紫蘇粕抗氧化活性肽的制備及其糖基化修飾的研究

閔玉濤,郇含含,宋彥顯

(鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院,鄭州 450044)

紫蘇是唇形科藥食同源植物,有特異的香味,可去腥、增鮮和提味,是我國歷史悠久的調(diào)味植物香料之一。紫蘇葉、莖和籽均可入食,制備的食品種類多樣,如粥、醬、茶、食用油、糕點、飲料等,深受大眾喜愛。同時,紫蘇含有黃酮、多糖、多酚、植物甾醇、生育酚、酚醇、ε-3脂肪酸和α-亞麻酸等生物活性物質(zhì),具有抗氧化、抗衰老、抗過敏、抑菌、抗疲勞、降血糖、消炎等生物活性[1-5]。因紫蘇具有豐富的營養(yǎng)、多種生物活性和特異香味,近年來,紫蘇基食品及調(diào)味品的開發(fā)備受關(guān)注,吳文龍等[6]制備了具有特殊風(fēng)味的紫蘇復(fù)合調(diào)味醬;田海娟等[7]采用混菌發(fā)酵制備了紫蘇面包;苑廣志[8]研制了紫蘇香菇風(fēng)味米腸;吳天樂等[9]研究發(fā)現(xiàn),紫蘇能夠?qū)︳~腥味起到有效的抑制和消除作用,可提高魚湯的品質(zhì)。紫蘇粕是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物,其香味突出,適口性強,但長期以來被用作動物的飼料或農(nóng)肥,造成資源浪費和環(huán)境污染。有關(guān)研究顯示,紫蘇粕中的蛋白含量可達32.33%,含有18種氨基酸,是非常好的植物蛋白資源,在蛋白食品及調(diào)味品的功能開發(fā)方面具有較高的應(yīng)用前景[10-12]。

抗氧化活性肽具有來源廣泛、結(jié)構(gòu)簡單、安全可靠、抗氧化能力強等優(yōu)點,但因其來源蛋白結(jié)構(gòu)限制、存在空間位阻等原因,存在抗氧化活性有限、半衰期短等問題。多肽糖基化修飾又稱美拉德反應(yīng),是在高溫體系中糖與蛋白發(fā)生的一種非酶褐變反應(yīng),可以提高多肽的抗氧化活性,甚至能媲美常見的化學(xué)抗氧化劑。Zhang等[13]制備糖基化乳清肽,Kang等[14]制備糖基化林蛙碎片膠原肽,Feng等[15]制備玉米肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,Nie等[16]制備雞骨水解蛋白肽與乳糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,林巍等[17]研究蕓豆蛋白多肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性。上述研究均表明,抗氧化活性肽經(jīng)美拉德反應(yīng)進行糖基化修飾后,抗氧化活性明顯提高。

目前,紫蘇粕的研究主要集中在紫蘇分離蛋白的提取制備、紫蘇蛋白功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及紫蘇蛋白水解物的呈味、抗菌性和抗氧化活性方面。范三紅等[18]研究了不同提取方法對紫蘇籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響。田海娟等[19]采用混菌發(fā)酵紫蘇粕小肽,測定其抗氧化能力。李榮等[20]采用微波輔助分步酶解法制備紫蘇餅粕蛋白鮮味肽,鮮味改善明顯。紫蘇蛋白及其水解物糖基化分子修飾產(chǎn)物的抗氧化性、鮮味改善性能尚未見報道。本文通過酶解紫蘇蛋白制備抗氧化多肽,美拉德反應(yīng)進行糖基化修飾,提高其抗氧化活性,延長紫蘇加工產(chǎn)業(yè)鏈,提高其附加值,為天然抗氧化生物活性肽、功能性食品和蛋白調(diào)味肽等的開發(fā)利用提供了參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫蘇粕(蛋白含量25%):天津?qū)毷靠萍加邢薰尽?/p>

