響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘆筍花青素和多糖分步提取工藝

胡媛博,楊春

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,山西 晉中 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學山西功能食品研究院,太原 030001)

蘆筍,又稱石刁柏、龍須菜等,為百合科天門冬屬多年生草本植物,被譽為“蔬菜之王”,在世界十大名菜中占有一席之地。紫蘆筍,也稱水果蘆筍,源自美國加利福尼亞,是蘆筍育種家本森在將蘆筍二倍體加倍為四倍體后,從中篩選培育得到的[1]。

與常見的白蘆筍和綠蘆筍相比,其嫩莖通體呈現(xiàn)紫羅蘭色,內(nèi)含大量的花青素。紫蘆筍的植物纖維含量較少,糖酸比較高[2],因此無苦澀味,質(zhì)地細嫩,滋味鮮美,可供生食。以往我國的紫蘆筍生產(chǎn)用種幾乎全部依賴進口,其價格昂貴、品質(zhì)低劣、抗病力差。為推進國內(nèi)紫蘆筍生產(chǎn)的發(fā)展,張元國、羅紹春等選育出濰紫P-7、井崗紅等適合國內(nèi)栽培的紫蘆筍品種。

目前對植物花青素和多糖提取條件的研究大部分是單獨提取[3-7],提取花青素后的植物殘渣被直接丟棄,忽略了另一重要成分多糖。個別研究人員考慮到資源浪費,選擇綜合提取[8-9]或分步提取[10-12]植物中有效生物活性成分,但在花青素和多糖的分步提取研究中,仍專注于研究花青素的提取工藝,未對多糖的提取工藝進行優(yōu)化[13-14]。本研究根據(jù)花青素和多糖理化性質(zhì)的差異,采用超聲波輔助提取法先對紫蘆筍花青素的提取工藝進行優(yōu)化,然后對經(jīng)最優(yōu)條件提取過花青素的紫蘆筍渣進行超聲輔助多糖提取工藝的優(yōu)化。對紫蘆筍花青素和多糖進行分步提取,不僅能為紫蘆筍的綜合利用提供理論與技術(shù)支撐,而且對其今后的深加工技術(shù)研究與開發(fā)也具有重要意義,同時可有效減輕社會環(huán)保壓力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘆筍:由山西農(nóng)業(yè)大學東陽基地提供;無水乙醇、濃鹽酸、氯化鉀、冰醋酸、三水合醋酸鈉、濃硫酸、苯酚、葡萄糖等:均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的前處理

將采好的新鮮紫蘆筍洗凈、切碎,真空冷凍干燥后研磨,過40目篩,置于密封袋中避光保存。

1.3.2 緩沖液配制

配制pH 1.0的KCl-HCl緩沖液和pH 4.5的CH3COONa-HCl緩沖液,具體方法參考文獻[15]。

1.3.3 紫蘆筍花青素的提取方法

準確稱取紫蘆筍凍干粉1.0 g,配制特定體積分數(shù)的乙醇溶液進行實驗,按16∶1的液料比將二者加入50 mL圓底離心管中,置于旋渦振蕩器上充分搖勻,然后調(diào)節(jié)超聲波清洗器內(nèi)水溫至既定溫度,將離心管放入其中輔助提取特定時間,于5 000 r/min的離心機內(nèi)處理20 min后及時取出,濾除紫蘆筍渣,將上清液匯集至錐形瓶中。再反復按以上步驟提取濾渣2次。然后將錐形瓶中收集到的上清液減壓濃縮除去乙醇,于5 000 r/min的離心機內(nèi)處理10 min后得到的上清液即為紫蘆筍花青素提取液。重復3次平行實驗,計算結(jié)果取平均值。

1.3.4 花青素含量的測定

取一定量樣品于10 mL棕色容量瓶中,分別加入pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液定容,4 ℃避光平衡20 min后,以蒸餾水為空白對照,采用分光光度計在510 nm和700 nm波長處完成溶液吸光度的測定,代入下列公式計算[16-17](注:樣品的最佳取用量:在510 nm波長下,稀釋后測定的吸光度在0.2～0.7之間)。

A=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH 4.5。

(1)

(2)

式中:C為花青素含量,mg/L;A為吸光度;ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的吸光系數(shù),26 900 L/(mol·cm);F為稀釋因子;M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量,449.2 g/mol;d為光程,1 cm。

1.3.5 紫蘆筍花青素提取單因素實驗

以紫蘆筍提取液中花青素含量為指標,分別考察乙醇體積分數(shù)(0%、25%、50%、75%、100%)、提取時間(10,20,30,40,50 min)、提取溫度(0,20,40,60,80 ℃)3個因素對紫蘆筍花青素提取的影響。

