR。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性1 min,63 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min 后降至4 ℃。以β-actin作為內(nèi)參照。

所有PCR實(shí)驗(yàn)均使用LightCycler 480 system Ⅱ(德國羅氏診斷有限公司)完成。RDH5的上游引物是5′- GCT TCT TCC GAA CCC CTG TG -3′,下游引物是5′-CCT GGC TAC TCA CAC TTG GT-3′;β-肌動(dòng)蛋白的上游引物是5′-ATT GGC AAT GAG CGG TT-3′,下游引物是5′-CGT GGA TGC CAC AGG ACT-3′。引物由北京華大基因有限公司合成。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

RDH5表達(dá)被預(yù)先設(shè)計(jì)的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾(#1,s11893;#2,s11894;Cat#4392420,美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用非靶向shRNA作為陰性對(duì)照(#4390843,美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用Lipofectamine RNAiMAX(#13778-150,美國Thermo Fisher Scientific公司)混合siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3Western blot

將培養(yǎng)的細(xì)胞用冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌兩次,并在含有1×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(#78442,美國Thermo Fisher Scientific公司)的RIPA 緩沖液中裂解。裂解液以1 s的間隔超聲1 s,總共1 min,然后在15 000×g和4 ℃下離心15 min。收集上清液作為全細(xì)胞裂解物。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜用5%低脂奶粉封閉,并在4 ℃下用抗 RDH5 的一抗(PA5-19319,美國Thermo Fisher Scientific公司,1∶1 000)、抗β-actin(#4967,美國Cell Signaling Technology公司,1 ∶5 000)、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)3(#9662,美國Cell Signaling Technology公司,1∶1 000)、抗裂解(cleaved)-caspase3(#9664,美國Cell Signaling Technology公司,1∶1 000)在TBST中稀釋用于Western blot。在室溫下與山羊抗兔IgG二抗(#7074,美國Cell Signaling Technology公司,1∶5 000)孵育1 h后通過使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑(美國GE Healthcare公司)曝光顯影蛋白條帶1 min。

1.2.4流式細(xì)胞分析

在含有1% BSA的PBS中將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。細(xì)胞懸液與抗體室溫孵育30 min,用含1% BSA的PBS洗滌和離心2次,將細(xì)胞沉淀懸浮于PBS中。流式細(xì)胞術(shù)使用 FACSVerse (美國BD Biosciences公司)儀器進(jìn)行。使用 FlowJo 3.3軟件分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。

1.2.5細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

使用CCK-8試劑盒,并依據(jù)其使用說明書測(cè)定處理后細(xì)胞活性。接種細(xì)胞24 h后,開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞。之后每隔24 h使用CCK-8 10 μL、避光孵育1 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定A值。

1.2.6細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

收集含有漂浮凋亡細(xì)胞的上清液,將貼壁細(xì)胞沉淀并與漂浮細(xì)胞結(jié)合。 收集的細(xì)胞用PBS洗滌兩次,每個(gè)沉淀以1×107個(gè)/mL 重懸于膜聯(lián)蛋白(Annexin)V結(jié)合緩沖液中。細(xì)胞用Annexin V(#640918,美國BioLegend公司)和7-AAD(#420403,美國BioLegend公司)染色,并在室溫下避光孵育15分鐘。將Annexin V結(jié)合緩沖液添加到每個(gè)樣品中,并使用 FACSVerse 儀器(美國BD Biosciences公司)分析細(xì)胞。

1.2.7生物信息學(xué)分析

于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)分析RDH5在泛癌和肺腺癌中的表達(dá)差異,log-rank進(jìn)行生存分析,以ggplot2進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RDH5 mRNA在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

TCGA分析結(jié)果顯示,RDH5在肺腺癌組織表達(dá)水平高于癌旁正常組織,且RDH5高表達(dá)患者的OS率低于低表達(dá)患者(P<0.05),見圖1。

A:RDH5 mRNA在肺腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)水平;B:RDH5表達(dá)水平對(duì)肺腺癌患者的生存影響;aP<0.05。圖1 RDH5在肺腺癌組織中的表達(dá)情況及預(yù)后影響