1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、葡萄糖:北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶:合肥巴斯夫生物科技有限公司;福林試劑:福州飛凈生物科技有限公司;酪蛋白、氫氧化鈉、鹽酸:天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;D-木糖:上?；菖d生化試劑有限公司;D-果糖、三氯乙酸:天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市正基儀器有限公司;80-3大容量離心機 江蘇金壇市中大儀器廠;UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;FA2204B電子天平 上海精科天美儀器有限公司;LGJ-10C冷凍干燥機 四環(huán)科儀科技發(fā)展河北有限責(zé)任公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機 鹽城市安信實驗儀器有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 紫蘇粕蛋白的提取

將紫蘇粕高速粉碎成粉末,過50目篩,取250 g紫蘇粉末加入適量石油醚,混勻,脫脂24 h,去除上層石油醚,將下層紫蘇粉中石油醚充分揮發(fā)至干燥,即得干燥的脫脂紫蘇粉末。

稱取脫脂后的紫蘇粉100 g于燒杯中,按料液比1∶12加入相應(yīng)量的蒸餾水,攪拌均勻后用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0,在50 ℃水浴鍋中攪拌40 min,冷卻至室溫后以6 000 r/min離心20 min,取上清液備用。用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.4(等電點),使紫蘇蛋白沉淀,再次離心,取下層沉淀冷凍干燥后置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 蛋白酶活力的測定

參照國標(biāo)GB/T 23527-2009蛋白酶活力測定的方法[21]測定堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶活力。

1.4.3 DPPH自由基清除率的測定

參照Zhang等[22]的測定方法并略作調(diào)整,取稀釋后的樣品溶液2 mL于燒杯中,加入200 μmol/L DPPH溶液2 mL,充分混勻,常溫下避光反應(yīng)10 min,于517 nm處測定吸光度值A(chǔ),每組重復(fù)測定3次,DPPH自由基清除率的計算公式:

式中:Ai表示樣液與DPPH溶液混勻后的吸光度值;Aj表示樣液與乙醇混勻后的吸光度值;A0表示不含樣液的DPPH溶液的吸光度值。

1.4.4 紫蘇蛋白肽的制備

參照高穎等[23]的方法并略作調(diào)整,準(zhǔn)確稱取0.5 g經(jīng)冷凍干燥的紫蘇蛋白樣品,溶于25 mL蒸餾水中,攪拌使其充分溶化,調(diào)節(jié)pH,加入一定量的蛋白酶制劑并置于相應(yīng)酶最適溫度的水浴鍋中酶解3 h,期間用1 mol/L NaOH維持蛋白酶的適宜溶液pH。酶解完成后在沸水浴中加熱滅酶1 min,冷卻至室溫,以8 000 r/min離心2 min,取上清液,即酶解后的紫蘇蛋白肽溶液,于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 紫蘇蛋白肽的制備工藝優(yōu)化

以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo),采用單因素試驗優(yōu)化蛋白酶種類、酶解時間、超聲功率、超聲時間,確定紫蘇蛋白肽的制備工藝。

1.4.5.1 蛋白酶種類對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

參照沈嘉森的蛋白酶解方法,在紫蘇蛋白適宜條件下酶解,酶用量統(tǒng)一為3 000 U/g,酶解時間為1 h,計算DPPH自由基清除率,即其酶解液的抗氧化活性。

1.4.5.2 酶解時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

準(zhǔn)確稱量0.1 g紫蘇蛋白于燒杯中,加入5 mL蒸餾水使其充分溶化,加入 pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液5 mL,并以1 mol/L HCl維持溶液的pH為6.0,隨后加入木瓜蛋白酶制劑,在水浴鍋中不斷攪拌酶解,并分別在反應(yīng)2,3,4 h時測定其酶解液的吸光度值并計算其DPPH自由基清除率。

1.4.5.3 超聲功率對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

準(zhǔn)確稱量0.1 g紫蘇蛋白3組置于燒杯中,向燒杯中分別加入5 mL蒸餾水使之充分溶解,溶解后置于不同功率(300,500,600 W)的超聲波清洗機中,超聲3 min,加入pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液5 mL并調(diào)節(jié)溶液的pH后,加入木瓜蛋白酶使其酶解反應(yīng)3 h,酶解完成后,置于沸水浴中10 min,以6 000 r/min離心10 min,取上清液,測定其吸光度值并計算其DPPH自由基清除率。

