31份小麥材料中抗旱基因的KASP檢測

李 瑋,孔淑鑫,宋國琦,李玉蓮,張淑娟,張榮志,高 潔,李吉虎,樊慶琦,李根英

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國家工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心,山東濟南 250100; 2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,山東德州 251100)

干旱是影響小麥產(chǎn)量的重要因素之一。選育抗旱節(jié)水品種是保障旱地小麥穩(wěn)產(chǎn)最經(jīng)濟、有效的方法。傳統(tǒng)小麥抗旱育種是在種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)上,通過雜交后代的抗旱鑒定和產(chǎn)量篩選培育抗旱品種,通常采用高產(chǎn)×抗旱或抗旱×抗旱的組合模式,目前仍是品種選育的主流方法。但傳統(tǒng)小麥抗旱育種方法周期較長、育種效率低,因此縮短育種年限、加快育種進程已成為目前小麥新品種選育的客觀要求。

隨著小麥基因組的測序完成,越來越多與小麥抗旱相關(guān)的基因被定位和克隆,為小麥抗旱分子標(biāo)記育種奠定了基礎(chǔ)。鞠麗萍等[1]根據(jù)不同抗旱性小麥品種中鐵結(jié)合蛋白基因(TaFer-A1)的序列差異開發(fā)了分子標(biāo)記FerA1-intrl,并進行了有效性驗證,發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記FerA1-intr1可用于小麥抗旱性的鑒定和篩選,也表明TaFer-A1基因與小麥抗旱性有關(guān)。Shoaib等[2]利用16個小麥抗旱基因的KASP標(biāo)記對153份小麥品種進行了檢測,發(fā)現(xiàn)優(yōu)異等位基因與產(chǎn)量性狀顯著相關(guān)。于銘等[3]通過分析吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(TaP5CS)在不同抗旱性小麥品種中的序列差異,發(fā)現(xiàn)第5內(nèi)含子上存在SNP,據(jù)此開發(fā)了分子標(biāo)記TaP5CS-1A-CAPS,可用于小麥萌發(fā)期抗旱性的篩選與鑒定。Mao等[4]研究發(fā)現(xiàn),TaPYL1-1B基因啟動子區(qū)的20 bp插入與抗旱性顯著關(guān)聯(lián),20 bp的插入中含有的MYB元件可以增強TaPYL1-1B的表達,從而提高小麥的抗旱性。以上研究均為小麥抗旱品種選育提供了有效標(biāo)記。隨著大量與抗旱相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用,分子標(biāo)記在抗旱小麥品種輔助選育過程中已成為重要的篩選方法。

為提高抗旱小麥育種過程中親本材料選擇的目的性和準(zhǔn)確性,本研究利用29個KASP標(biāo)記,對收集到的16份抗旱小麥品種和15份高產(chǎn)小麥品種進行檢測,明確這些材料中抗旱基因的分布情況,以期為分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)制聚合優(yōu)異基因的新種質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種共31份,其中抗旱小麥品種16份,包括濟麥379、山農(nóng)27、和尚頭、青麥6號、臨麥9號、濟麥262、濟麥60、存麥1號、晉麥47、晉麥92、晉麥101、青麥7號、魯麥21、品育8161、鶴麥801和洛旱7號;高產(chǎn)小麥品種15份,包括MFW1、魯研128、周麥27、山農(nóng)20、煙農(nóng)19、煙農(nóng)999、中麥578、濟麥5198、濟麥38、山農(nóng)30、濟麥22、山農(nóng)29、百農(nóng)207、魯原502和矮抗58,均由本課題組收集保存。

1.2 DNA提取和分子標(biāo)記檢測

取5粒均勻飽滿的小麥種子置于一次性培養(yǎng)皿中,加水浸泡24 h左右,待種子露白后選擇生長一致的3粒種子種植在裝有育苗基質(zhì)的塑料盆中,在人工氣候室(23 ℃光照/18 ℃黑暗,16 h光照/18 h黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)7 d后,每株取3個葉片,按照高 潔等[5]的方法提取DNA。