1.3.6 紫蘆筍花青素提取優(yōu)化實驗

將單因素實驗數(shù)據(jù)作為實驗基礎(chǔ),采用三因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫蘆筍花青素提取工藝,其中花青素含量為響應(yīng)值,乙醇體積分數(shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)3個因素為變量。響應(yīng)面實驗因素及水平見表2。

表2 紫蘆筍花青素提取響應(yīng)面實驗因素及水平

1.3.7 紫蘆筍渣多糖提取方法

準確稱取經(jīng)1.3.6所得最優(yōu)工藝處理后晾干混勻的紫蘆筍渣0.5 g,與蒸餾水按一定的液料比加入50 mL圓底離心管中,置于旋渦振蕩器上充分搖勻,然后調(diào)節(jié)超聲波清洗器內(nèi)水溫至既定溫度,將離心管放入其中輔助提取特定時間,于5 000 r/min的離心機內(nèi)處理20 min后及時取出,濾除雜質(zhì),將上清液匯集至錐形瓶中。再按以上步驟提取濾渣1次。然后將錐形瓶中收集到的上清液減壓濃縮,加入4倍無水乙醇左右搖勻,于常溫狀態(tài)下(25 ℃)靜置一夜(12 h),抽濾,加少量無水乙醇充分洗泡,將粗多糖烘干(70 ℃,7 h)稱重。重復3次平行實驗,計算結(jié)果取平均值。

1.3.8 多糖含量的測定

1.3.8.1 葡萄糖標準曲線的繪制

取6根20 mL具塞試管,并將其依次編號為0～5,將配制好的100 mg/L葡萄糖標準工作溶液按照0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL的順序依次加入具塞試管內(nèi),取蒸餾水稀釋定容至1.0 mL。在每個試管中加入1.0 mL 濃度為5%的苯酚溶液,然后將5.0 mL濃硫酸迅速注入各個試管內(nèi)(移液管與試管內(nèi)液面應(yīng)保持垂直狀態(tài),且不可與試管壁發(fā)生碰觸,以確保反應(yīng)充分,同時注意反應(yīng)液噴濺),靜置10 min后,將試管依次置于旋渦振蕩器上充分搖勻,然后將試管放置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min,待降溫后取出,采用分光光度計在490 nm處完成0～5號試管溶液吸光度的測定。重復3次平行實驗,計算結(jié)果取平均值。選取葡萄糖標準液濃度(μg/mL)和吸光度(A490 nm)作為橫、縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線,完成相應(yīng)的線性回歸,見圖1。得到回歸方程:y=0.003 5x+0.136 3,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.8.2 多糖得率的計算

稱取樣品粗多糖0.010 0 g,用蒸餾水定容至10 mL,取0.5 mL稀釋20倍,取稀釋液1.0 mL于20 mL具塞試管中。按照標準曲線操作步驟,測定吸光度。根據(jù)標準曲線方程計算多糖含量,多糖得率按照公式(3)計算:

(3)

式中:X為樣品多糖得率,%;m為樣品質(zhì)量,g;m1為提取得到粗多糖的質(zhì)量,g;m2為在標準曲線上查到測定液的含糖量,μg;m3為測定液中粗多糖的質(zhì)量,g;V1為樣品定容體積,mL;V2為測定時所用樣品測定液的體積,mL;0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.9 紫蘆筍渣多糖提取單因素實驗

以紫蘆筍渣中提取到的多糖得率為指標,分別考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1,mL/g)、提取時間(10,20,30,40,50 min)、提取溫度(20,40,60,80,100 ℃)3個因素對紫蘆筍渣多糖提取的影響。

1.3.10 紫蘆筍渣多糖提取優(yōu)化實驗

將單因素實驗結(jié)果數(shù)據(jù)作為實驗基礎(chǔ),采用三因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫蘆筍渣多糖提取工藝,其中多糖得率為響應(yīng)值,液料比(A′)、提取時間(B)、提取溫度(C)3個因素為變量。響應(yīng)面實驗因素及水平見表3。

表3 紫蘆筍渣多糖提取響應(yīng)面實驗因素及水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 28.0軟件對單因素實驗的數(shù)據(jù)進行分析,采用OriginPro 2021軟件進行數(shù)據(jù)制圖,采用Design Expert 10.0軟件進行響應(yīng)面實驗的優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘆筍花青素提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗

由圖2可知,提取液中花青素含量隨乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度的增加呈現(xiàn)出相同的趨勢,均為先升高至頂點后降低。

圖2 不同乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度對紫蘆筍花青素提取效果的影響

由圖2中A可知,當乙醇體積分數(shù)為75%時,提取液中的花青素含量達到最高值(42.415 2±0.650 3) mg/L,且與其他乙醇體積分數(shù)所提取的花青素含量有顯著差異。因此,最適宜用于提取花青素的溶劑為體積分數(shù)75%的乙醇溶液。