1.4.5.4 超聲時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

準(zhǔn)確稱量0.1 g紫蘇蛋白3組置于燒杯中,加入5 mL蒸餾水使之充分溶解,溶解完全后置于功率500 W的超聲波清洗機中,分別在超聲2,3,4 min時取出,加入5 mL磷酸鹽緩沖液并調(diào)節(jié)其pH,加入木瓜蛋白酶酶解3 h,然后放入沸水浴中10 min,冷卻至室溫后以6 000 r/min離心10 min,取其上清液,測定其吸光度值并計算其DPPH自由基清除率。

1.4.6 紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的制備

準(zhǔn)確量取一定量的紫蘇蛋白肽溶液和單糖溶液于10 mL試管中,加入緩沖溶液和蒸餾水各3 mL,并調(diào)節(jié)pH為9.0,搖勻后于80 ℃水浴1 h,室溫下冷卻,即得紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物。

1.4.7 紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物工藝優(yōu)化

以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo),采用單因素試驗優(yōu)化單糖種類、糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值、pH、溫度、反應(yīng)時間,確定糖基化產(chǎn)物的制備工藝。

1.4.7.1 單糖種類對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1分別配制葡萄糖、果糖、木糖3個樣品于10 mL離心管中,并加入蒸餾水和pH 9.0的緩沖溶液各3 mL,調(diào)節(jié)pH為9.0,搖勻后于80 ℃水浴1 h,室溫下冷卻,用紫外分光光度計測量其吸光度值,計算3種單糖糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.4.7.2 糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1,0.5,2分別配制葡萄糖與紫蘇蛋白肽的3個樣品于10 mL離心管中,并加入蒸餾水和pH 9.0的緩沖溶液各3 mL,調(diào)節(jié)pH為9.0,搖勻后于80 ℃水浴1 h,室溫下冷卻,用紫外分光光度計測量其吸光度值,計算3種不同糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值下糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.4.7.3 pH對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1分別配制葡萄糖與紫蘇蛋白肽的4個樣品于10 mL離心管中,并加入蒸餾水和pH 9.0的緩沖溶液各3 mL,調(diào)節(jié)pH分別為6.0,7.0,8.0,9.0,搖勻后于80 ℃水浴1 h,室溫下冷卻,用紫外分光光度計測定其吸光度值,計算不同pH下糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.4.7.4 溫度對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1分別配制葡萄糖與紫蘇蛋白肽的4個樣品于10 mL離心管中,并加入蒸餾水和pH 9.0的緩沖溶液各3 mL,調(diào)節(jié)pH為9.0,搖勻后分別于70,80,90,100 ℃水浴1 h,室溫下冷卻,用紫外分光光度計測量其吸光度值,計算不同溫度下糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.4.7.5 反應(yīng)時間對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

以糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1分別配制葡萄糖與紫蘇蛋白肽的4個樣品于10 mL離心管中,并加入蒸餾水和pH 9.0的緩沖溶液各3 mL,調(diào)節(jié)pH為9.0,搖勻后于100 ℃水浴2,4,6,8 h時取出,冷卻至室溫后,用紫外分光光度計測量其吸光度值,計算不同反應(yīng)時間下糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.4.8 響應(yīng)面分析試驗優(yōu)化紫蘇蛋白肽糖基化反應(yīng)工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取糖肽質(zhì)量比值、溫度、反應(yīng)時間為試驗變量,以DPPH自由基的清除率為考察指標(biāo),采取三因素三水平的響應(yīng)面試驗,研究紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的最佳配比,設(shè)計方案見表1,每次試驗重復(fù)3次。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活力的測定結(jié)果

蛋白酶因?qū)Ρ４鏈囟?、時間和環(huán)境非常敏感,在使用前需要對其進行酶活力的測定。以測得的吸光度值(Y)作為縱坐標(biāo),以酪氨酸溶液濃度(X,μg/mL)作為橫坐標(biāo),繪制線性回歸方程,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.011X-0.006 3,R2=0.997 4,K=91.4。

