小麥新品系的赤霉病抗性及分子標(biāo)記分析

王紫檀,李浩陽,趙文莎,宋鵬博,孫道杰,馮 毅,張玲麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由禾谷鐮孢菌(FusariumgraminearumSchw.)等引起的一種真菌病害。禾谷鐮孢菌在小麥開花期侵染穗部小花,在籽粒灌漿成熟過程中沿穗軸擴展,產(chǎn)生并積累脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(deoxynivalenol, DON)等毒素,致使籽粒干癟,嚴(yán)重時整穗死亡,對小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)造成負(fù)面影響;被毒素污染的籽粒還嚴(yán)重威脅人畜健康[1-4]。小麥赤霉病的高發(fā)區(qū)過去主要集中在長江中下游冬麥區(qū)和東北春麥區(qū),近年來伴隨氣候變化和耕作方式的改變,發(fā)病區(qū)域逐步延伸至黃淮麥區(qū)[5]。生產(chǎn)上,防治赤霉病主要采用化學(xué)防治和種植抗病品種的方法,化學(xué)防治會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,因此種植抗病品種是防治小麥赤霉病最經(jīng)濟有效的措施[3]。在生產(chǎn)上,能直接利用的抗赤霉病小麥品種較少,選育抗赤霉病品種是當(dāng)前黃淮麥區(qū)小麥育種的重要任務(wù)之一[6]。

小麥赤霉病抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀,目前正式命名的抗病基因有Fhb1～Fhb7,只有Fhb1[7]和Fhb7[8]被克隆,其中Fhb1被證實是效應(yīng)最強且最穩(wěn)定的抗病基因,在不同遺傳背景下均可大幅減輕赤霉病病害[9]。Fhb1最早在我國地方小麥品種蘇麥3號及其衍生品系寧7840中被發(fā)掘,已被國內(nèi)外廣泛用于小麥抗赤霉病育種[10-12]。蘇麥3號是全球普遍公認(rèn)的高抗赤霉病品種[12],已發(fā)現(xiàn)其攜帶有多個抗赤霉病基因/QTLs,其3BS染色體臂上的基因Fhb1既抗赤霉病菌擴展又抗赤霉毒素DON的積累[13],其6BS染色體臂上的基因Fhb2是一個抗擴展的主效基因[14],其5AS染色體臂上的基因Fhb5是一個抗侵染的主效位點[15],其2DL染色體臂上的QFhs.crc-2DL也具有一定的抗病貢獻率[16]。蘇麥3號赤霉病抗性強、穩(wěn)定且持久,但其春性較強,易遭凍害,植株較高且莖稈纖細易倒伏,重感條銹病、葉銹病和白粉病等病害,產(chǎn)量水平較低,籽粒小且呈粉質(zhì),品質(zhì)較差,對黃淮南部冬麥區(qū)的生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性較差,作為育種親本材料在黃淮南部冬麥區(qū)很難被直接利用[17]。當(dāng)前,我國黃淮南部冬麥區(qū)的小麥生產(chǎn)上急需兼抗赤霉病和條銹病的新品種,育種上迫切需要兼抗赤霉病和條銹病的優(yōu)異親本材料。小麥新品系979-5是本課題組從黃淮南部冬麥區(qū)大面積推廣種植的品種西農(nóng)979中系選而成,屬弱冬性,株高較低(75 cm左右),莖稈粗壯,抗倒伏能力強,中抗條銹病和葉銹病,籽粒大長呈角質(zhì),為優(yōu)質(zhì)強筋高產(chǎn)類型,但中感赤霉病[18]。為創(chuàng)制適宜黃淮南部冬麥區(qū)育種親本材料,本課題組于2012年組配了蘇麥3號與979-5的雜交組合,利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間接種鑒定等技術(shù),創(chuàng)制出20個攜帶有Fhb1、Fhb2及Fhb5基因的優(yōu)異育種親本材料[19]。2016年起,利用這些優(yōu)異親本材料,分別與本課題組育成的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種西農(nóng)235、西農(nóng)282和西農(nóng)226組配雜交組合,從其后代中選育出13個遺傳穩(wěn)定的抗赤霉病新品系。目前部分新品系正在參加黃淮南部冬麥區(qū)的多點適應(yīng)性試驗。本研究以這些小麥新品系為材料,在鑒定其赤霉病和條銹病抗性及主要農(nóng)藝性狀的基礎(chǔ)上,分析其抗赤霉病的遺傳基礎(chǔ),為小麥新品系的研究和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的13個抗赤霉病的小麥新品系(表1),是本課題組前期以高抗赤霉病的親本材料k10、k12和k13[19]為母本,分別與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種西農(nóng)235、西農(nóng)282和西農(nóng)226雜交,綜合利用SSR分子標(biāo)記輔助選擇、赤霉病麥粒菌地表接種和單花滴注法接種鑒定、條銹病菌田間接種鑒定、大群體系譜選擇等技術(shù)選育而成。對照材料分別為矮抗58(高感赤霉病,高感條銹病)、979-5(中感赤霉病,中抗條銹病)和蘇麥3號(高抗赤霉病,高感條銹病)。

