博落回葉片炭疽病病原菌的分離及分子鑒定

林鳳芳 蘇海蘭 鄭梅霞 牛雨晴 朱雁鳴 朱育菁

摘 要：在福建省三明市明溪縣博落回種植區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似炭疽病病例，為明確福建三明地區(qū)博落回葉片炭疽病致病的病原菌，對采集的典型病樣進行病原菌的分離，并采用形態(tài)學、分子生物學和致病性測定對病原進行鑒定。結(jié)果表明：從博落回病葉中共分離到20株菌株，所有菌株的菌落形態(tài)均一致，菌落圓形，白色，背面淺灰白色至肉桂色，分生孢子團橘紅色，分生孢子為長橢圓形，單孢；ITS和TUB2基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，供試的菌株和果生炭疽菌Colletotrichumfructicola均聚類在一起，置信度分別為82%和99%；致病性測定結(jié)果表明，發(fā)病葉片的癥狀與田間的一致，符合柯赫氏法則。通過病樣發(fā)病癥狀、菌落形態(tài)及基因序列（ITS和TUB2）分析，發(fā)現(xiàn)引起三明市明溪縣的博落回葉片炭疽病病原菌為果生炭疽菌C.fructicola。

關(guān)鍵詞：博落回；病原菌；鑒定；果生炭疽菌

中圖分類號：S 567.239? 文獻標志碼：A? 文章編號：0253-2301（2023）06-0022-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.06.003

Isolation and Molecular Identification of the Pathogenic Bacteriaof Leaf Anthracnose in Macleaya cordata

LIN Feng-fang， SU Hai-lan， ZHENG Mei-xia， NIU Yu-qing， ZHU Yan-ming， ZHU Yu-jing*

（Institute of Crop Sciences， Fujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： A suspected case of anthracnose was found in the planting area of Macleaya cordata in Mingxi County of Sanming City in Fujian. In order to clarify the pathogenic bacteria of leaf anthracnose of M.cordata in Sanming area of Fujian Province， the pathogenic bacteria were isolated from the collected typical diseased samples， and then the pathogens were identified by using the morphology， molecular biology and pathogenicity test. The results showed that： A total of 20 bacterial strains were isolated from the diseased leaves of Macleaya cordata， and the colony morphology of all the strains was consistent. The colony was round with white color， and the backside was light white grey to cinnamon. The conidia were orange-red， and the conidial spores were long oval and single spore. The phylogenetic tree of ITS and TUB2 genes showed that the tested bacterial strains and Colletotrichum fructicola were clustered together， and the confidence levels were 82% and 99%， respectively. The results of pathogenicity test showed that the symptoms of the diseased leaves were consistent with those in the field and conformed to Koch′s rules. Through the analysis of the disease symptoms， colony morphology and gene sequences （ITS and TUB2） of the diseased samples， the pathogenic bacteria of leaf anthracnose of M.cordata in Mingxi County of Sanming City was C.fructicola.

Key words： Macleaya cordata； Pathogenic bacteria； Identification； Colletotrichum fructicola

博落回Macleayacordata Willd.R.Br隸屬于罌粟科，其主要化學成分為生物堿，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤等多方面的藥理作用［1］。博落回還可作為農(nóng)作物病蟲害防治綠色生物農(nóng)藥，以及動物飼料添加劑［2-4］。目前，國內(nèi)對博落回的研究主要集中在活性成分、藥理作用等方面［5］。而有關(guān)博落回病害報道較少，僅游景茂等［6］采用形態(tài)學、分子技術(shù)開展博落回根腐病致病菌的研究，發(fā)現(xiàn)博落回根腐病病害菌為白絹病。未見其他關(guān)于博落回病害的報道。目前在福建省三明市明溪縣種植區(qū)發(fā)現(xiàn)有大片區(qū)域博落回葉片上長有圓形或近圓形褐色病斑，嚴重時可造成葉片枯死脫落，疑似炭疽病。鑒于該病害的病原尚不明確，將影響病害防控措施的制定。

炭疽菌是為害植物最常見的病原真菌，可為害植物的莖、葉、花和果等，造成農(nóng)作物的葉斑病、果腐病等，嚴重時可導致農(nóng)作物的減產(chǎn)，進而造成經(jīng)濟上的損失。2012年，根據(jù)炭疽菌屬在科學和經(jīng)濟上的重要性，其被列入第八大植物病原真菌［7］。以往對于炭疽菌的鑒定多利用形態(tài)學特征和rDNA-ITS序列分析技術(shù)，由于有許多植物的炭疽病由多種炭疽菌復合侵染引起的［8-11］，僅利用形態(tài)學特征和rDNA-ITS序列鑒定炭疽菌的種類還是有所局限。近年來，炭疽菌分類研究的重要手段為形態(tài)學方法和多基因序列分析［12］。在運用多基因序列分析時，不同的研究者選擇的基因不同。目前，鑒定炭疽菌最常用的分子標記為ITS、TUB2、ACT、GAPDH、CHS和CAL［13，8-9，14-16］。為了明確博落回炭疽病的病原菌，本研究擬對該病害進行采樣和病害診斷，并對其病原菌進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，進一步通過柯赫氏法則進行驗證，旨在為該病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 BAO-250A光照培養(yǎng)箱購自上海施都凱儀器設備有限公司；Mini-7KS離心機購自杭州佑寧儀器有限公司；BX43型光學顯微鏡購自日本Olympus Corporation公司；C1000s型PCR儀購自美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀購自北京六一儀器廠；GI54D型高壓滅菌鍋購自美國Zealay公司。

