微波-超聲輔助乳清分離蛋白糖基化工藝優(yōu)化

林澤鉗,白衛(wèi)東,劉巧瑜*,曾曉房,陳海光,郭文山

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院,廣州 510225;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室,廣州 510225;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣州 510225)

乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)是動物乳中的一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),奶酪制作工業(yè)的副產(chǎn)物。由于WPI是一種完全蛋白,且具有良好的功能特性(如乳化性、起泡性和凝膠性),被認(rèn)為是蛋白類食品乳液遞送體系的良好載體[1]。然而在食品工業(yè)中,環(huán)境因素如 pH、離子強(qiáng)度、溫度等強(qiáng)烈影響了WPI的聚集行為,極大影響了WPI在工業(yè)加工中的應(yīng)用。

蛋白分子的修飾改性被認(rèn)為是一種能有效改善蛋白功能特性的方法[2]。在過去的研究中,糖基化改性蛋白具有更寬的pH穩(wěn)定性[3]、更強(qiáng)的離子穩(wěn)定性[4]和更好的熱穩(wěn)定性[5]。糖基化反應(yīng)主要分為干法和濕法,其中干法條件嚴(yán)格、成本高、反應(yīng)緩慢且難控制,不適合工業(yè)應(yīng)用[6];而濕法操作簡單、反應(yīng)時間短、產(chǎn)品性能更穩(wěn)定[7]。但在濕美拉德反應(yīng)中,蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性和聚集,降低了其與糖的共價結(jié)合能力,導(dǎo)致產(chǎn)物的接枝度、利用效率低[8]。此外,長時間的高溫也促進(jìn)了副反應(yīng)的發(fā)生,可能形成抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)[9]。因此,前人對濕美拉德法糖基化工藝進(jìn)行了改進(jìn),以增加糖基化效率和減少副反應(yīng)的發(fā)生。He等[10]首創(chuàng)了一種高/低溫循環(huán)的濕美拉德法,制得了高接枝度、低褐變度的糖基化蛋白;管軍軍等[11]發(fā)現(xiàn)了微波輻射加熱對大豆分離蛋白-接枝多糖的反應(yīng)速率比水浴加熱提高了60 倍,顯著減少了產(chǎn)物中自由氨基、類黑素、DG等小分子物質(zhì)的生成;宋旸等[12]采用微波作為預(yù)處理,Jin等[13]利用超聲作為預(yù)處理分別縮短了蛋白-多糖接枝反應(yīng)時間,提高了蛋白的接枝度和乳化性能。

微波-超聲聯(lián)用作為一種新型的蛋白改性方法,其中微波輻射引起極性分子高速運動,使大分子氫鍵斷裂,輔以超聲剪切力、空化作用等提高改性速率,可將蛋白結(jié)構(gòu)展開,使內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露,增加反應(yīng)結(jié)合位點。但微波-超聲聯(lián)用技術(shù)目前主要應(yīng)用在目標(biāo)物萃取及物質(zhì)合成方面[14-16],而在物理改性方面的應(yīng)用研究較少。因此,該實驗將通過微波-超聲聯(lián)用輔助糖基化WPI,研究不同的微波-超聲次數(shù)、WPI∶GOS(質(zhì)量比)、水浴溫度、水浴時間對WPI-GOS的接枝度、乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響。并以接枝度為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面法對WPI-GOS的微波-超聲波復(fù)合物理場輔助糖基化反應(yīng)工藝進(jìn)行優(yōu)化,旨在研究一種高接枝度、低褐變度的濕美拉德反應(yīng)蛋白糖基化方法,為后期WPI的綜合開發(fā)與利用提供一種新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乳清分離蛋白、低聚半乳糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、溴化鉀、OPA、四硼酸鈉、DDT、3 500 Da透析袋:上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F60 高速均質(zhì)機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;超聲微波協(xié)同工作站 南京先歐儀器制造有限公司;UV-1780紫外可見分光光度計、RF-6000 熒光光譜儀、IRAffinity-1 傅里葉紅外光譜儀 島津儀器(蘇州)有限公司;JY600C電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Nano-ZS型動態(tài)光散射儀 英國Malvern 公司。

1.3 方法

1.3.1 接枝度測定

根據(jù)Pirestani等[17]的方法,配制 OPA溶液(0.64% OPA、0.78% DDT、0.8% SDS、3.048% Na2B4O7)。400 μL 0.1 mg/mL蛋白溶液與3 mL OPA溶液反應(yīng)2 min,測定吸光值。按式(1)計算接枝度:

(1)