1.3 分子標(biāo)記類型轉(zhuǎn)換及KASP檢測

利用已報道的29個標(biāo)記[2-4,6-12](表1)對供試材料進行檢測,其中18個標(biāo)記類型為KASP,所用引物序列參考相應(yīng)文獻。對其他11個標(biāo)記進行KASP轉(zhuǎn)換,利用文獻中報道的原始標(biāo)記引物序列,通過WheatOmics[13]網(wǎng)站進行序列比對,獲得參考基因組的分子標(biāo)記擴增序列,按照文獻描述的SNP或Indel信息修改參考基因組序列,獲得等位變異序列。用DNAMAN對2個序列進行比對,設(shè)計KASP標(biāo)記引物。

表1 已報道的29個標(biāo)記的類型Table 1 Types of 29 markers reported

進一步對KASP標(biāo)記引物進行檢測,選取分型效果好的引物組合進行檢測。試驗所需的KSAP標(biāo)記引物均由北京擎科生物科技有限公司合成,共有三組混合引物,每一組混合引物都含有兩條末端堿基不同的等位基因正向引物(100 μmol·L-1)各12 μL、一條共同的反向引物(100 μmol·L-1)30 μL以及ddH2O 46 μL。PCR反應(yīng)體系為5 μL,包括2.0 μL DNA ( 50 ng·μL-1),2.5 μL KASP Master Mix ( LGC Genomics, Hoddeston, UK),0.07 μL混合引物和0.43 μL ddH2O。為避免對試驗結(jié)果的誤判,設(shè)置空白對照,其DNA模板用ddH2O代替。PCR反應(yīng)在ABI veriti PCR儀上進行,PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性20 s,65 ℃退火和延伸25 s,10個循環(huán);57 ℃退火和延伸60 s,30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后利用PHERA star多功能酶標(biāo)儀讀取熒光數(shù)據(jù)﹐通過Kluster Caller軟件(LGC Genomics, Hoddeston, UK)生成基因分型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記類型的轉(zhuǎn)換結(jié)果

由于部分基因(表2第1列)的原始標(biāo)記為STS或CAPS,為了提高檢測效率,需將其轉(zhuǎn)化成KASP標(biāo)記。利用中國春參考基因組通過引物的序列比對,獲得引物的物理位置以及11個分子標(biāo)記擴增產(chǎn)物的原始參考基因組序列,根據(jù)SNP或Indel位點設(shè)計11對KASP引物,并對31份小麥品種的DNA進行檢測,表明這些STS或CAPS標(biāo)記已成功轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記(表2)。其中,TaSRL1-4A基因的2個SNP轉(zhuǎn)化為2個KASP標(biāo)記。

2.2 KASP標(biāo)記檢測結(jié)果

利用29個KASP標(biāo)記對31份小麥品種進行檢測,部分標(biāo)記的檢測結(jié)果如圖1所示。根據(jù)31份小麥品種的檢測結(jié)果,可將KASP標(biāo)記分成四類,第一類是優(yōu)異等位基因占比較高的標(biāo)記(圖2),包括DRO5A(90.32%)、TaDreb_SNP(77.42%)、TaPPH-KASP-13(83.87%)、PYL1B(83.87%)、VSR1-2BMITE(87.10%)、1fehw3(74.19%)、SnRK2.4B3(90.32%)、TaSnRK2.8-5A-KASP-7(93.55%)、TaLTPs-KASP-11+TaLTPs-KASP-12(87.10%)和Wcor142B(77.42%),表明這些標(biāo)記檢測到的優(yōu)異等位基因在供試材料中利用程度較高;第二類是兩種等位基因占比相當(dāng)?shù)臉?biāo)記,包括P5CS1A(54.84%)、SRL14A929(54.84%)、SRL14A96(54.84%)和TaSnRK2.3-1A-KASP-2(41.94%),表明這些標(biāo)記檢測到的優(yōu)異等位基因在供試材料中利用程度中等;第三類是優(yōu)異等位基因占比較低的標(biāo)記,包括WRKY51-2B(9.68%)、WRKY51-2A(32.26%)、TaSnRK2.3-1B-KASP-4(22.58%)、SnRK2.4A3(3.23%)、TaSnRK2.9-5A-KASP-5(23.33%)、TaSnRK2.9-5A-KASP-6(23.33%)、COBL5B(22.58%)、AX109558906-6B(29.03%)和OSCA1.4(12.90%),表明這些標(biāo)記檢測到的優(yōu)異等位基因在供試材料中利用程度較低;第四類是在所檢測材料中只檢測到一種等位基因的標(biāo)記,包括TaSAP-7B-KASP-8、AX-95025477-7B、TaMoc-2433、DRO5B和TaPARG-2A-KASP-9,其中AX-95025477-7B和TaMoc-2433檢測到的基因為非優(yōu)異等位基因,其余為優(yōu)異等位基因的功能標(biāo)記。