表1 參試材料的赤霉病和條銹病抗性Table 1 Resistance to FHB and stripe rust in tested materials

所有參試材料均進行連續(xù)兩年的試驗,分別于2020年10月12日和2021年10月11日播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥育種試驗田。每個品系(種)種植3行,株距0.07 m,行距0.27 m,行長2.0 m。在小麥整個生長期間除不進行病害防治外,其余管理措施同當(dāng)?shù)卮筇铩?/p>

1.2 小麥赤霉病田間接種和鑒定

試驗所用的赤霉病4個強致病力菌株(F0980、F1312、F0609和F0301)與國家小麥新品種區(qū)域試驗鑒定所用相同,由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)殷貴鴻研究員惠贈。采用單花滴注法接種:將預(yù)先培養(yǎng)的4個菌株孢子液混合并稀釋孢子濃度為1×105·mL-1,在小麥揚花期取10 μL的懸浮液注入小麥穗中上部第4個小穗最外側(cè)的小花內(nèi),隨即噴濕接種穗,并套袋保濕72 h。每個品系接種20個單穗,兩個重復(fù)。

在接種21 d后調(diào)查每個接種穗的發(fā)病小穗數(shù)和總小穗數(shù),計算平均病小穗率和平均嚴(yán)重度。病小穗率=發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%。記載標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2954-2016:小麥區(qū)域試驗品種抗赤霉病鑒定技術(shù)規(guī)程》[20],依據(jù)平均嚴(yán)重度劃分抗病等級:抗病(R)(0<平均嚴(yán)重度<2.0),中抗(MR)(2.0≤平均嚴(yán)重度<3.0),中感(MS)(3.0≤平均嚴(yán)重度<3.5),感病(S)(平均嚴(yán)重度≥3.5)。

1.3 小麥條銹病田間接種和鑒定

分別于2020年3月20日和2021年3月15日接種條銹病菌,所用3個條銹病強致病力菌株CYR32、CYR33和CYR34,與國家小麥新品種區(qū)域試驗鑒定所用相同,由甘肅省農(nóng)科院提供。于田間空氣濕度較大的傍晚進行接種,將條銹菌混合小種與淀粉以1∶1 000比例混勻,采用小麥葉心抖粉法,于每個材料的第一行接種20株。當(dāng)條銹病進入盛發(fā)期時,即感病對照品種的病害最大嚴(yán)重度達到90%～100%,對發(fā)病情況進行田間調(diào)查,參照《小麥抗條銹病評價技術(shù)規(guī)范》[21]分級為:抗病(R,葉片有壞死斑,有零星的孢子),中抗(MR,葉片褪綠,有中等大小的孢子堆),中感(MS,葉片大片褪綠,有大片孢子堆),感病(S,葉片不褪綠,且出現(xiàn)大片孢子堆)。