式中:DG表示接枝度,%;A0表示空白組的吸光度;A1表示對照組的吸光度;A2表示實驗組的吸光度。

1.3.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照吳爽等[18]的方法,配制2 mg/mL蛋白溶液,與大豆油按3∶1(體積比)混合,10 000 r/min條件下均質(zhì)1 min,分別在0 min 和靜置10 min從樣品底部取出50 μL 乳液加入5 mL 0.1%的SDS 溶液中,振勻后測定其在500 nm 處的吸光度A0和A10。按式(2)和式(3)分別計算乳濁液的乳化活性指數(shù)EAI和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI):

(2)

(3)

式中:EAI表示乳化活性指數(shù),g/m2;ESI表示乳化穩(wěn)定性指數(shù),min;N表示稀釋倍數(shù);ρ表示蛋白濃度,mg/mL;φ表示油相體積分?jǐn)?shù),%;A0表示0 min反應(yīng)溶液的吸光度;A10表示10 min反應(yīng)溶液的吸光度。

1.3.3 單因素實驗設(shè)計

圖1 微波-超聲預(yù)處理WPI-GOS接枝反應(yīng)實驗流程簡圖

將6.00 g WPI溶于0.1 mol/L pH為7.0的磷酸緩沖溶液中,加入一定質(zhì)量比例的GOS,磁力攪拌30 min充分水合。設(shè)置微波-超聲協(xié)同工作站設(shè)備,微波功率為300 W,超聲功率為300 W,最高溫度為80 ℃。將WPI-GOS混合溶液冰浴至20 ℃,微波-超聲至溫度達(dá)到80 ℃時,記為一次循環(huán),按需求重復(fù)上述操作,最后水浴攪拌加熱,冷卻至室溫,凍干待用。單因素實驗設(shè)計見表1。

表 1 單因素實驗設(shè)計因素水平

1.3.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇WPI∶GOS(質(zhì)量比)、水浴溫度、水浴時間為自變量,以蛋白接枝度為響應(yīng)值,運用Design-Expert 12.0 軟件進(jìn)行三因素三水平實驗設(shè)計,響應(yīng)面實驗設(shè)計見表2。

表 2 響應(yīng)面實驗因素水平表

1.3.5 傅里葉紅外光譜

根據(jù)Li等[8]的方法,采用溴化鉀壓片法,蛋白與溴化鉀的質(zhì)量比為1∶200,光譜分辨率為4 cm-1,掃描32次,掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.6 粒徑測定

將10 mg/mL蛋白溶液與大豆油按體積比9∶1混勻,665 W超聲乳化1 min,制得乳液。以超純水中稀釋100倍,測量其在不同pH和溫度條件下的粒徑分布情況以及多分散系數(shù)(PDI)。

1.3.7 反應(yīng)程度與色澤的分析

用超純水稀釋蛋白樣品至2.5 mg/mL,采用紫外可見分光光度計測定A420 nm,表示產(chǎn)物的褐變程度;用超純水稀釋蛋白樣品至1 mg/mL測定A294 nm,表示美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物。稱取適量樣品于透明密封袋中,測量蛋白的L*、a*和b*值。根據(jù)下式計算樣品的白度值(W)與色差值(ΔE):

(5)

(6)

1.3.8 結(jié)果分析

采用 Origin 2020 和 Excel 2010 繪制單因素實驗結(jié)果圖,采用SPSS 2020對單因素數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計分析(P<0.05表示差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義),采用Design-Expert 8.0 軟件對響應(yīng)面實驗結(jié)果進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波-超聲次數(shù)對WPI糖基化產(chǎn)物的影響

(a)

由圖2可知,隨著微波-超聲次數(shù)的增加,WPI的接枝度、乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,微波-超聲次數(shù)為3次時達(dá)到最大值,分別為60.12%、330.42 m2/g和39.58 min。微波-超聲波協(xié)同處理WPI-GOS過程中,微波作用使極性分子高速運動,輔以超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械作用,可使分子中的氫鍵、離子鍵等斷裂,使WPI分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,致密、有序的分子結(jié)構(gòu)變得松散、無序,更多適宜的結(jié)合位點暴露,促進(jìn)了糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。隨著微波-超聲到一定次數(shù)后,WPI不再有適宜與GOS結(jié)合的位點暴露,糖基化反應(yīng)也達(dá)到飽和。此時,反應(yīng)體系內(nèi)分子的部分化學(xué)鍵繼續(xù)斷裂,且可能生成高度活躍的自由基,引發(fā)一系列的副反應(yīng),使產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降。

