L-酪氨酸高密度流加發(fā)酵工藝研究

龔雨,馬零,趙春光,徐慶陽,3,4*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457;2.寧夏伊品生物科技股份有限公司,銀川750100;3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;4.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

fermentation

L-酪氨酸(L-tyrosine,L-Tyr)是一種芳香族氨基酸[1],是人體必需氨基酸之一,對(duì)人體和動(dòng)物的生長代謝都具有重要作用,有著廣泛的市場(chǎng)需求[2],在食品行業(yè)中,因其具有極高的營養(yǎng)價(jià)值,被用作氨基酸類營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加到食品中[3],L-酪氨酸及其衍生物還是許多保健品的重要成分[4];在醫(yī)藥方面,L-酪氨酸的衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥載體,比如多巴胺是抗氧化藥物合成的前體物質(zhì),用于多種類型休克藥物的合成研究[5],L-酪氨酸亞硫酸鹽合成的藥物能治療無力綜合征、精神分裂癥等疾病;在化工方面,能夠降低黑色素的合成[6],是天然美白化妝品的合成原料。

當(dāng)前L-酪氨酸生產(chǎn)主要以微生物發(fā)酵法為主,該方法具有成本低、無污染等生產(chǎn)優(yōu)勢(shì),但其大量生產(chǎn)仍面臨著巨大挑戰(zhàn)[7]。在微生物大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中,菌體密度在一定程度上決定了目標(biāo)產(chǎn)物的生成量[8],因此高密度培養(yǎng)無疑是提高產(chǎn)量的重要途徑之一,其中培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件的控制等是至關(guān)重要的影響因素[9]。在大腸桿菌代謝途徑中L-酪氨酸合成的前體是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤蘚糖[8],磷酸烯醇式丙酮酸還是芳香族氨基酸合成的前體物質(zhì)[10-11],Mg2+是糖酵解途徑中的能量傳遞者NADH合成過程的輔因子,是其合成的激活劑[12]。維生素H可以促進(jìn)菌體生長,但過量會(huì)造成菌體生長過快進(jìn)入衰亡期,過少又會(huì)導(dǎo)致生長過慢的問題[13];磷酸二氫大腸桿菌合成細(xì)胞膜磷脂提供了主要成分磷,還參與了大腸桿菌的生長代謝,控制其生長速率[14-15],直接影響了大腸桿菌的生長密度和重組蛋白的表達(dá)量[12],磷酸吡哆醛(PLP)廣泛存在于細(xì)胞中,參與了脫羧反應(yīng)、氨基轉(zhuǎn)移、消除反應(yīng)[16];在代謝過程中,維生素B12是許多酶的輔酶,參與了甲基化和化合物異構(gòu)作用,對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞的生長也有著重要作用[17];甲硫氨酸能增大蛋白的可溶性表達(dá)量,減少包涵體蛋白的形成,使后續(xù)純化工藝更簡便[18];谷氨酰胺在細(xì)胞中充當(dāng)?shù)妮d體,還作為蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)物,對(duì)細(xì)胞的生長具有重要作用[19]。

為促進(jìn)高密度發(fā)酵過程中微生物細(xì)胞更好地生長,避免營養(yǎng)不足或浪費(fèi)等問題,本研究對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵過程中的生長因子進(jìn)行優(yōu)化,并且設(shè)計(jì)了3種不同的底物添加方式進(jìn)行上罐生產(chǎn),大幅度提高了菌體最高密度及L-酪氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)的供試菌株為大腸桿菌 TYR-05,保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L,酵母粉6 g/L,檸檬酸1 g/L,(NH4)2SO4·7H2O 2.4 mg/L,MgSO4·7H2O 0.4 g/L,谷氨酸 0.6 g/L,蛋氨酸0.5 g/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L,酵母粉4.5 g/L,檸檬酸1.5 g/L,(NH4)2SO4·7H2O 2.8 mg/L,維生素H 0～2 mg/L;MgSO4·7H2O 0～3 g/L,KH2PO40～3 g/L;PLP 0～3 mg/L;維生素B120～3 mg/L。

