PCSK9介導(dǎo)NF-κB信號通路致小鼠肝臟脂肪變性的機制研究

余小林 房彬彬 劉 芬 李文玲 陳邦黨 高曉明 楊毅寧

前蛋白轉(zhuǎn)換酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)在維持膽固醇穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[1,2]。越來越多的證據(jù)顯示,PCSK9的生物學(xué)作用遠不僅限于低密度脂蛋白受體的動態(tài)平衡,其獨立于低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)的機制也涉及其中,尤其與動脈粥樣硬化炎癥關(guān)系密切[3～5]。然而,肝臟作為PCSK9主要的產(chǎn)生地,PCSK9升高對肝臟本身有無不良的病理生理學(xué)作用,目前相關(guān)研究仍有爭議[6～8]。本研究通過探討PCSK9在小鼠肝臟對肝細胞脂質(zhì)代謝及炎性細胞因子的可能作用及機制,以期為非酒精性脂肪性肝病的治療提供新的靶點。

材料與方法

1.動物分組及飼養(yǎng):本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(倫理學(xué)審批號:IACUC-20200318-92)。雄性C57BL/6J小鼠購自上海南方模式動物中心[許可證號:SCXK(滬)2019-0002],8～10周齡,體質(zhì)量為18～20g。實驗動物轉(zhuǎn)入新疆醫(yī)科大學(xué)動物模式中心,自由進食、水,12h晝夜燈光開閉。采用隨機數(shù)字表法將36只小鼠平均分為空白組、GFP組和PCSK9組。于小鼠周齡10～12周,體質(zhì)量為20～25g時,以AAV8.2為載體構(gòu)建GFP和人源PCSK9經(jīng)鼠尾靜脈轉(zhuǎn)染至小鼠肝臟穩(wěn)定表達。高脂飼料購自北京科奧生物(脂肪20%,膽固醇1.25%,膽酸鈉0.5%),經(jīng)尾靜脈轉(zhuǎn)染2×1011vg/只 AAV8.2-GFP 12只作為GFP組,12只小鼠轉(zhuǎn)染2×1011vg/只 AAV8.2-hPCSK9 作為PCSK9組[9]。同期普食飼養(yǎng)12只小鼠作為空白組。構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病模型。飼養(yǎng)至24周,經(jīng)模型小鼠肝臟病理HE染色并光鏡下觀察肝臟氣球樣變性及肝臟油紅O染色判定模型構(gòu)建是否成功。

2.ELISA法檢測血清PCSK9、IL-1β水平:建模至24周后,提前禁食12h,戊巴比妥麻醉生效后,經(jīng)下腔靜脈采血,離心取血漿凍存至-80℃冰箱待測,檢測小鼠PCSK9(批號:P289194)及人源PCSK9(批號:P211478)ELISA試劑盒,購自美國R&D公司。IL-1β ELISA試劑盒(批號:E0563m),購自武漢伊艾博科技有限公司。血脂4項檢測(批號:202110630)購自南京生物建成研究所。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(批號:140221002),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(批號:140121005),購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

3.流式細胞術(shù):小鼠淋巴細胞分離液Percoll購自美國GE公司;流式細胞抗體購自美國Biolegend公司:NK1.1-PE cy7,CD3-FITC,CD4-Brilliant Violet 605,CD8a-APC cy7,TNF-α-PerCP/cyanine5.5,INF-β-APC,IL-2-PE/Dazzle 594, IL-4-PE, GrB-Brilliant Violet421。建模24周后,每組隨機選取6只小鼠,40% Precool梯度離心分離收集肝臟淋巴細胞。每只小鼠分別取1×106/ml肝臟單核細胞,加入含稀釋后的1640 EPMI培養(yǎng)基及細胞刺激劑,37℃孵育箱孵育4h。離心棄上清,加入CD16/32封閉30min。然后經(jīng)流式抗體外標、固定、破膜、離心穿孔、內(nèi)標,上機檢測。