2.2 WPI∶GOS(質(zhì)量比)對WPI糖基化產(chǎn)物的影響

由圖3可知,隨著WPI與GOS質(zhì)量比的增加,WPI的接枝度、乳化活性和乳化穩(wěn)定性先陡升后緩降,在WPI與GOS質(zhì)量比為3∶1時,達(dá)到最大值。單位空間內(nèi)GOS數(shù)量增多,WPI與GOS分子接觸和反應(yīng)的概率增加。GOS接枝到WPI上后,一方面,WPI兩親性增強(qiáng),接枝物更加緊密地吸附在油-水界面上,形成致密的界面膜,從而提高了WPI的乳化活性;另一方面,親水性的GOS在外層,提供了一定的空間位阻,阻止了界面蛋白的聚合,增強(qiáng)了WPI的乳化穩(wěn)定性[18]。但隨著單位空間內(nèi)GOS分子繼續(xù)增加,美拉德反應(yīng)從初級反應(yīng)繼續(xù)向中級反應(yīng)甚至高級反應(yīng)推進(jìn)。此時,蛋白結(jié)構(gòu)趨于紊亂且副產(chǎn)物增多,乳化活性和乳化穩(wěn)定性也隨之下降。

(a)

2.3 水浴溫度對WPI糖基化產(chǎn)物的影響

由圖4可知,微波-超聲處理使WPI結(jié)構(gòu)展開,暴露更多結(jié)合位點,但此過程的糖基化反應(yīng)并不完全[19],故需繼續(xù)加熱反應(yīng)。隨著水浴溫度的增加, WPI的接枝度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性都呈先上升后下降的趨勢,在60 ℃時均達(dá)到最大值。He等[10]認(rèn)為,糖基化反應(yīng)是美拉德反應(yīng)的偽零級反應(yīng),通過溫度可以控制美拉德反應(yīng)的初級階段,減少糖基化過程中副反應(yīng)的發(fā)生。適宜的溫度為反應(yīng)體系提供了適量的活化能,促進(jìn)了基化反應(yīng)的發(fā)生。在進(jìn)一步升溫中,分子中過多的活化能觸發(fā)了下一個反應(yīng)的發(fā)生,使WPI-GOS減少,反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性隨之下降。此外,高溫使WPI分子結(jié)構(gòu)充分展開,蛋白分子由于疏水相互作用聚集,阻礙了糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。

2.4 水浴時間對WPI糖基化產(chǎn)物的影響

由圖5可知,隨著水浴時間的增加,WPI的接枝度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性都呈先上升后下降的趨勢,其中WPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性在60 min時達(dá)到最大值。美拉德反應(yīng)前期,WPI與GOS受熱后逐步結(jié)合。在進(jìn)一步加熱后,WPI蛋白結(jié)構(gòu)充分延展,且WPI中的部分賴氨酸被破壞[18],蛋白分子之間的相互作用增強(qiáng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝聚,接枝度下降,這與陳又銘等[20]的實驗結(jié)果相似。此外,蛋白結(jié)構(gòu)充分展開,WPI與過多的GOS結(jié)合,會導(dǎo)致WPI-GOS趨于親水性,乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降。

(a)

2.5 響應(yīng)面分析

2.5.1 響應(yīng)面模型建立及回歸方差分析

綜合分析單因素實驗結(jié)果后,WPI∶GOS(質(zhì)量比)選取2∶1、3∶1、4∶1,水浴溫度選取50,60,70 ℃,水浴時間選取50,60,70 min,以接枝度為響應(yīng)值,采用Box-Behnken 法進(jìn)行實驗因素設(shè)計,實驗方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

運用Design-Expert 12.0 對各因素進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到二次回歸方程:接枝度(%)=62.81+2.71A+3.11B+1.83C-3.05AB-1.03AC+1.7BC-3.02A2-7.63B2-8.07C2。

以接枝度為響應(yīng)值的二次多項回歸方程模型中(見表4),模型的P<0.000 1,表明該預(yù)測模型極顯著;失擬項的P=0.069>0.05,表明失擬項差異不顯著;相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6,校正決定系數(shù)RAdj2=0.998 7,變異系數(shù)(C.V.)為0.12%,擬合度和可信度高,表明此模型可以很好地反映WPI-GOS接枝度與WPI∶GOS、水浴溫度和水浴時間各因素之間的關(guān)系,能較好地描述該微波-超聲預(yù)處理的后續(xù)工藝對WPI-GOS接枝度影響的情況。一次項、二次項和交互項對其影響均極顯著。由F值可知,各因素對WPI-GOS接枝度的影響程度為B>A>C。

表4 接枝度回歸模型方差分析

2.5.2 響應(yīng)面各因素間交互作用分析

由圖6可知,隨著WPI∶GOS(質(zhì)量比)、水浴溫度和水浴時間3個因素的增大,WPI-GOS接枝度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,與單因素實驗結(jié)果一致,在設(shè)定的自變量范圍內(nèi)均存在響應(yīng)曲面最高點,說明因素之間的影響顯著。當(dāng)其他因素恒定時,在一定的范圍內(nèi),隨著WPI∶GOS (質(zhì)量比)的增加,WPI-GOS接枝度增加幅度最大,曲線相對較陡,水浴溫度和水浴時間的影響次之。WPI∶GOS (質(zhì)量比)與水浴溫度和水浴時間的等高線橢圓效果明顯,表明WPI∶GOS (質(zhì)量比)與水浴溫度和水浴時間的交互作用對WPI-GOS接枝度的影響較大。