a:WRKY51-2A;b:TaDreb_SNP;c:AX-95025477-7B,d:P5CS1A。紅色點為Hex等位基因;藍色點為Fam等位基因;綠色點為雜合型;黑色點為陰性對照。a: WRKY51-2A; b: TaDreb_SNP; c: AX-95025477-7B; d: P5CS1A. Red dots represent Hex allele; Blue dots represent Fam allele; Green dots represent heterozygous; Black dots represent no template control.圖1 供試材料中部分KASP標(biāo)記檢測分型圖(散點圖)Fig.1 Detection of the tested wheat materials by KASP markers(scatter plots)

圖中白色、淺灰色、黑色和深灰色柱子分別代表Fam等位基因、Hex等位基因、雜合基因型和未知基因型。The white, light gray, black and dark gray bars represent Fam, Hex, heterozygous and unknown allele, respectively.圖2 29個KASP標(biāo)記所檢測到的等位基因分布頻率Fig.2 Allele frequency detected by 29 KASP markers

2.3 雙標(biāo)記對抗旱相關(guān)基因的檢測結(jié)果

分別用2個KASP標(biāo)記對3個抗旱基因TaLTPs、TaSRL1-4A和TaSnRK2.9-5A進行檢測,TaLTPs基因的2個標(biāo)記TaLTPs-KASP-11和TaLTPs-KASP-12是根據(jù)TaLTPs啟動子區(qū)的2個SNP開發(fā)而來,2個SNP共形成3種單倍型[14],本研究中共檢測到HapⅡ和HapⅢ兩種單倍型,其中HapⅢ是主要單倍型,與株高相關(guān)。TaSRL1-4A基因雖然在啟動子和編碼區(qū)共有3個SNP[9],但僅有2種單倍型Hap-4A-1和Hap-4A-2,2個標(biāo)記SRL14A929和SRL14A96的檢測結(jié)果完全一致,2種單倍型各占50%左右,Hap-4A-2單倍型與高千粒重相關(guān)。TaSnRK2.9-5A基因的2個標(biāo)記TaSnRK2.9-5A-KASP-5和TaSnRK2.9-5A-KASP-6形成4種單倍型[15],本研究共檢測到Hap-5A-1、Hap-5A-3和Hap-5A-4三種單倍型,2個標(biāo)記的檢測結(jié)果完全一致。其中Hap-5A-1與高千粒重相關(guān),Hap-5A-4與高穗粒數(shù)相關(guān),分別占比23.33%和3.23%。

2.4 高產(chǎn)小麥品種和抗旱小麥品種之間優(yōu)異等位基因的數(shù)目差異

將供試小麥品種分成高產(chǎn)組和抗旱組分別進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)大部分標(biāo)記所檢測到的優(yōu)異等位基因數(shù)目在組間差異較小(小于等于3),差異優(yōu)異等位基因數(shù)目超過3個的標(biāo)記包括PYL1B、Wcor142B、SRL14A96、SRL14A929、TaSnRK2.3-1A-KASP-2和AX109558906-6B(圖3),其中僅Wcor142B在高產(chǎn)組中檢測到的優(yōu)異等位基因數(shù)目比抗旱組多,其余均是抗旱組較多,表明這些標(biāo)記在抗旱育種中值得關(guān)注。此外,WRKY51-2B和SnRK2.4A3標(biāo)記所檢測到的優(yōu)異等位基因數(shù)目雖然在組間差異較小,但僅在抗旱組中能檢測到優(yōu)異等位基因。攜帶TaWRKY51-2B位點優(yōu)異等位基因 Hap-2B-Ⅱ(與根長相關(guān)[6])的品種有晉麥47、晉麥92和晉麥101,攜帶TaSnRK2.4-3A位點優(yōu)異等位基因T allele(與高千粒重相關(guān)[16])的品種僅有濟麥379。

