間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)LXA4對糖尿病腎病大鼠的影響

李亞玲 凡 洋 雷 蕾 白彝華

隨著糖尿病發(fā)生率的日益增加,作為糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)也已變成一個世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。DN的發(fā)生涉及多種炎性細(xì)胞和分子的參與,包括白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin -8,IL-8)、干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)及趨化因子-1(CXCL1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等[2,3]。上述各種因素促進(jìn)TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),活化的TGF-β1與其受體相互作用激活Smad依賴和非Smad依賴的下游信號,尤其是Smad2和Smad3[4]。其中Smad3是各種促纖維化介質(zhì)包括TGF-β、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ和晚期糖基化終產(chǎn)物的主要促纖維化轉(zhuǎn)錄因子[5,6]。

脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)是花生四烯酸經(jīng)脂氧合酶催化后的產(chǎn)物,能夠抑制多形核中性粒細(xì)胞的趨化,對炎性細(xì)胞和炎癥相關(guān)基因產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié),其還能抑制單側(cè)輸尿管梗阻和TGF-β1刺激的腎成纖維細(xì)胞中Smad2、Akt 和促分裂原活化蛋白激酶的激活[7,8]。在前期的研究中,通過對DN的動物模型進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)干預(yù),人們發(fā)現(xiàn)其腎臟纖維化指標(biāo)和炎性細(xì)胞因子減少,這表明MSC可以減輕DN引起的腎臟損傷和炎性反應(yīng)[9]。然而在DN中,移植MSC后其炎癥減輕和纖維化改善是否與LXA4有關(guān)尚不明確。本研究擬建立DN大鼠模型和細(xì)胞模型,分別予MSC、LXA4和LXA4拮抗劑WRW4等不同的處理,探討MSC在DN中的作用機(jī)制。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、脂氧素A4(LXA4)、脂氧素A4抑制劑(WRW4)購自大連Meilunbio公司;PBS、SDSPAGE購自北京Solarbio科技有限公司;大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)和大鼠MSC購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司;EDTA-胰酶購自美國Millipore公司;TGF-β、IL-6、IL-8、IFN-γ試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司;BCA試劑盒、RIPA裂解液購自武漢Servicebio公司; p-Smad2抗體、p-Smad3抗體、Smad2、Smad3抗體、CXCL1抗體、CXCR2抗體購自江蘇Affinity公司;β-actin購自英國Abcam公司;QuickGel 6100成像系統(tǒng)購自中國Monad公司。

2.動物模型的建立及分組:雄性SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量為180g～220g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可:SCXK(京)2019-0008。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食12h,隨機(jī)分為糖尿病腎病(DN)組30只和正常對照(Normal)組6只。以腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型,將STZ溶液[臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(11mol/L, pH值4～5)配制]抽吸于1ml注射器按65mg/kg的劑量注射至大鼠的左下腹腹腔,10min內(nèi)用完;Normal組則給予等量枸櫞酸鈉溶液。72h后對大鼠尾靜脈采血進(jìn)行隨機(jī)血糖檢測,并使用尿糖試紙定性大鼠隨機(jī)尿的尿糖水平,經(jīng)檢測隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L,尿糖定性(+++～++++),認(rèn)為成功建立糖尿病模型;完成糖尿病大鼠建模4周后,留取其24h尿并測定尿蛋白,如>30mg/24h,認(rèn)為DN建模成功[10]。將建模成功的DN大鼠分為DN組、DN+MSC組、DN+LXA4組、DN+LXA4+WRW4組、DN+MSC+WRW4組,每組6只。DN組(繼續(xù)正常喂養(yǎng)),DN+MSC組(尾靜脈注射MSC,5×106/0.5ml PBS)、DN+LXA4組(腹腔注射LXA4,10mg/kg)、DN+LXA4+WRW4組(腹腔注射LXA4,10mg/kg)和WRW4(1mg/kg)、DN+MSC+WRW4組(尾靜脈注射MSC,5×106/0.5mlPBS,每周1次,連續(xù)2周;同時腹腔注射WRW4,1mg/kg)。繼續(xù)喂養(yǎng)6周,期間每2周測1次血糖,實驗結(jié)束最后 1天,留取24h尿液標(biāo)本-18℃保存?zhèn)錂z。頸椎脫臼法處死大鼠后立即采集腎臟標(biāo)本,稱體質(zhì)量,冷PBS清洗,快速液氮冷凍以抽提蛋白。

3.細(xì)胞培養(yǎng):大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)和大鼠MSC分別將接種于含10%FBS的培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,用EDTA-胰酶消化,待細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞變圓時終止消化。待細(xì)胞占整個T25-培養(yǎng)瓶底部80%～90%時傳代、洗滌、再次消化,將細(xì)胞吹打均勻,吹打后將細(xì)胞懸液分裝至新的培養(yǎng)瓶內(nèi),加入適量新鮮培養(yǎng)基以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。HBZY-1加入高糖(high glucose,HG)(30mmol/L)培養(yǎng)72h后,對細(xì)胞進(jìn)行分組處理,實驗按6個組進(jìn)行:Normal (正常對照)組;高糖組;高糖+MSC(MSCs以4×105細(xì)胞/孔的密度接種在Transwell小室的底部隔室中,不與HBZY-1細(xì)胞直接接觸。)組;高糖+LXA4(100nmol/L)組;高糖+LXA4(100nmol/L)+WRW4(10μmol/L)組;高糖+MSC+WRW4(10μmol/L)組,培養(yǎng)48h后,收集細(xì)胞和上清液做相關(guān)檢測。