由圖1可知,吸光度值和酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度有良好的線性關(guān)系。由圖1計算可知,堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的吸光度值分別為0.025,0.223,0.106,根據(jù)測得的吸光值得出X分別為2.85,20.85,10.20。得出3種蛋白酶的酶活力分別為堿性蛋白酶11 400 U/g,中性蛋白酶83 400 U/g,木瓜蛋白酶41 200 U/g。

圖1 酪氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 紫蘇蛋白肽的制備及其抗氧化活性的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 蛋白酶種類對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖2可知,以3 000 U/g的相同酶活力酶解等量紫蘇蛋白,以DPPH自由基清除率為指標(biāo)選取最佳蛋白酶種類,在各蛋白酶的適宜條件下,測得木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率可達96.43%,表明其對紫蘇蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性遠遠高于其他兩種蛋白酶,可知木瓜蛋白酶更適宜于紫蘇蛋白肽的酶解。其原因為紫蘇蛋白肽鏈序列中木瓜蛋白酶的特異酶切位點較多,并且蛋白肽的抗氧化活性往往與疏水性和芳香族氨基酸基團的暴露有關(guān)[24]。

圖2 不同蛋白酶對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

2.2.2 酶解時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖3可知,在木瓜蛋白酶的最適條件下酶解,研究酶解時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響,在3 h時測得的DPPH自由基清除率為90.02%,相比2 h時的酶解產(chǎn)物其抗氧化活性顯著提高,這是因為酶對肽鍵的水解接近飽和,底物被充分酶解,蛋白中疏水性氨基酸或芳香族類氨基酸被酶解顯露,導(dǎo)致抗氧化肽數(shù)目顯著增加。酶解時間從3 h增加至4 h時,其DPPH自由基清除率為91.02%,增長幅度僅為1%,表明抗氧化活性改變不顯著,DPPH自由基清除率極其緩慢增加,這是因為紫蘇蛋白分子上酶切位點快速減少,導(dǎo)致反應(yīng)物中具有活性的基團減少,綜合考慮,3 h為最適酶解時間。

圖3 酶解時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

2.2.3 超聲時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖4可知,以木瓜蛋白酶酶解3 h,輔助超聲波法,探究超聲時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響,并通過其抗氧化活性優(yōu)化最優(yōu)超聲時間。超聲時間為3 min時,DPPH自由基清除率為91.78%,抗氧化活性效果最佳,3 min后隨著超聲時間的增加,其抗氧化活性呈降低趨勢,由此得出最優(yōu)超聲時間為3 min。

圖4 超聲時間對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

2.2.4 超聲功率對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

由圖5可知,在木瓜蛋白酶、超聲時間3 min、酶解3 h的優(yōu)化條件下,探究超聲功率為300,500,600 W時對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響。隨著超聲功率逐漸增大,DPPH自由基清除率先升高后降低,在超聲功率為500 W時達到最高點96.70%,其抗氧化活性最強,且繼續(xù)增大超聲功率,其抗氧化活性呈下降趨勢,這是因為在酶解系統(tǒng)中,隨著超聲功率的增大,超聲波強度增加,空化作用強度也隨之增強[25],空化作用進一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)大分子解鏈,增加底物與酶活性中心的接觸機率,進而加快酶解反應(yīng)速度。當(dāng)超聲功率增加到500 W時,空化作用趨于穩(wěn)定,但局部形成的高溫、高壓等因素導(dǎo)致酶分子空間結(jié)構(gòu)被破壞,引起酶活力降低,致使蛋白酶解速率降低。綜合考率超聲功率對紫蘇蛋白肽DPPH自由基清除率的作用強度,選取500 W作為最優(yōu)的超聲功率。

圖5 超聲功率對紫蘇蛋白肽抗氧化活性的影響

綜上所述,紫蘇蛋白肽的制備及其抗氧化活性的最優(yōu)方案為:使用木瓜蛋白酶酶解紫蘇蛋白,在500 W的超聲功率下超聲3 min,并在木瓜蛋白酶的適宜條件下酶解3 h,即得抗氧化活性較強的紫蘇蛋白肽產(chǎn)物。