2.2 RDH5在肺癌細(xì)胞系的表達(dá)水平

A549、H1437中RDH5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較16HBE升高,A549、H1437中RDH5蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。siRNA處理后,A549、H1437中RDH5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較處理前降低,RDH5蛋白表達(dá)減少(P<0.05),見圖2。因siRNA#2轉(zhuǎn)染后RDH5 mRNA和蛋白表達(dá)水平較siRNA#1轉(zhuǎn)染后更低,故選取siRNA#2進(jìn)行后續(xù)研究。

A:3種細(xì)胞系中RDH5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較;B:3種細(xì)胞系中RDH5蛋白表達(dá)情況;C:siRNA轉(zhuǎn)染后,肺腺癌細(xì)胞系中RDH5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較;D:siRNA轉(zhuǎn)染后,肺腺癌細(xì)胞系中RDH5蛋白表達(dá)情況;a:P<0.05,與A549比較;b:P<0.05,與H1437比較。圖2 RDH5在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.3 干擾RDH5的表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞的影響

siRNA轉(zhuǎn)染96 h后,A549、H1437中細(xì)胞增殖率較對(duì)照明顯降低(P<0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞群落數(shù)明顯減少,見圖3。隨著siRNA轉(zhuǎn)染,RDH5表達(dá)減少,細(xì)胞凋亡比例增加,A549、H1437中凋亡細(xì)胞分別從9.3%、10.0%增加至32.1%、45.6%。siRNA轉(zhuǎn)染后,A549、H1437的caspase3表達(dá)減弱,cleaved-caspase3表達(dá)增強(qiáng),見圖4。

A:A549細(xì)胞增殖率變化情況;B:H1437細(xì)胞增殖率變化情況;C:A549克隆形成實(shí)驗(yàn);D:H1437克隆形成實(shí)驗(yàn);a:P<0.05。圖3 CCK-8和克隆形成評(píng)估RDH5對(duì)細(xì)胞增殖的影響

A:A549的Annexin V/7AAD染色分析;B:H1437的Annexin V/7AAD染色分析;C:肺腺癌細(xì)胞系中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。圖4 抑制RDH5表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡

2.4 RDH5表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

肺腺癌組織中RDH5相對(duì)表達(dá)的中位水平為2.24,以此作為截?cái)嘀祵DH5相對(duì)表達(dá)水平≥2.24的患者作為高表達(dá)(n=83),將RDH5相對(duì)表達(dá)水平<2.24的患者作為低表達(dá)(n=56)。結(jié)果顯示,RDH5高表達(dá)與低表達(dá)的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC分期比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 RDH5表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.5 RDH5表達(dá)水平與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

139例肺腺癌患者中,術(shù)后5年內(nèi)死亡95例(死亡率68.34%),中位無病生存(disease-free survival,DFS)時(shí)間為33(15,68)個(gè)月,中位OS時(shí)間為 46(24,69)個(gè)月。RDH5高表達(dá)的DFS、OS時(shí)間較低表達(dá)患者縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5、表2。

表2 RDH5高低表達(dá)的DFS、OS時(shí)間比較[M(Q1,Q3),月]

A:DFS;B:OS。圖5 RDH5高表達(dá)與低表達(dá)肺腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

單因素分析顯示,不同性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC分期的DFS、OS比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素分析結(jié)果納入多因素分析,結(jié)果顯示RDH5高表達(dá)提示患者的不良預(yù)后(P<0.05),見表4。

表3 影響肺腺癌患者DFS、OS的單因素分析[M(Q1,Q3),月]