4.Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達:按照蛋白提取試劑說明書,提取RAW264.7細胞總蛋白,經(jīng)BCA定量后,凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用牛血清白蛋白封閉膜1h,然后分別用一抗孵育:ABCA1 (1∶1000)、 CD36 (1∶1000)、 LDLR (1∶500)、 P50 (1∶300)、 p65 (1∶500)、 GAPDH(1∶5000),以上抗體購自英國Abcam公司。p-p65 (1∶1000)、 TLR4(1∶1000)、 IκBα(1∶1000)、 p IκBα(1∶1000)抗體購自美國CST公司。4℃孵育過夜。次日,利用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫下孵育1h,最后用ECL試劑盒顯色。Image J軟件分析各條帶灰度值,上述試驗重復(fù)3次。

5.肝臟病理切片及染色:取小鼠肝臟組織,4%多聚甲醛固定、OCT包埋。肝臟冷凍切片ORO(8μm),石蠟切片(4μm)用于HE和SRS。免疫組化: CD68購自英國Abcam公司(ab125212),稀釋倍數(shù)(1∶300),取肝組織病理切片(4μm)按標準免疫組化流程試驗并顯色。在光鏡下觀察肝臟組織切片。使用Image J軟件計算肝臟氣球樣變性、ORO及SRS陽性百分比及單位面積內(nèi)CD68陽性細胞數(shù)。

結(jié) 果

1.血脂及肝功能檢測:比較模型小鼠建模后(24周)時各組間血脂水平及肝功能,過表達人源PCSK9后,造成模型小鼠顯著血脂紊亂,與GFP組比較,表現(xiàn)為PCSK9組呈現(xiàn)顯著的高膽固醇、高低密度脂蛋白水平(P<0.001)以及高密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低(P<0.05),而甘油三酯在GFP組與PCSK9均顯著高于空白組(P<0.01),但GFP組與PCSK9組組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1中A～D)。與GFP組比較,PCSK9組血漿天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶顯著升高(P<0.05,圖1中 E、F)。

圖1 各組小鼠24周血漿中血脂4項及肝功能比較A、B、C、D依次為各組間血漿總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白水平比較;E、F依次為各組間天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平比較

2.ELISA分析:轉(zhuǎn)染hPCSK9后,PCSK9組小鼠總PCSK9水平顯著升高748.0±77.4pg/ml, GFP組113.5±18.8pg/ml(P<0.05), 空白組54.8±8.7pg/ml(P<0.001)。空白組測得IL-1β(7.92±0.89pg/ml),與GFP組(11.37±1.08pg/ml)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而PCSK9組IL-1β顯著增高 24.05±2.95pg/ml(P<0.05,圖2)。

圖2 ELISA法檢測小鼠24周血漿中總PCSK9及IL-1β水平A.PCSK9水平為鼠源+人源PCSK9血漿水平之和(n=8); B.各組IL-1β血漿水平(n=12)

3.肝臟組織病理學(xué)染色:小鼠肝臟組織HE染色顯示,空白組HE染色未發(fā)現(xiàn)氣球樣變性。PCSK9組肝細胞脂肪變性、氣球樣空泡化變大、增多百分比明顯高于GFP組(28.12%±4.07% vs 9.45%±1.83%,P=0.002)。與空白組(3.82%±0.77%)、GFP組(14.25%±1.63%)比較,PCSK9組(29.64%±1.67%)肝組織ORO染色百分比顯示脂質(zhì)蓄積明顯增高(P均<0.001)。與空白組、GFP組比較,SRS染色顯示PCSK9組非匯管區(qū)膠原纖維百分比顯著增多(0.88%±0.09%、1.75%±0.20%、4.58%±0.31%,P均<0.05,圖3)。

圖3 小鼠肝臟組織病理及染色A.小鼠肝臟組織病理切片(石蠟切片:蘇木精-伊紅、SRS染色4μm;冷凍切片:ORO染色8μm);黑色箭頭所指為氣球樣變,藍色箭頭所指為脂滴,紫色箭頭所指為非匯管區(qū)纖維化;B.GFP組與PCSK9組氣球樣變性百分比(空白組無氣球樣變性);C.3組間SRS染色百分比;D.3組間ORO染色百分比(n=6)