2.3 紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的單因素試驗結(jié)果

2.3.1 單糖種類對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

由圖6可知,以上述優(yōu)化試驗制備的紫蘇蛋白肽分別與等質(zhì)量比的果糖、葡萄糖、木糖發(fā)生糖基化反應(yīng),測得糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性,葡萄糖的糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為52.14%,果糖的糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為50.29%,木糖的糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為51.13%,由此可知,葡萄糖制備的糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性明顯優(yōu)于果糖和木糖,可知葡萄糖最優(yōu)。原因可能是葡萄糖與紫蘇蛋白肽進行了糖基化反應(yīng),即美拉德反應(yīng),產(chǎn)生的抗氧化活性產(chǎn)物較多,此外,單糖的開鏈程度對美拉德反應(yīng)的影響較大,上述結(jié)果表明,可能葡萄糖更易與紫蘇蛋白肽發(fā)生糖基化反應(yīng)。綜上,采用葡萄糖與紫蘇蛋白肽制備糖基化產(chǎn)物并對其糖肽質(zhì)量比進行優(yōu)化試驗。

圖6 單糖種類對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.3.2 糖肽質(zhì)量比值對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

由圖7可知,隨著糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值的增大,其DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先升后降的趨勢,糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1時制備的糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為52.14%,其抗氧化活性最佳,而糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為0.5,2時其抗氧化活性均低于1時,因為葡萄糖與底物隨著葡萄糖量的增加其有效碰撞增強,進而加速了美拉德反應(yīng)的進行,隨著質(zhì)量比值逐漸增大,葡萄糖與紫蘇蛋白肽的空間受阻,導(dǎo)致反應(yīng)受到影響,因此其DPPH自由基清除率相應(yīng)降低,由此可知,最優(yōu)糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1。綜上,以葡萄糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值為1時制備糖基化產(chǎn)物,并對其糖基化反應(yīng)的pH進行優(yōu)化試驗。

圖7 糖肽質(zhì)量比值對糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.3.3 pH對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

由圖8可知,葡萄糖與紫蘇蛋白肽以1的質(zhì)量比值在不同pH條件下獲得糖基化產(chǎn)物,并測定其抗氧化活性,隨著pH的增加,其抗氧化活性逐漸增強,在pH為9.0時糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為83.33%,可知堿性條件更適宜其發(fā)生糖基化反應(yīng),且其產(chǎn)物的抗氧化活性較強。但過堿環(huán)境會抑制美拉德反應(yīng)的進行,由于多肽在強堿條件下可能會消耗其供氫體上的氫,導(dǎo)致抗氧化活性降低。在pH為9.0時其抗氧化活性最強。綜上,葡萄糖與紫蘇蛋白肽以1的質(zhì)量比值,在pH為9.0時發(fā)生糖基化反應(yīng),對不同溫度下發(fā)生糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性進行優(yōu)化試驗。

圖8 pH對糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.3.4 溫度對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

由圖9可知,隨著反應(yīng)溫度的升高,其糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性增強,這是由于溫度逐漸升高促進了糖基化即美拉德反應(yīng)的速率,最適糖基化的溫度為100 ℃,其DPPH自由基清除率為56.34%,抗氧化活性最強。一定范圍內(nèi),溫度的升高促進美拉德反應(yīng)的發(fā)生,致使其獲得的產(chǎn)物增多,產(chǎn)物的抗氧化程度越高。

圖9 溫度對糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.3.5 反應(yīng)時間對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

在葡萄糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值1、pH 9.0、100 ℃的條件下,在反應(yīng)2,4,6,8 h時分別比較其糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性。由圖10可知,在反應(yīng)4 h時,其DPPH自由基清除率達到最大,為59.32%。隨著反應(yīng)時間繼續(xù)延長,其抗氧化活性趨于平緩,這是因為其美拉德反應(yīng)已達飽和,葡萄糖與紫蘇蛋白肽反應(yīng)產(chǎn)生了酮類等還原性物質(zhì),隨著時間的延長,其抗氧化活性不再有明顯變化,考慮經(jīng)濟效率等方面的原因,選取4 h為最佳反應(yīng)時間。