1.3 儀器與設(shè)備

Biotech-15JS-3發(fā)酵罐 上海保興生物工程設(shè)備有限公司;Aglient 1290高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司;SBA-40D生物傳感分析儀 山東佰森泰克儀器有限公司;752PC紫外可見分光光度計(jì) 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.4 培養(yǎng)方案

1.4.1 菌種活化

于-80 ℃冰箱中取出甘油管,使用接種環(huán)蘸取4環(huán)菌液涂抹于一代斜面上,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,第2天再從一代斜面接種到二代斜面,繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)10～12 h。

1.4.2 搖瓶培養(yǎng)

以培養(yǎng)基總體積的10%為接種量置于搖瓶中,調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2,溫度37 ℃,220 r/min培養(yǎng)45 h(2%苯酚紅作為指示劑,補(bǔ)加氨水調(diào)節(jié)pH)。

1.4.3 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

1.4.3.1 發(fā)酵菌種活化

于-80 ℃冰箱中取出甘油管,使用接種環(huán)蘸取4環(huán)菌液涂抹于一代斜面上,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,第2天再從一代斜面接種到二代斜面,繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)10～12 h。

1.4.3.2 發(fā)酵罐種子培養(yǎng)

使用200 mL無菌水在超凈臺(tái)火焰旁洗脫茄形瓶中的菌體,在火焰旁從發(fā)酵罐進(jìn)料口倒入種子培養(yǎng)基中。發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐參數(shù)將溫度控制在37 ℃,pH控制在7.0～7.2,溶氧控制在45%～55%,生物量>18時(shí)接入發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 生長因子添加量優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

在保證培養(yǎng)基等其他條件不變的前提下,按照表1中7種不同種類的生長因子,設(shè)計(jì)5組不同濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

表1 生長因子單因素實(shí)驗(yàn)批次及添加量

1.5.2 正交實(shí)驗(yàn)確定生長因子的最適添加量

在實(shí)驗(yàn)2.1和2.2的基礎(chǔ)上,綜合菌體密度和產(chǎn)量考慮,各生長因子的影響順序?yàn)镵H2PO4添加量>維生素H添加量>MgSO4·7H2O添加量>維生素B12添加量>PLP添加量,其中甲硫氨酸和谷氨酰胺的影響非常小。因此本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以KH2PO4添加量(A)、PLP添加量(B)、維生素B12添加量(C)、維生素H添加量(D)和MgSO4·7H2O添加量(E)為研究對(duì)象,以菌體密度、L-酪氨酸產(chǎn)量為指標(biāo),進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析,正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.5.3 生長因子添加方式的測(cè)定

由2.4可知,在優(yōu)化添加量的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種生長因子添加方式,即一次性添加(a)、分時(shí)間段(10,15,20,25 h)添加(b)和10 h后持續(xù)流加(c)。3種添加方式添加總量一致 。

2 結(jié)果分析

2.1 生長因子添加種類及添加量對(duì)菌體密度的影響

由圖1可知,不同生長因子對(duì)菌體生長有較大影響,其中KH2PO4和維生素H對(duì)菌體密度的影響較大,當(dāng)KH2PO4添加量為2.5 g/L時(shí),菌體密度值達(dá)到34.1 g/L,當(dāng)維生素H添加量為1.0 mg/L時(shí),菌體密度最高,為30.2 g/L;二者差距較小,并且均高于其他5種生長因子對(duì)應(yīng)的菌體密度。菌體的生長及基因的表達(dá)很大程度上取決于磷酸鹽的含量[20],細(xì)胞中磷酸鹽的含量對(duì)大腸桿菌中質(zhì)粒表達(dá)及復(fù)制的速率有一定影響,因而決定了菌體的蛋白表達(dá)量[9];磷酸鹽是大腸桿菌合成細(xì)胞膜磷脂的主要成分,對(duì)菌體的生長有很大影響;它對(duì)代謝流分布有主要影響,控制著EMP途徑中L-酪氨酸合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)和E4P(4-磷酸赤蘚糖)以及PRPP(磷酸核糖焦磷酸)是L-酪氨酸的合成原料[21],決定了EMP途徑的碳流量,因此磷元素是大腸桿菌生產(chǎn)L-酪氨酸不可或缺的成分之一,當(dāng)過量添加時(shí),會(huì)使代謝流中前體物的供給達(dá)到一種失衡的狀態(tài),無法達(dá)到平衡點(diǎn),進(jìn)而使菌體密度降低[21];生物素參與了脂肪酸生物合成、氨基酸代謝和糖異生三大代謝過程[12],參與了脫羧、羧化、脫氫化等反應(yīng)[12],是乙酰CoA羧化酶等的輔酶,還參與了CO2的固定作用,因此隨著添加量的增加,菌體密度逐漸變大,但當(dāng)菌體密度達(dá)到最高值30.2 g/L后呈下降趨勢(shì),分析得到添加量過高會(huì)導(dǎo)致菌體代謝過快而過早衰老,進(jìn)而導(dǎo)致菌體密度下降。