4.ELISA檢測HBZY-1細(xì)胞上清液中TGF-β、IL-6、IL-8、IFN-γ 的含量:嚴(yán)格按照TGF-β、IL-6、IL-8、IFN-γ試劑盒說明書操作,450nm波長處測定各孔的吸光度(A)值,再以建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出檢測指標(biāo)的真實含量,以皮克/毫升(pg/ml)表示。

5.Western blot法檢測HBZY-1細(xì)胞中p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、CXCL1、CXCR2蛋白表達(dá)情況:冰上裂解細(xì)胞后抽提總蛋白,BCA法(根據(jù)BCA測定試劑盒說明書操作)蛋白定量后,10μl蛋白上樣,10% SDS PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%的牛血清白蛋白室溫封閉30min,分別加入p-Smad2抗體(1∶500),p-Smad3抗體(1∶500),Smad2抗體(1∶1000),Smad3抗體(1∶1000),CXCL1抗體(1∶1000),CXCR2(1∶1000),4℃冰箱內(nèi)過夜。次日TBST溶液洗膜3次,以HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5000)室溫孵育30min,再次洗膜后,以β-actin為內(nèi)參,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)QuickGel 6100處理并分析圖像。

6.Western blot法檢測大鼠腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、CXCL1、CXCR2蛋白表達(dá)情況:每份樣品稱取腎組織50mg,加入800μl RIPA裂解液,在冰上充分研磨后,離心15min(轉(zhuǎn)速16000r/min),取2μl上清液,BCA法蛋白定量。10% SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30min,分別加入p-Smad2抗體(1∶500)、p-Smad3抗體(1∶500),Smad2抗體(1∶1000),Smad3抗體(1∶1000),CXCL1抗體(1∶1000),CXCR2(1∶1000),4℃冰箱內(nèi)過夜。次日TBST溶液洗膜3次,以HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5000)室溫孵育30min,再次洗膜后,以β-actin為內(nèi)參,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)QuickGel 6100處理并分析圖像。

結(jié) 果

1.細(xì)胞培養(yǎng)ELISA結(jié)果:與正常對照組比較,高糖組腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1、IL-6、IL-8和IFN-γ表達(dá)升高(P<0.001)。與高糖組比較,高糖+MSC組和高糖+LXA4組腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1、IL-6、IL-8、IFN-γ表達(dá)降低(P<0.001)。與高糖+MSC組和高糖+LXA4組比較,經(jīng)WRW4抑制后,高糖+MSC+WRW4組和高糖+LXA4+WRW4組腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1、IL-6、IL-8、IFN-γ表達(dá)升高(P<0.001,表1)。

表1 腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1、IL-6、IL-8和IFN-γ蛋白的表達(dá)

2.細(xì)胞培養(yǎng)Western blot法檢測結(jié)果:與正常對照組比較,高糖組p-Smad2、p-Smad3以及 CXCL1、CXCR2表達(dá)增高(P<0.05);與高糖組比較,高糖+MSC組和高糖+LXA4組p-Smad2、p-Smad3和 CXCL1、CXCR2表達(dá)減弱(P<0.05);與對應(yīng)的高糖+MSC組和高糖+LXA4組比較,高糖+MSC+WRW4組和高糖+LXA4+WRW4組p-Smad2、p-Smad3、CXCL1、CXCR2表達(dá)增加 (P<0.05,圖1～圖4)。

圖1 腎小球系膜細(xì)胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白免疫印跡分析

圖2 腎小球系膜細(xì)胞中p-Smad2、p-Smad3相對表達(dá)量

圖3 腎小球系膜細(xì)胞中CXCL1、CXCR2蛋白免疫印跡分析

圖4 腎小球系膜細(xì)胞中CXCL1、CXCR2相對表達(dá)量A.CXCL1;B.CXCR2

3.大鼠實驗Western blot法檢測結(jié)果: DN組大鼠腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3、CXCL1、CXCR2表達(dá)均高于正常對照組(P<0.01);DN+MSC組和DN+LXA4組腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3、CXCL1、CXCR2表達(dá)低于DN組 (P<0.001)和相對應(yīng)的DN+MSC+WRW4組、DN+LXA4+WRW4組 (P<0.05,圖5～圖8)。