4.免疫組化研究: CD68陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析顯示,空白組與GFP組比較,CD68陽性細胞數(shù)兩組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(33±2個 vs 49±7個,P>0.05),CD68陽性細胞數(shù)在PCSK9組顯著增多(49±7個 vs 99±10個,P<0.001,圖4)。

5.流式細胞術(shù):小鼠肝臟淋巴細胞各亞群及炎性細胞因子劃門方案,以CD4+為例(圖5)。CD3+、CD4+、CD8+亞群在GFP組與PCSK9組間百分比比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而在NK細胞亞群中組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03,表1);在CD4+、CD8+細胞群中,IL-2及TNF-α炎性細胞因子百分比,PCSK9組顯著高于GFP組(P<0.05,表2),但IL-2在NK亞群中,PCSK9組顯著低于GFP組(P<0.05),提示在NK細胞群中,過表達PCSK9可能誘發(fā)了機體自然殺傷細胞免疫調(diào)節(jié)機制。而抗炎性細胞因子IL-4在各細胞群中比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),INF-γ及GrB也在各亞群中組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表2)。

表1 GFP組與PCSK9組肝臟淋巴細胞亞群比較

表2 GFP組與PCSK9組肝臟淋巴細胞亞群炎性細胞因子百分比比較

6.Western blot法檢測:PCSK9通過溶酶體顯著降解LDLR蛋白水平,上調(diào)TLR4蛋白水平,并促進膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白ABCA1上調(diào)介導(dǎo)膽固醇代謝,同時PCSK9上調(diào)清道夫受體CD36蛋白水平誘導(dǎo)單核-吞噬細胞脂質(zhì)吞噬。PCSK9介導(dǎo)TLR4蛋白激活p-IκBα,繼而從上游激活NF-κB途徑信號通路,導(dǎo)致p-p65蛋白顯著增加(圖6)。以上試驗均重復(fù)3次。

圖6 PCSK9對膽固醇流出蛋白、清道夫受體蛋白、NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響A.Western blot法檢測膽固醇流出蛋白、LDLR蛋白、清道夫受體蛋白、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白根據(jù)各蛋白相對分子質(zhì)量(依據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量);B～J.各目的蛋白統(tǒng)計分析柱狀圖

討 論

PCSK9作為調(diào)控膽固醇脂質(zhì)代謝的重要靶標,長期以來,大量研究集中在血脂代謝、動脈粥樣硬化炎癥機制等方面,較少研究關(guān)注PCSK9通過旁分泌參與肝臟代謝機制。Oleaga等[10]研究顯示,單次注射PCSK9抑制劑可增加血漿PCSK9水平至少12h,通過肝臟特殊的免疫回路反射性升高PCSK9水平,這種現(xiàn)象是否對肝臟本體造成不良影響,目前尚無明確的結(jié)論。Ruscica等[11]對非酒精性脂肪肝人群研究顯示,循環(huán)PCSK9水平與肝臟脂肪蓄積相關(guān)。高脂飲食本身會引起小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪變性[12]。通過肝臟大體病理學(xué)及油紅O、HE染色,GFP組小鼠自身也有肝脂肪變性,但在同等高脂飼料條件下,PCSK9組小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積、氣球樣變性及纖維化程度明顯增多、增大,肝細胞核結(jié)構(gòu)紊亂在PCSK9組顯著增強,可能機制之一為PCSK9誘導(dǎo)血脂代謝紊亂,本研究中,過表達PCSK9造成顯著脂質(zhì)代謝紊亂,主要表現(xiàn)為總膽固醇、低密度脂蛋白升高及高密度脂蛋白膽固醇降低,并且在PCSK9組中血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均顯著升高。