圖1 單一生長因子對(duì)菌體密度的影響

2.2 生長因子添加種類及添加量對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

由圖2可知,7種生長因子對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量有顯著的影響。其中維生素B12、MgSO4·7H2O和PLP的影響較大,Mg2+是EMP途徑中關(guān)鍵酶的輔酶,還參與了甘油酸-3-磷酸和甘油酸-2-磷酸之間磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移過程[22],為原料磷酸烯醇式丙酮酸的生成打下了基礎(chǔ);磷酸吡哆醛促進(jìn)了谷氨酸向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化[22],而L-酪氨酸是由前體物質(zhì)HPP(對(duì)羥基苯丙酮酸)與谷氨酸的轉(zhuǎn)氨作用生成的,PLP為其生產(chǎn)提供了動(dòng)力[23];維生素B12存在兩種活化形式,不僅參與了核苷酸與脫氧核苷酸的相互轉(zhuǎn)化,還參與了甲基的轉(zhuǎn)移[22];當(dāng)谷氨酰胺的添加量≤2 g/L時(shí),L-酪氨酸的產(chǎn)量與谷氨酰胺的添加量呈正相關(guān),當(dāng)谷氨酰胺添加量為2 g/L時(shí),L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到11.20 g/L,當(dāng)谷氨酰胺添加量>2 g/L時(shí),L-酪氨酸產(chǎn)量呈下降趨勢(shì),維生素H的效果類似;隨著KH2PO4添加量的增加,L-酪氨酸產(chǎn)量一直增大,并未像菌體密度呈先增后減的趨勢(shì),分析出KH2PO4對(duì)產(chǎn)量只呈促進(jìn)作用,甲硫氨酸的效果類似,分析原因?yàn)榧琢虬彼崮軠p少包涵體的生成,提升質(zhì)粒的表達(dá)效果[18]。

圖2 單一生長因子對(duì) L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

2.3 正交分析探究關(guān)鍵元素的最適用量

實(shí)驗(yàn)得出KH2PO4、維生素H、MgSO4·7H2O、維生素B12、PLP對(duì) L-酪氨酸發(fā)酵過程產(chǎn)生了較大影響,因此繼續(xù)優(yōu)化5種物質(zhì)的用量。

由表3中極差值的大小可以得出影響L-酪氨酸生物量的5個(gè)因素依次為A>D=E>C>B;通過比較5個(gè)因素的4個(gè)均值,即最大均值對(duì)應(yīng)最適添加量,得到KH2PO4的最適添加量為2.5 g/L;維生素H的最適添加量為1.0 mg/L;MgSO4·7H2O的最適添加量為2.0 g/L;PLP的最適添加量為1.0 mg/L;維生素B12的最適添加量為2.0 mg/L。

表3 L-酪氨酸生物量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4中極差值的大小可以得出影響L-酪氨酸產(chǎn)量的5個(gè)因素依次為B>C>A>D=E;通過比較5個(gè)因素的4個(gè)均值,即最大均值對(duì)應(yīng)最適添加量,得到KH2PO4的最適添加量為2.4 g/L;維生素H的最適添加量為0.8 mg/L;MgSO4·7H2O的最適添加量為1.5 g/L;PLP的最適添加量為1.8 mg/L;維生素B12的最適添加量為2.0 mg/L。