表4 影響肺腺癌患者DFS、OS的多因素分析

3 討 論

盡管已經(jīng)做出了巨大的努力,但NSCLC患者的預(yù)后仍未得到改善。在過去10年中,分子靶向治療的發(fā)展對(duì)肺腺癌的治療方法產(chǎn)生了巨大影響,小分子酪氨酸激酶抑制劑的使用進(jìn)一步延長了表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS proto-oncogene 1,receptor tyrosine kinase,ROS1)和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶(neurotrophin receptor kinase,NTRK)突變患者的生存期[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn),肺腺癌高表達(dá)RDH5,與疾病預(yù)后、細(xì)胞生長和凋亡等方面密切相關(guān),是肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子。RDH5的發(fā)現(xiàn)是由于其在視網(wǎng)膜色素上皮循環(huán)中的重要作用,它是將11-順-維生素A轉(zhuǎn)化為11-順-視黃醛的關(guān)鍵酶,該基因的突變可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性引起眼病[16]。盡管很少有組織學(xué)研究報(bào)道RDH5表達(dá)與癌癥之間的關(guān)系,但近年研究顯示,RDH5在結(jié)直腸癌、肝癌和胃癌中表達(dá)異常,且導(dǎo)致預(yù)后不良[9-12]。也有報(bào)道指出,RDH5在雌激素受體陰性乳腺癌中高表達(dá),導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展及耐藥[13]。RDH5在早期胃癌中發(fā)生突變,是早癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素[11],但RDH5在肝細(xì)胞癌中的突變率較低[12]。RDH5與腫瘤表觀遺傳學(xué)改變存在相關(guān)性,與非腫瘤組織相比,RDH5在甲狀腺乳頭狀癌中甲基化程度低,這表明DNA甲基化能夠調(diào)節(jié)RDH5的表達(dá)。相似的結(jié)論在肝細(xì)胞癌中也有報(bào)道,即肝癌中存在明顯的RDH5 DNA甲基化修飾異常[12]。目前,RDH5在腫瘤中的生物學(xué)功能暫不能統(tǒng)一,但根據(jù)已知的研究報(bào)道,RDH5有其雙刃劍的作用,在不同的癌癥中的不同表達(dá)會(huì)有不同的功能。因此,明確其上下游的信號(hào)通路對(duì)研究RDH5有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)RDH5在肺腺癌中特異性表達(dá),通過激活caspase3介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。既往研究一度認(rèn)為細(xì)胞凋亡是唯一受調(diào)控的細(xì)胞死亡機(jī)制,但隨著近年來對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制的理解不斷加深,除了細(xì)胞凋亡外,壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡和細(xì)胞自噬都是受調(diào)控的細(xì)胞死亡機(jī)制[17]。而尋找各種抗癌機(jī)制引起細(xì)胞死亡可能會(huì)引領(lǐng)新的靶向治療方案的制訂。其中細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)是細(xì)胞收縮、染色質(zhì)濃縮、核碎裂、質(zhì)膜起泡和鄰近吞噬細(xì)胞清除碎片[18],在本研究中,下調(diào)RDH5后肺腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出活性減低并抑制增殖。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)下調(diào)RDH5的表達(dá)可以誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡,且證明RDH5在肺腺癌細(xì)胞系中會(huì)關(guān)聯(lián)caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程,導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞死亡。caspase3是刺激癌癥細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子,是一種無活性二聚體,通過某個(gè)亞基的蛋白水解切割啟動(dòng)激活,不同的蛋白酶切割caspase3酶原以激活caspase3。cleaved-caspase3是caspase3的激活形式,是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要裂解酶[19]。cleaved-caspase3進(jìn)一步切割不同的底物,導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)放大,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,切割的底物導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變,從而導(dǎo)致與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞變化。因此,caspase3激活意味著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本研究證實(shí)RDH5可以調(diào)節(jié)caspase3的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞凋亡過程,雖然不能明確更具體的機(jī)制,但根據(jù)既往的報(bào)道,RDH5可以調(diào)控HIPPO通路[12],而HIPPO通路與細(xì)胞死亡有密切關(guān)聯(lián)[21],可以推測(cè)RDH5可能通過HIPPO通路調(diào)控細(xì)胞凋亡過程,但仍需要更多的證據(jù)。此外,caspase3除了介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還可以通過裂解焦孔素(gasdermin,GSDME)來誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[22]。且有報(bào)道表明,細(xì)胞凋亡后會(huì)繼發(fā)性引起細(xì)胞焦亡,所以RDH5有介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的可能性,不過這仍需更多的證據(jù)表明,包括細(xì)胞形態(tài)和信號(hào)通路的驗(yàn)證。

綜上所述,RDH5主要在肺腺癌組織中表達(dá),其可通過抑制caspase3的激活來逃避細(xì)胞凋亡,從而增強(qiáng)細(xì)胞生存能力和耐藥性。因此,RDH5可能是肺腺癌患者預(yù)后的新治療靶點(diǎn)。