Th1和Th2作為機體活化的T淋巴細胞,Th1細胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等細胞因子,以促進炎性反應(yīng)為主,介導(dǎo)細胞免疫;而Th2分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子,與體液免疫反應(yīng)有關(guān),以抑制炎性反應(yīng)為主,Th1向Th2細胞的偏移被認為與免疫抑制相關(guān),Sun等[13]研究顯示,肝臟炎癥在肝臟脂肪變性向非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用,不同亞群炎性細胞的浸潤是NAFLD的標志,高脂飲食驅(qū)使M1型巨噬細胞分泌TNF-α誘發(fā)炎癥。

本研究中肝臟組織免疫組化研究顯示,與GFP組比較,過表達PCSK9導(dǎo)致CD68陽性細胞在肝臟組織中更顯著的浸潤,提示NAFLD與巨噬細胞浸潤密切相關(guān)。流式細胞術(shù)研究進一步明確了在CD4+及CD8+亞群中,致炎性細胞因子TNF-α、IL-2在PCSK9組顯著高于GFP組,進一步揭示了過表達PCSK9造成肝臟自身炎性細胞因子浸潤,加速了高脂飲食狀態(tài)下肝細胞脂肪變性的病理進程。然而在NK亞群中,PCSK9組IL-2百分比低于GFP組,分析可能為NK細胞被IL-2刺激增殖后的過渡免疫應(yīng)答效應(yīng),以此通過局部競爭IL-2來抑制CD8+T淋巴細胞增殖,從而限制肝臟免疫病理的進一步惡化[14]。TNF-α在免疫調(diào)節(jié)中啟到雙刃劍作用,一方面,適宜水平的TNF-α可介導(dǎo)正常免疫低于細菌感染、促進組織修復(fù);另一方面,過高的TNF-α水平導(dǎo)致細胞凋亡、誘發(fā)炎性細胞因子風(fēng)暴,而IL-4作為初始的Ⅰ型免疫反應(yīng)后,介導(dǎo)肝臟巨噬細胞活化和增殖以應(yīng)對組織損傷的修復(fù)[15～17]。本研究顯示,與GFP組比較,PCSK9組中CD4亞群中IL-4水平呈升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,推測過表達PCSK9弱化了Ⅰ型免疫介導(dǎo)巨噬細胞的活化,導(dǎo)致IL-4沒有顯著升高來應(yīng)對肝細胞脂肪變性、肝脂質(zhì)的蓄積。

為了排除飲食不均一性對試驗結(jié)果的可能影響,筆者在RAW264.7細胞系中,進一步對可能的潛在機制進行了深入探討。PCSK9介導(dǎo)膽固醇流出蛋白(ABCA1)加速膽固醇代謝紊亂,通過溶酶體途徑結(jié)合細胞膜表面的LDLR受體,跨膜至細胞內(nèi)溶酶體降解,導(dǎo)致LDLR受體顯著降低[18,19]。進一步導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂,激活了循環(huán)系統(tǒng)中單核細胞,并反向募集至肝臟本體,肝臟代謝失衡后脂肪在肝臟蓄積,巨噬細胞(CD68)浸潤,由此上調(diào)了清道夫受體CD36誘導(dǎo)單核-吞噬細胞脂質(zhì)吞噬。Toll樣受體是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子,PCSK9在上游顯著增加了TLR4蛋白水平,繼而激活磷酸化IKB(,上調(diào)NF-κB磷酸化p65蛋白,導(dǎo)致下游炎性細胞反應(yīng)[20,21]。本研究中NF-κB下游系列炎性反應(yīng)由流式細胞術(shù)及ELISA研究證實,肝臟單核細胞內(nèi)致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-2顯著升高,而抗炎性細胞因子IL-4被抑制。

綜上所述,PCSK9誘發(fā)脂質(zhì)代謝失衡并介導(dǎo)清道夫受體CD36表達增加、激活TLR4-IκBα-NF-κB信號通路導(dǎo)致下游促炎性細胞因子顯著增加加速了小鼠肝臟脂肪代謝失衡及肝臟脂肪變性。

本研究存在一定的局限性,應(yīng)用PCSK9抑制劑或單克隆抗體能否逆轉(zhuǎn)肝臟自身炎性細胞因子浸潤,在今后的研究中可在PCSK9基因敲除模型中進一步予以驗證。