2.5.3 優(yōu)化工藝的確定和驗證實驗

運用Design-Expert 12.0 軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析優(yōu)化(見表5),得出理論最優(yōu)工藝條件為WPI∶GOS (質(zhì)量比)2.78∶1、水浴溫度61.29 ℃、水浴時間61.59 min,由此預(yù)測出WPI-GOS接枝度為62.53%。根據(jù)實際可操作性,將其修正為WPI∶GOS (質(zhì)量比)2.8∶1、水浴溫度61.3 ℃、水浴時間61.7 min。在修正的優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證實驗,進(jìn)行3 次平行實驗,取平均值后得到的接枝度為(62.48±0.74)%,與預(yù)測值比較接近,表明響應(yīng)面法對微波-超聲預(yù)處理WPI-GOS接枝工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是穩(wěn)定可行的,對實踐具有一定指導(dǎo)意義。

表5 優(yōu)化實驗結(jié)果

2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

圖7 微波-超聲輔助糖基化改性WPI 的紅外光譜圖

2.7 納米粒徑

由圖8可知WPI、WPI+GOS混合物和WPI-GOS綴合物乳液在不同pH值和溫度下的粒徑變化情況。pH值和溫度都會影響WPI電離和乳化的程度,從而改變?nèi)橐旱姆€(wěn)定性。相對于WPI和WPI+GOS混合物乳液,在整個pH和溫度范圍內(nèi),WPI-GOS綴合物的粒徑和PDI更小,且在等電點pIWPI=5附近乳液粒徑的增大幅度較小。表明WPI-GOS綴合物乳液是穩(wěn)定的,可防止乳滴在pIWPI附近和高溫下的聚集。這可能是親水性GOS附著在乳滴外層,提供了一定的空間位阻,一方面克服了乳滴之間的靜電引力和范德華力作用[21],抑制了乳滴的聚集;另一方面,空間位阻也削弱了肽鏈的熱吸收,從而減少了熱處理對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的損害。

(a)

圖9 WPI及WPI-GOS接枝物反應(yīng)體系A(chǔ)294 nm、A420 nm、白度及色差變化

2.8 反應(yīng)程度與色澤的分析

A290 nm常用來測定美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的含量,而A420 nm則被用于測定最終產(chǎn)物。WPI與GOS的接枝反應(yīng)會發(fā)生顏色的褐變,其褐變與美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度呈正相關(guān)。WPI在糖基化后A290 nm大幅增加,而A420 nm小幅增加,說明體系發(fā)生了美拉德反應(yīng)。WPI的ε-NH2與GOS的-CHO脫水縮合,生成了中間產(chǎn)物。雖然部分中間產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行美拉德反應(yīng),但由于體系溫度較低,使蛋白的褐變程度較慢,所以接枝產(chǎn)物和WPI在白度和色差上差異性較小。

3 總結(jié)

該研究主要解決了濕法糖基化蛋白改性接枝度低、褐變程度高的難題,顯著提高了改性蛋白的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。微波-超聲輔助分離乳清蛋白糖基化的優(yōu)化結(jié)果:微波-超聲3次、WPI∶GOS (質(zhì)量比)2.8∶1、水浴溫度61.3 ℃、水浴時間61.7 min,該工藝下WPI的接枝度為(62.48±0.74)%。該工藝下,GOS對WPI結(jié)構(gòu)修飾作用明顯,乳化性能顯著提高,制得的WPI-GOS綴合物乳液具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,產(chǎn)物褐變程度低、白度高,表明該工藝可以很好地控制糖基化過程中美拉德反應(yīng)初級反應(yīng)和中級反應(yīng)的速率,更好地控制糖基化產(chǎn)物的產(chǎn)出。為WPI-GOS綴合物成為食品中揮發(fā)油、香料和生物活性化合物等的包封劑的生產(chǎn)提供了一種新的方法。如Doi等[22]通過模擬烹飪過程中乳液中大蒜顯微的釋放,發(fā)現(xiàn)WPI乳液粒徑小但熱穩(wěn)定性差是導(dǎo)致乳滴中風(fēng)味物質(zhì)在烹飪過程中損失的主要原因。此外,美拉德反應(yīng)也為改性蛋白提供了一定的風(fēng)味成分。但該方法也面臨著一些問題,如生產(chǎn)工藝和產(chǎn)物分離多糖的成本高、多糖的利用效率低等,限制了該工藝的應(yīng)用。還需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝,如采用換熱器降低能量功耗、超濾多糖濃縮重復(fù)利用等,以降低成本、接近生產(chǎn)實際。