1.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

在小麥生長發(fā)育的關(guān)鍵時期,按農(nóng)藝性狀的記載標(biāo)準(zhǔn),分別調(diào)查幼苗的耐寒性、開花期、株高、穗長、穗粒數(shù)、籽粒大小(包括千粒重、粒長、粒寬)等主要農(nóng)藝性狀。除抗寒性和開花期按群體性狀記載外,其余性狀每個材料調(diào)查10個單株,取其平均值。

1.5 抗性基因檢測

采用CTAB法[22]提取苗期小麥鮮葉基因組DNA。

選用已報道的與蘇麥3號抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2、Fhb5和QFhs.crc-2DL分別緊密連鎖的分子標(biāo)記進行檢測,引物及擴增程序同相應(yīng)的參考文獻(表2)。引物由陜西中科羽瞳生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL:10 μL 2×Taq Master Mix for PAGE(諾唯贊,南京),上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1),1 μL模板(50 ng·μL-1),7 μL ddH2O。除標(biāo)記TaHRC-GSM的PCR擴增產(chǎn)物用2.0 %瓊脂糖凝膠外,其余標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物均用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

表2 選用的抗赤霉病基因/QTL連鎖的分子標(biāo)記Table 2 Selected molecular markers linked to FHB resistance genes/QTL

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)為2年平均值,使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試品系的赤霉病抗性分析

由表1可知,13個參試新品系的赤霉病抗性水平均高于對照中感品種西農(nóng)979-5,其中2個品系(Xn12-2和Xn13-2)的表現(xiàn)為抗,平均病小穗率為11.5%、13.4%;平均嚴(yán)重度均為1.9,抗性水平同蘇麥3號;其余11個品系的赤霉病抗性表現(xiàn)均為中抗,平均病小穗率均小于30%。

2.2 參試品系的條銹病抗性分析

13個參試品系中4個品系表現(xiàn)為中抗條銹病,其余9個品系表現(xiàn)為中感條銹病。其中,Xn12-2抗赤霉病,中抗條銹病;Xn10-2、Xn12-3和Xn12-7中抗赤霉病,中抗條銹病(表1)。這些兼抗赤霉病和條銹病的新品系可作為黃淮麥區(qū)優(yōu)異育種親本材料。

2.3 參試品系的主要農(nóng)藝性狀分析

從表3可以看出,參試品系均具有耐寒、矮稈、長穗、高粒重的特點。其中,株高為67～82 cm;除品系Xn10-3開花期特別早外(與蘇麥3號相同),其余參試品系的開花期基本與西農(nóng)979相同。在籽粒性狀中,參試品系的千粒重為39.2～50.2 g,顯著高于蘇麥3號;粒寬3.40～3.64 mm,粒長在6.44～7.53 mm之間,品系間差異較為名顯(圖1)。以上結(jié)果表明,參試部分品系不僅具有良好的赤霉病和條銹病抗性,其主要農(nóng)藝性狀能滿足育種目標(biāo)要求。

表3 新品系的主要農(nóng)藝性狀Table 3 Main agronomic traits of the new lines

a和b圖分別為部分材料10個粒籽的長度和寬度。a and b show the length and width of 10 grains of partial lines, respectively.圖1 部分材料的籽粒大小Fig.1 Grain size of the partial lines