由圖2中B可知,在提取時間為40 min時花青素含量達到最高值(54.354 9±0.532 4) mg/L,由于花青素中所含的羥基易被氧化分解,所以40 min是紫蘆筍花青素的最高提取時限。因此,最適宜的提取時間為 40 min。

由圖2中C可知,當提取溫度在0～40 ℃之間時,有效成分的擴散速度隨著溫度的升高逐漸加快,因此提取液中花青素含量隨著溫度的升高呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢。但由于花青素對熱敏感,當提取溫度繼續(xù)上升至50 ℃時,提取液中花青素含量呈現(xiàn)下降趨勢,其主要原因是花青素的結(jié)構(gòu)被較高的溫度所破壞[18],進而影響提取液中花青素的含量。因此,選取40 ℃為最適宜的提取溫度。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.1.2.1 模型擬合

為選取紫蘆筍花青素提取的最優(yōu)工藝,選用中心組合Box-Behnken實驗設(shè)計,結(jié)合單因素實驗數(shù)據(jù),關(guān)注提取液中花青素含量,對乙醇體積分數(shù)、提取時間和提取溫度3個實驗因素開展優(yōu)化,共包括17組實驗,其中5組(13～17號)為用于估計實驗誤差的重復實驗,是響應(yīng)面實驗的零點,即區(qū)域中心點,其余12組實驗為響應(yīng)面實驗的析因點。響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4。

表4 紫蘆筍花青素提取響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

經(jīng)Design-Expert 10.0軟件ANOVA法分析響應(yīng)面二次多項式模型的顯著性。實驗方差分析結(jié)果見表5。

表5 紫蘆筍花青素提取回歸模型方差分析

由表5可知,顯著性檢驗中,回歸模型的P<0.000 1為極顯著,失擬項的P=0.121 2>0.05為不顯著,說明提取液中的花青素含量與各因素的回歸模型有統(tǒng)計學意義。3個因素中乙醇體積分數(shù)對紫蘆筍花青素提取工藝的影響最小。通過多元擬合所得到的回歸方程為花青素含量=+54.688 8+0.881 9A+1.452 4B-2.637 0C-0.041 7AB-0.052 2AC-3.051 0BC-9.087 0A2-3.833 8B2-7.330 1C2,且模型線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.989 7,校正決定系數(shù)(RAdj2)為0.976 4,預測相關(guān)系數(shù)(RPred2)為0.874 8,變異系數(shù)(C.V.)為2.44%,表明該模型具有較高的擬合度,可較好地預測實驗結(jié)果,可信度較高,可以用于優(yōu)化紫蘆筍花青素提取的實驗設(shè)計。

2.1.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化驗證

為體現(xiàn)不同因素間兩兩交互作用,按照回歸模型所作圖見圖3。3個響應(yīng)面3D圖形均是開口向下、中間高四周低的凸形光滑曲面,曲線梯度越大,表示該因素的影響越明顯,等高線圖的橢圓率越大,表示交互影響作用越明顯。由此分析可知,提取溫度對花青素提取的影響最突出,而提取溫度與提取時間的交互作用最強,與方差分析的結(jié)論一致。根據(jù)上述響應(yīng)面設(shè)計實驗分析,確定紫蘆筍花青素提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)75.485%、提取時間42.850 min、提取溫度37.605 ℃,預測提取液中花青素最高含量為55.232 mg/L。在進行實際操作時考慮到實驗的切實性,故將理論工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分數(shù)75%、提取時間43 min、提取溫度38 ℃,提取得到的花青素含量平均值為55.438 9 mg/L。實際實驗值同響應(yīng)面模型預測值存在偏差,但相差不大,排除實驗過程中可能出現(xiàn)的誤差情況,證明經(jīng)響應(yīng)面分析得到的回歸方程合理且可靠。

圖3 紫蘆筍花青素提取不同因素交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

2.2 紫蘆筍渣多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

由圖4中A可知,多糖得率隨著液料比的增大逐漸升高,在液料比達到40∶1 (mL/g)后趨于平穩(wěn),這可能是因為當液料比較低時,溶液黏稠、難以混勻,不利于樣品中多糖的溶出,隨著液料比的加大,多糖不斷溶入提取液中,但紫蘆筍中多糖含量有限,當液料比達到 40∶1 (mL/g)時樣品中的多糖已完全溶出,繼續(xù)增大液料比,多糖得率變化不顯著。因此綜合考慮,40∶1 (mL/g)可作為提取紫蘆筍渣的最佳液料比。