綜合來看,維生素H和MgSO4·7H2O的添加量對(duì)產(chǎn)量的影響較大,其他3個(gè)因素對(duì)生物量的影響較大,因此確定維生素H的最適添加量為0.8 mg/L;MgSO4·7H2O的最適添加量為2.0 g/L;KH2PO4的最適添加量為2.5 g/L;PLP的最適添加量為1.0 mg/L;維生素B12的最適添加量為2.0 mg/L。

2.4 5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證

前期實(shí)驗(yàn)以L-酪氨酸的菌體密度和產(chǎn)量為指標(biāo),探究了7個(gè)生長因子對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響,最后確定了效果較好的5個(gè)生長因子的添加量,并通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)添加量進(jìn)行了篩選優(yōu)化。但搖瓶實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性,導(dǎo)致菌體的生長潛力大大受限,因此在其他培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件一致的條件下,進(jìn)行5 L發(fā)酵罐對(duì)比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),以不添加生長因子的培養(yǎng)基作為對(duì)照組,以KH2PO4、維生素H、MgSO4·7H2O、維生素B12、PLP分別添加2.5 g/L、0.8 mg/L、2.0 g/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)一步探究生長因子及添加量的優(yōu)化效果。

由圖3可知,優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)組的菌體密度和L-酪氨酸產(chǎn)量在發(fā)酵期間始終高于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組最大菌體密度為63.2 g/L,高于對(duì)照組的菌體密度56.7 g/L,發(fā)酵過程中菌體密度一直處于上升趨勢(shì),但發(fā)酵后期菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期,所以增長較慢,趨于穩(wěn)定。當(dāng)不添加生長因子時(shí),L-酪氨酸產(chǎn)量明顯偏低,增長趨勢(shì)較平穩(wěn),且最終產(chǎn)量為49.8 g/L。發(fā)酵中期(20～36 h)是L-酪氨酸積累速率最大的時(shí)期,且與菌體密度增長趨勢(shì)相近,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到36 h之后,L-酪氨酸積累較緩慢,最后44 h下罐時(shí)L-酪氨酸產(chǎn)量為53.1 g/L,較對(duì)照組提高了6.6%。

圖3 菌體密度與產(chǎn)量的對(duì)比

2.5 不同生長因子添加方式對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程前期,菌體密度可通過發(fā)酵條件進(jìn)行控制,進(jìn)而縮短發(fā)酵周期,若生長因子添加時(shí)間過晚,會(huì)造成營養(yǎng)不足,導(dǎo)致菌體生長緩慢,發(fā)酵產(chǎn)酸水平較低,最后導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此,生長因子的添加方式對(duì)L-酪氨酸生物量及產(chǎn)量也具有一定影響。適合的添加方式對(duì)L-酪氨酸發(fā)酵至關(guān)重要。

2.5.1 不同添加方式對(duì)產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可知,發(fā)酵過程中具體時(shí)間監(jiān)測(cè)到的糖酸轉(zhuǎn)化率為實(shí)時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率,因此能夠通過數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的轉(zhuǎn)化率的變化曲線得出發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率最高的時(shí)期,如果設(shè)法延長這一時(shí)期,那么L-酪氨酸產(chǎn)量將會(huì)大大提高。a添加方式為一次性添加全部生長因子,因此發(fā)酵前期營養(yǎng)豐富,菌體能充分利用營養(yǎng)物質(zhì)加速地進(jìn)行菌體生長及L-酪氨酸的合成,糖酸轉(zhuǎn)化率也較高,菌體生長前期8 h時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率最高,8～20 h時(shí)菌體產(chǎn)酸速率逐漸降低,20～30 h產(chǎn)酸速率呈上升趨勢(shì),30 h之后產(chǎn)酸速率較低,分析可能是生長因子前期利用充足但中后期供應(yīng)不夠,不足以維持菌體正常的生長。添加方式b為分時(shí)間段(10,15,20,25 h)添加生長因子,可明顯看出前期0～10 h未添加生長因子時(shí)期L-酪氨酸產(chǎn)率較低,而添加生長因子的10～30 h內(nèi)菌體大量生產(chǎn)L-酪氨酸,30 h后產(chǎn)酸率大大下降,最終L-酪氨酸產(chǎn)量為50.3 g/L,分析原因?yàn)榍捌诰w生長時(shí)期營養(yǎng)物質(zhì)不足,導(dǎo)致菌體生長受到抑制,進(jìn)而無法較好地進(jìn)行L-酪氨酸生產(chǎn),中期添加生長因子后這一問題有所緩解但最終產(chǎn)量低于a添加方式。添加方式c為發(fā)酵8 h后持續(xù)流加,能夠看出前期菌體生長速率較快,8 h時(shí)出現(xiàn)第一次轉(zhuǎn)化率高峰,分析原因是前期營養(yǎng)物質(zhì)較充足,8～35 h生產(chǎn)較穩(wěn)定,36 h后糖酸轉(zhuǎn)化率再次達(dá)到高峰,糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到一個(gè)較平穩(wěn)的水平,最終產(chǎn)量為56.1 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到23.2%,分析可得整個(gè)發(fā)酵過程中生長因子都處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平,使菌體較好地吸收生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì),因此使L-酪氨酸發(fā)酵水平達(dá)到最高,較其他兩種添加方式有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖4 不同添加方式對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量及實(shí)時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