圖5 腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3蛋白免疫印跡分析

圖6 腎臟組織中p-Smad2、p-Smad3相對表達(dá)量

圖7 腎臟組織中CXCL1、CXCR2蛋白免疫印跡分析

圖8 腎臟組織中CXCL1、CXCR2相對表達(dá)量

討 論

DN是世界范圍內(nèi)最常見的慢性腎臟疾病,也是終末期腎衰竭的主要原因[11]。代謝異常(如高血糖、高血壓和血脂異常)、血流動力學(xué)變化、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活和氧化應(yīng)激等參與了DN的發(fā)病[12]。然而DN的發(fā)展是復(fù)雜且多樣的,近年來有研究發(fā)現(xiàn),在DN動物模型和患者中,炎性介質(zhì)的循環(huán)水平和巨噬細(xì)胞對腎組織的滲透均增加[13]。趨化因子CXC基序配體-1(CXCL1)作為一種有效的促炎因子,主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞,它通過與受體CXCR2相互作用,在中性粒細(xì)胞和單核-吞噬細(xì)胞的浸潤中發(fā)揮重要作用[14]。激活的干擾素-γ(INF-γ)參與了慢性腎臟疾病的炎性反應(yīng)[15]。以上這些發(fā)現(xiàn)均強(qiáng)調(diào)了炎性反應(yīng)在DN腎臟損害方面的重要性。事實上,最初的炎性反應(yīng)旨在保護(hù)宿主,抑制上皮再生,有利于傷口的愈合以及穩(wěn)定受損的腎單位,但是當(dāng)炎癥沒有及時消退時,將出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增生、成纖維細(xì)胞增殖、足細(xì)胞損傷等病理過程,最終導(dǎo)致腎小球硬化及間質(zhì)纖維化[16,17]。而腎臟纖維化是DN進(jìn)展為慢性腎衰竭的病理基礎(chǔ)。

骨髓MSC具有巨大的自我更新和分化潛能,近年來被用于系統(tǒng)或局部治療多種疾病[18,19]。有研究發(fā)現(xiàn),骨髓MSC可降低腎間質(zhì)纖維化相關(guān)指標(biāo)如TGF-β、膠原纖維-Ⅰ、纖維連接蛋白、α平滑肌肌動蛋白和鈣黏蛋白E(E-cadherin)的表達(dá),減少炎性介質(zhì)MCP-1 和 TNF-α的表達(dá)[9]。然而,在DN中MSC調(diào)控其纖維化和炎癥的機(jī)制目前尚不完全清楚。LXA4是一種在急性炎性反應(yīng)中產(chǎn)生的二十烷類化合物,通過G蛋白偶聯(lián)受體/甲酰肽受體2促進(jìn)炎癥的消退,同時LXA4介導(dǎo)的let-7c基因上調(diào)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎臟纖維化[20,21]。糖尿病引起的腎臟纖維化和炎癥均與TGF-β/Smad2/3信號通路的激活有關(guān)[22]。TGF-β通過其配體、受體和下游的Smads分子對DN進(jìn)行多種調(diào)節(jié),活化的TGF-β1與2型跨膜受體結(jié)合導(dǎo)致1型跨膜受體磷酸化,促發(fā)細(xì)胞內(nèi)底物Smad2和Smad3的磷酸化(p-Smad2和p-Smad3)[4]。而抑制p-Smad2或p-Smad3可減輕急性腎損傷(AKI)的炎癥損傷[23,24]。

這些研究表明,p-Smad2或p-Smad3在DN的發(fā)病過程中有著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn),HG刺激后,HBZY-1細(xì)胞中纖維化指標(biāo)TGF-β1和促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8和INF-γ以及CXCL1、CXCR2的水平均增加,通過MSC和LXA4治療后,HBZY-1細(xì)胞中TGF-β1、IL-6、IL-8、INF-γ和CXCL1、CXCR2表達(dá)均減少,這些結(jié)果表明MSC或LXA4干預(yù)均能延緩DN的腎臟纖維化和炎癥進(jìn)展。為了檢測LXA4與MSC保護(hù)作用是否存在一定聯(lián)系,筆者使用LXA4受體拮抗劑WRW4來阻斷其下游信號通路。結(jié)果表明,WRW4抑制了MSC的保護(hù)作用。而給予LXA4和MSC顯示出類似的保護(hù)作用,提示LXA4在MSC對DN腎損傷的保護(hù)機(jī)制中起著重要作用。在體內(nèi)實驗和體外實驗的結(jié)果中,均顯示 MSC或LXA4干預(yù)能過夠下調(diào)DN細(xì)胞和大鼠模型腎臟組織中p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)。這表明MSC或LXA4處理均能抑制TGF-β/Smad的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而,WRW4的干預(yù)抑制了上述作用。這提示MSC干預(yù)可抑制DN中腎臟的纖維化和炎性細(xì)胞因子表達(dá),MSC對DN的這種腎臟保護(hù),其作用機(jī)制可能是提高了DN腎組織中LXA4的表達(dá)而實現(xiàn)的。

綜上所述,在DN的病理發(fā)展過程中炎癥和纖維化起著重要作用,MSC對HG刺激的腎臟細(xì)胞和STZ誘導(dǎo)的DN大鼠中腎臟組織的纖維化和炎癥發(fā)展具有明顯的治療作用, MSC對DN發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制很可能是提高了LXA4的表達(dá),這為MSC治療DN的潛能提供了新的靶點和理論參考。