2.4 參試品系Fhb1基因分析

利用已報道的與抗赤霉病基因Fhb1緊密關(guān)聯(lián)的5個分子標(biāo)記TaHRC-GSM、Xgwm493、Xgwm533、Xbarc133和Xbarc147對參試品系的親本進行了多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn),親本材料k10、k12和k13與親本材料西農(nóng)235、西農(nóng)282和西農(nóng)226在Xgwm493位點擴增片段大小一致,表現(xiàn)為單態(tài),其余4個標(biāo)記表現(xiàn)為多態(tài)。利用4個具有多態(tài)性的標(biāo)記對參試品系進行分析發(fā)現(xiàn),在TaHRC-GSM標(biāo)記位點,11個品系檢測到蘇麥3號的特異條帶,Xn10-3和Xn12-1兩個品系中未檢測到蘇麥3號的特異條帶(表4,圖2a);在Xbarc147標(biāo)記位點,10個品系中檢測到蘇麥3號的特異條帶;在Xbarc133標(biāo)記位點,3個品系中檢測到蘇麥3號的特異條帶;在Xgwm533標(biāo)記位點,6個品系中檢測到蘇麥3號的特異條帶。這表明,這些抗赤霉病新品系中,84.6%具有蘇麥3號Fhb1基因的TaHRC-GSM標(biāo)記,76.9%具有蘇麥3號Xbarc147標(biāo)記位點,9個品系同時具有蘇麥3號TaHRC-GSM和Xbarc147標(biāo)記位點。

a和b圖分別為分子標(biāo)記TaHRC-GSM和Xbarc147的檢測結(jié)果;箭頭指示蘇麥3號的特征條帶。a and b show the detection results of molecular marker TaHRC-GSM and Xbarc147, respectively. Arrows indicate the specific bands for Sumai 3.圖2 部分參試材料3BS染色體臂上的分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.2 Molecular marker detection on 3BS chromosome of some test materials

表4 參試材料的抗赤霉病基因/QTL連鎖分子標(biāo)記檢測結(jié)果Table 4 Detection results of gene/QTL linked molecular markers for FHB resistance in the tested materials

2.5 參試品系Fhb2基因位點的標(biāo)記分析

利用與抗赤霉病基因Fhb2緊密連鎖的3個分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn),親本材料k10、k12和k13與西農(nóng)235、西農(nóng)282和西農(nóng)226在Xgwm133和Xgwm644位點擴增片段大小一致,表現(xiàn)為單態(tài),在標(biāo)記Xbarc101位點表現(xiàn)為多態(tài)。在Xbarc101位點,2個品系(Xn10-1和Xn13-1)檢測到蘇麥3號的特異條帶(表4,圖3a),其余品系中未檢測到蘇麥3號的特征帶譜。

a、b和c圖分別為分子標(biāo)記Xbarc101、Xgwm154和Xgwm539的檢測結(jié)果。箭頭指示蘇麥3號的特征條帶。a, b and c show the detection results of molecular marker Xbarc101, Xgwm154 and Xgwm539, respectively. Arrows indicate the specific bands for Sumai 3.圖3 部分參試材料分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.3 Molecular marker detection results of some test materials

2.6 參試品系Fhb5基因位點的標(biāo)記分析

利用與抗赤霉病基因Fhb5緊密連鎖的4個分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn),親本材料k10、k12和k13與西農(nóng)235、西農(nóng)282和西農(nóng)226在Xgwm293和Xbarc186位點擴增片段大小一致,表現(xiàn)為單態(tài),在Xgwm304和Xgwm154位點表現(xiàn)為多態(tài)。進一步分析發(fā)現(xiàn),在Xgwm304標(biāo)記位點,Xn12-5、Xn12-6兩個品系中檢測到蘇麥3號的特異條帶;在Xgwm154標(biāo)記位點,5個品系中檢測到蘇麥3號的特異條帶(表4,圖3b)。

2.7 參試品系QFhs.crc-2DL基因位點的標(biāo)記分析

利用與抗赤霉病基因QFhs.crc-2DL緊密關(guān)聯(lián)的2個分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn),親本材料k10、k12和k13與西農(nóng)235、西農(nóng)282和西農(nóng)226在Xwmc41位點擴增片段大小一致,表現(xiàn)為單態(tài),在Xgwm539位點表現(xiàn)為多態(tài)。進一步分析發(fā)現(xiàn),在Xgwm539位點,11個品系中檢測到蘇麥3號的特異條帶(表4,圖3c)。