圖4 不同液料比、提取時間、提取溫度對紫蘆筍渣多糖提取效果的影響

由圖4中B可知,隨著提取時間的延長,多糖的得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在20 min時達到最高值。分析原因是當提取時間過短時,紫蘆筍渣多糖還未完全溶出,使得提取不充分;由于多糖提取實驗前期已對紫蘆筍凍干粉進行了超聲輔助提取花青素,當提取時間過長時,過度的機械剪切作用也會使多糖的分子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂,致使多糖得率下降[19-21]。因此,最適宜的提取時間為 20 min。

由圖4中C可知,溫度越高,多糖提取得率越大。這是由于高溫增加了分子的運動速率,加速了紫蘆筍渣內(nèi)部多糖分子的溶出,升溫至100 ℃時多糖的提取效果最好,但由于80 ℃與100 ℃時的多糖得率相比無顯著性差異,出于節(jié)約能源、操作方便等多角度綜合考量,選擇80 ℃為最佳提取溫度。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.2.1 模型擬合

為選取紫蘆筍渣多糖提取最優(yōu)工藝,選用中心組合Box-Behnken實驗設(shè)計,結(jié)合單因素實驗數(shù)據(jù)結(jié)果,關(guān)注提取多糖得率,對液料比、提取時間和提取溫度3個實驗因素開展優(yōu)化,共包括17組實驗,其中5組(13～17號)為用于估計實驗誤差的重復實驗,是響應(yīng)面實驗的零點,即區(qū)域中心點,其余12組實驗為響應(yīng)面實驗的析因點。響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表6。

表6 紫蘆筍渣多糖提取響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

經(jīng)Design-Expert 10.0軟件ANOVA法分析響應(yīng)面二次多項式模型的顯著性。實驗方差分析結(jié)果見表7。

表7 紫蘆筍渣多糖提取回歸模型方差分析

由表7可知,顯著性檢驗中,回歸模型的P<0.000 1為極顯著,失擬項的P=0.104 4>0.05為不顯著,說明多糖得率與各因素的回歸模型有統(tǒng)計學意義。3個因素中提取時間對紫蘆筍渣多糖提取工藝的影響最小。通過多元擬合所得到的回歸方程為多糖得率=1.29+0.056A′+0.024B+0.044C-0.019A′B+9.525E-3A′C-7.55E-3BC-0.11A′2-0.042B2+0.014C2,且模型線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.989 1,校正決定系數(shù)(RAdj2)為0.975 1,預測相關(guān)系數(shù)(RPred2)為0.864 6,變異系數(shù)(C.V.)為1.06%,表明該模型擬合程度高,可較好地預測實驗結(jié)果,可信度較高,可以用于優(yōu)化紫蘆筍渣多糖提取的實驗設(shè)計。

2.2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化驗證

為體現(xiàn)不同因素間兩兩交互作用,按照回歸模型所作圖見圖5。3個響應(yīng)面3D圖形均是開口向下的平滑曲面,曲線梯度越大,表示該因素的影響越明顯,等高線圖的橢圓率越大,表示交互作用影響越明顯。由此分析可知,相較于液料比和提取時間,提取溫度對多糖提取的影響更明顯,而對多糖得率有強交互影響的是液料比與提取時間,與方差分析的結(jié)論一致。根據(jù)上述響應(yīng)面設(shè)計實驗分析,確定紫蘆筍渣多糖提取的最佳工藝條件為液料比41.49∶1 (mL/g)、提取時間25.77 min、提取溫度86.40 ℃,預測多糖得率最高為1.339 8%。在進行實際操作時考慮到實驗的切實性,故將理論工藝參數(shù)調(diào)整為液料比41∶1 (mL/g)、提取時間26 min、提取溫度86 ℃,提取得到的多糖得率為1.321 5%。實際實驗值同響應(yīng)面預測值存在偏差,但相差不大,排除實驗過程中可能出現(xiàn)的誤差情況,證明經(jīng)響應(yīng)面分析得到的回歸方程合理且可靠。

圖5 紫蘆筍渣多糖提取不同因素交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖

3 結(jié)論

本實驗根據(jù)花青素和多糖的溶解性不同,利用超聲波輔助法結(jié)合單因素實驗與響應(yīng)面設(shè)計,對紫蘆筍花青素和多糖進行分步提取工藝研究,并按照pH示差法、苯酚-硫酸法分別測定提取得到的花青素和多糖含量。最終優(yōu)化后的工藝條件為乙醇體積分數(shù)75%、提取時間43 min、提取溫度38 ℃,花青素含量為55.438 9 mg/L,將提取花青素后的紫蘆筍渣自然揮干后,再按液料比41∶1 (mL/g)加入蒸餾水、提取時間26 min、提取溫度86 ℃,多糖得率為1.321 5%。為超聲波輔助法分步提取紫蘆筍花青素和多糖的研究提供了一定的理論支撐,提高了紫蘆筍的綜合利用率,也為其他植物的分步提取提供了理論參考。