2.5.2 不同添加方式對(duì)生物量和耗糖速率的影響

由圖5可知,菌體密度和耗糖速率由大到小的順序都為c>b>a,c組最大菌體密度為65.0 g/L,c組在24 h時(shí)耗糖速率最大,為12.3 g/(h·L),而a組和b組最大耗糖速率出現(xiàn)在16 h,分別為10.1,11.2 g/(h·L),較c組早出現(xiàn)了4 h,并且可明顯看出c組在36 h之后菌體密度開始緩慢增長,而a組和b組在28 h之后菌體密度便開始出現(xiàn)緩慢增長的趨勢(shì),菌體活性明顯下降,最終a組和b組的菌體密度分別為53.1,56.0 g/L,遠(yuǎn)低于c組,因此添加方式c明顯優(yōu)于另外兩種添加方式。

圖6 不同添加方式對(duì)代謝副產(chǎn)物的影響

2.5.3 不同添加方式對(duì)副產(chǎn)物的影響

重組大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中,很容易出現(xiàn)代謝副產(chǎn)物,其中乙酸最常見,它對(duì)蛋白的表達(dá)影響較大,研究表明,當(dāng)菌體的生長速率達(dá)到一定值時(shí),菌體密度達(dá)到最大值后攝氧能力不再繼續(xù)增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致乙酸的生成[24],方式b乙酸最終含量為1.9 g/L,分別比方式a和方式c增加了18.7%和60%,分析方式b會(huì)造成菌體過快衰老,菌體攝氧不足導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸含量較高,還會(huì)造成原料的浪費(fèi)。限制比生長速率是減少乙酸生成的方法之一。綜合來看,方式c中副產(chǎn)物組氨酸(His)等均少于另外兩種添加方式,因此方式c有較大優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件控制是大腸桿菌高密度發(fā)酵的兩個(gè)關(guān)鍵因素,實(shí)驗(yàn)中選用5個(gè)生長因子并對(duì)其添加量及添加方式進(jìn)行了探索,實(shí)驗(yàn)表明5個(gè)生長因子的最優(yōu)添加量為維生素H 0.8 mg/L,MgSO4·7H2O 2.0 g/L,KH2PO42.5 g/L,PLP 1.0 mg/L,維生素 B122.0 mg/L,最優(yōu)添加策略為10 h開始持續(xù)流加。最終L-酪氨酸產(chǎn)量為56.2 g/L,最高菌體密度為65.0 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為23.1%,副產(chǎn)物乙酸積累量減少到1.0 g/L,證明了生長因子的添加使菌體活性大大增強(qiáng),強(qiáng)化了L-酪氨酸生產(chǎn)的通路代謝,L-酪氨酸產(chǎn)量明顯提高,使大腸桿菌生產(chǎn)L-酪氨酸的高密度培養(yǎng)達(dá)到一個(gè)較高的水平,也為L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中各種生長因子的調(diào)控提供了依據(jù)[25]。