黑色和白色分別代表抗旱小麥品種和高產(chǎn)小麥品種。Black and white represent drought resistant wheat cultivars and high-yield wheat cultivars, respectively.圖3 抗旱小麥品種和高產(chǎn)小麥品種優(yōu)異等位基因數(shù)目差異比較Fig.3 Comparison of allele number between drought resistant wheat cultivars and high-yield wheat cultivars

3 討論

抗旱育種在我國開展較早,通過常規(guī)育種方法已選育出大量抗旱節(jié)水小麥品種。進入21世紀(jì)以來,抗旱小麥新品種選育進展緩慢,新審定的旱地品種雖然在產(chǎn)量和品質(zhì)上有所提高,但在生產(chǎn)上抗旱性的表現(xiàn)并不佳。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,越來越多的功能基因或QTL被挖掘,為分子標(biāo)記輔助選擇抗旱育種奠定了基礎(chǔ)[17-18]。明確親本的等位基因組成,根據(jù)基因互補原則,選擇抗旱基因供體親本和高產(chǎn)受體親本進行雜交組配,結(jié)合農(nóng)藝性狀選擇和分子標(biāo)記輔助選擇的方法可提高育種效率。本研究利用29個KASP標(biāo)記對收集的16個抗旱小麥品種和15個高產(chǎn)小麥品種進行了分子檢測,通過對比發(fā)現(xiàn),Wcor142B標(biāo)記在高產(chǎn)小麥品種中檢測到的優(yōu)異等位基因占比較高,而PYL1B、SRL14A96、SRL14A929、TaSnRK2.3-1A-KASP-2、AX109558906-6B標(biāo)記在抗旱小麥品種中檢測到的優(yōu)異等位基因占比較高。Mao等[4]研究發(fā)現(xiàn),TaPYL1-1B位點的優(yōu)異等位基因與小麥的高ABA(脫落酸)敏感性、高光合能力和高水分利用效率相關(guān)。Zhuang等[9]研究發(fā)現(xiàn),TaSRL1-4A位點的優(yōu)異等位基因Hap-4A-2與淺根、矮稈和高千粒重相關(guān)。Miao等[19]研究發(fā)現(xiàn),TaSnRK2.3-1A位點的優(yōu)異等位基因Hap-1A-1與矮稈和高千粒重相關(guān)。Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn),QTDW.caas-6BL、QRDW.caas-6BL和QSDW.caas-6BL位點的優(yōu)異等位基因與較高的根干重、根表面積和地上部干重相關(guān)。本研究中TaPYL1-1B、TaSRL1-4A、TaSnRK2.3-1A以及QTDW.caas-6BL/QRDW.caas-6BL/QSDW.caas-6BL的優(yōu)異等位基因占比分別為83.87%、45.16%、41.94%和29.03%。說明上述位點的優(yōu)異等位基因在育種中已得到利用,但是利用率還有待提升。本研究僅在抗旱品種中檢測到優(yōu)異等位基因TaWRKY51-2B和TaSnRK2.4-3A,并篩選到TaWRKY51-2B的供體親本為晉麥47、晉麥92、晉麥101,TaSnRK2.4-3A的供體親本為濟麥379。濟麥379是新審定的節(jié)水多抗優(yōu)質(zhì)早熟小麥新品種,攜帶TaSnRK2.4-3A位點優(yōu)異等位基因;攜帶TaWRKY51-2B位點的優(yōu)異等位基因的三個品種中,晉麥101與濟麥379的優(yōu)異等位基因互補性更好。因此,開展以晉麥101為優(yōu)異等位基因供體,以濟麥379為受體的遺傳改良工作,在保持濟麥379優(yōu)異性狀的基礎(chǔ)上利用分子育種技術(shù)進一步聚合抗旱和高產(chǎn)優(yōu)異等位基因,有望培育出更好的抗旱品種。