圖10 反應(yīng)時間對糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

綜上所述,紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性最優(yōu)制備方案:葡萄糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值1、pH 9.0、100 ℃下反應(yīng)4 h,即得抗氧化活性最優(yōu)的紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物。

2.4 響應(yīng)面分析試驗優(yōu)化紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物工藝

為獲得紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性條件的最佳工藝,采用Box-Behnken模型的中心組合試驗設(shè)計原理進行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗,結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

利用響應(yīng)面法研究,以DPPH自由基清除率(R)為響應(yīng)值,分別以糖肽質(zhì)量比值(A)、溫度(B)、反應(yīng)時間(C)為自變量,將結(jié)果進行線性擬合分析,各變量方差分析見表3。并得到回歸方程:R=87.11+1.60A+3.92B+1.69C-1.09AB-0.112 5AC-1.08BC-9.24A2-6.00B2-6.82C2。

表3 響應(yīng)面回歸模型及方差分析

由表3可知,模型的P<0.000 1,表示極顯著;失擬項的P值為 0.746 1,表示不顯著,可得試驗擬合較佳。一次項A(糖肽質(zhì)量比值)和C(反應(yīng)時間)對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物抗氧化活性的線性效應(yīng)顯著(P<0.05),一次項B和二次項A2、B2、C2對抗氧化活性的影響極顯著(P<0.01),交互相AB、AC、BC對抗氧化活性的影響均不顯著(P>0.05)。

由圖11～圖13可知,3個因素對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除效果具有明顯影響。經(jīng)過回歸模型的分析,使用響應(yīng)面分析優(yōu)化后獲得紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的最佳工藝條件為糖肽質(zhì)量比值、溫度、反應(yīng)時間分別為1.25、90 ℃、4 h。在相應(yīng)條件下,模型預(yù)測的DPPH自由基清除率為87.110 5%?？紤]到實際操作條件,將最佳工藝條件設(shè)置為糖肽質(zhì)量比值、溫度、反應(yīng)時間分別為1.25、90 ℃、4 h。在設(shè)置條件下對其進行驗證試驗,重復(fù)3次并取平均值,得出其DPPH自由基清除率為85.55%,與模型預(yù)測值較接近,說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的制備工藝條件具有可行性。

圖11 糖肽質(zhì)量比值與溫度的交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面及等高線

圖12 糖肽質(zhì)量比值與反應(yīng)時間的交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面及等高線

圖13 溫度與反應(yīng)時間的交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面及等高線

通過響應(yīng)面和等高線可得出3個因素的交互作用對紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除效果的影響強弱,響應(yīng)面呈山丘狀,紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率存在極大值,越陡峭影響越顯著,由等高線形狀可判斷交互效應(yīng)的強弱,呈橢圓形,兩因素的交互作用顯著,如糖肽質(zhì)量比值與反應(yīng)時間的交互作用;呈圓形,交互作用不明顯,如糖肽質(zhì)量比值與溫度、溫度與反應(yīng)時間的交互作用,這與表3的分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

超聲波輔助酶法制備紫蘇蛋白肽的最優(yōu)條件為木瓜蛋白酶在最適條件下酶解3 h,超聲功率500 W輔助酶解3 min,制得的紫蘇蛋白肽的DPPH自由基清除率達96.70%,抗氧化活性最佳。葡萄糖與紫蘇蛋白肽的質(zhì)量比值1、pH 9.0、100 ℃下反應(yīng)4 h,制備的紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達到59.32%,抗氧化活性顯著增強。通過響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物的制備條件為糖肽質(zhì)量比值1.25、溫度90 ℃、反應(yīng)時間4 h,預(yù)測DPPH自由基清除率達到87.110 5%,實測為85.55%,各因素之間相互作用造成清除率發(fā)生變化,紫蘇蛋白肽糖基化產(chǎn)物對DPPH自由基清除率的影響因素大小順序為溫度>反應(yīng)時間>糖肽質(zhì)量比值。酶解紫蘇蛋白制備抗氧化多肽,美拉德反應(yīng)進行糖基化修飾,可顯著提高其抗氧化活性,為天然抗氧化活性肽、功能性食品和功能性調(diào)味肽等的開發(fā)利用提供了參考和理論依據(jù)。