3 討論

缺乏適于在我國黃淮南部麥區(qū)大面積推廣的抗赤霉病品種,是小麥赤霉病在黃淮南部麥區(qū)發(fā)病逐年加重的重要原因[30],培育抗赤霉病品種已成為該區(qū)小麥育種的主要目標(biāo)之一[31-32]。蘇麥3號是世界公認(rèn)的抗赤霉病品種,具有多個抗赤霉病基因/QTLs,其中Fhb1、Fhb2、Fhb5和QFhs.crc-2DL等受到廣泛應(yīng)用[2]。本課題組以蘇麥3號為抗源,采用分子標(biāo)記輔助選擇和病原菌接種鑒定的方法,創(chuàng)制出適應(yīng)黃淮南部麥區(qū)生態(tài)條件的、攜帶有Fhb1抗病基因位點的抗赤霉病育種親本材料[19],2016年以這些親本材料為基礎(chǔ),分別與我國黃淮南部冬麥區(qū)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)廣適新品種西農(nóng)226、西農(nóng)282和西農(nóng)235等組配雜交組合,采用系譜選擇法,自F2～F6代持續(xù)進行赤霉病抗性基因分子標(biāo)記輔助選擇、病原菌田間土表接種和單花滴注法鑒定,育成赤霉病抗性優(yōu)異且主要農(nóng)藝性狀優(yōu)良的13個新品系。

綜合赤霉病和條銹病抗性鑒定、分子標(biāo)記檢測和主要農(nóng)藝性狀分析,參試的13個新品系不僅具有較好的農(nóng)藝性狀、優(yōu)異的條銹病抗性,且赤霉病抗性水平達抗或中抗。其中,11個品系含有蘇麥3號的TaHRC-GSM位點,可能攜帶抗性基因Fhb1,其中2個品系(Xn12-2和Xn13-2)赤霉病抗性同蘇麥3號,表現(xiàn)為抗。這也進一步證明,TaHRC-GSM是抗性基因Fhb1的可靠有效選擇標(biāo)記[7]。這11個品系同時還具有蘇麥3號其它位點的優(yōu)異等位變異,如Xn12-2具有QFhs.crc-2DL的優(yōu)異等位變異,Xn13-2具有Fhb5和QFhs.crc-2DL的優(yōu)異等位變異,Xn13-1具有Fhb2和QFhs.crc-2DL的優(yōu)異等位變異。但中抗赤霉病的品系Xn10-3和Xn12-1卻沒有蘇麥3號的TaHRC-GSM標(biāo)記位點,僅攜帶蘇麥3號的Xgwm533和Xgwm539位點的標(biāo)記,其抗性來源有待進一步研究。本研究選用的參試新品系,其赤霉病抗性水平表現(xiàn)好且主要農(nóng)藝性狀較好的根本原因,可能與本課題組近10余年來一直堅持“自主創(chuàng)新親本材料、強化早代大群體多途徑赤霉病抗性鑒選技術(shù)”的應(yīng)用密不可分:(1)創(chuàng)制適宜黃淮冬麥區(qū)的優(yōu)異抗赤霉病k系列親本材料[19],并選用赤霉病田間抗性較好的育成品種(西農(nóng)235、西農(nóng)282、西農(nóng)226等)組配雜交組合,為優(yōu)良抗赤霉病新品系(種)選育奠定良好的遺傳基礎(chǔ);(2)F2大群體(每個組合2 000～3 000株)利用麥粒菌及玉米秸稈結(jié)合進行地表接種,苗期條銹病菌接種鑒定,開花期選優(yōu)株單花滴注法接種,綜合赤霉病和條銹病抗性進行優(yōu)良單株選擇;(3)中選單株的F3-5株系群,根據(jù)收獲的種子量盡可能保證較大的群體,繼續(xù)上述的抗性鑒選,中選單株繼續(xù)赤霉病抗性基因/QTLs的分子標(biāo)記分析,了解其抗性遺傳背景。持續(xù)兩年的田間種植觀察發(fā)現(xiàn),個別參試品系還中抗葉銹病(田間自然發(fā)病下),但葉尖枯現(xiàn)象較重,可能影響籽粒產(chǎn)量,因此還需要多年多點產(chǎn)量比較試驗以進一步改良。