1.1.2 主要試劑 75%酒精（山東安捷高科消毒科技有限公司）、3%次氯酸鈉溶液（福建維真園醫(yī)藥科技有限公司）、硫酸鏈霉素（上海阿拉丁生化科技有限公司）、真菌基因組DNA提取試劑盒（百泰克生物科技有限公司）、2×Taq MasterMix（福州尚亞生物技術(shù)有限公司）、50×TAE電泳緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）、1%瓊脂糖凝膠（萊博潤科生物技術(shù)有限公司）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）、瓊脂粉（杭州銘特生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病害采樣與癥狀觀察 2019-2021年期間，于福建省明溪縣博落回不同種植區(qū)調(diào)查、記錄疑似炭疽病典型癥狀，并采集代表性樣品用于病原菌分離鑒定。

1.2.2 病原菌的分離純化與形態(tài)學鑒定 取發(fā)病葉片的病健交接處組織約30個小塊，每小塊大小約5 mm×5 mm，用75%的酒精浸泡30 s，再轉(zhuǎn)至1%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒5 min，用無菌水漂洗3次，置于無菌濾紙上吸干水分。轉(zhuǎn)移至含有200 μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取菌落邊緣菌絲純化培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)和顏色，用顯微鏡觀察分生孢子的形態(tài)特征，測量分生孢子大小。將純化好的菌株于-80℃甘油冷凍保存。

1.2.3 病原菌的分子鑒定 取培養(yǎng)7 d的菌絲按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行菌株基因組DNA提取，-20℃保存?zhèn)溆?。采用ITS和TUB2基因進行擴增和測序

［17-19］，測序引物序列見表1。PCR反應體系（25 μL）為：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1 μmol·L-1，DNA模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。（1）ITS基因的PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。（2）TUB2基因的PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送博尚生物公司進行測序。

將所得序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對分析后，提交至NCBI獲取登錄號，并下載相關(guān)菌株序列，使用MEGA7.0軟件的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設置為

1 000。

1.2.4 病原菌致病性的測定 采用柯赫氏法則，挑選健康的葉片，用無菌注射器刺傷葉片主脈兩側(cè)部位，挑取分離純化的菌絲接種到傷口處，每種菌株5張葉片，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，以接無菌水的為對照，定期觀察葉片的發(fā)病情況。取發(fā)病葉片重新分離，并采用形態(tài)學和分子鑒定進行分離物的再次鑒定。每個處理重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似病例采樣與癥狀觀察

經(jīng)調(diào)查，在三明市明溪縣該病害在不同種植田塊的發(fā)病率為5%～10%。該疑似病例發(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)褐色小斑點，隨著病斑的擴大，形成圓形或近圓形黃褐色斑點，多個病斑逐漸擴大聯(lián)合，形成大的斑點，最終導致葉片黃化萎蔫（圖1A，B）。

2.2 疑似病原菌的分離和與形態(tài)學鑒定

通過分離純化得到的20株菌株菌落形態(tài)和孢子形態(tài)均一致。在PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形，邊緣整齊呈白色，菌絲絨毛狀，致密，稍厚，平板背面呈不均勻的淺灰白色至肉桂色，菌落中央產(chǎn)生橘紅色分生孢子團（圖2A、2B）。分生孢子為單孢，表面光滑，長橢圓形，兩端鈍圓或一端稍尖，大小16.76（14.80～18.96）μm×5.66（4.68～7.04）μm（n=30）（圖2C）。根據(jù)該菌株形態(tài)特征初步鑒定為果生炭疽菌Colletotrichumfructicola。

2.3 病原菌的分子鑒定

為了進一步明確分離物的種類，選擇代表性菌株FJAT-32225和FJAT-32233經(jīng)ITS和TUB2基因擴增、測序比對，并在GenBank獲得登錄號，ITS基因序列的登錄號為OR287162和OR287163，TUB2基因序列的登錄號為OR338336和OR338337。在NCBI中進行BLAST同源性比對，結(jié)果顯示菌株FJAT-32225和FJAT-32233的ITS和TUB2序列均與果生炭疽病菌C.fructicola相應序列同源性達99%以上。從GenBank數(shù)據(jù)庫選擇果生炭疽病菌及其近緣種的基因序列，與供試菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。ITS序列聚類結(jié)果表明，供試2個菌株均與果生炭疽病菌C.fructicola（登錄號分別為JX010173和JX010165）處于同一分枝上，置信度為82%（圖3），但與其他近緣種處于不同分枝上；TUB2序列聚類結(jié)果表明，供試2個菌株均與果生炭疽病菌C.fructicola（登錄號分別為JX010409和JX010405）處于同一分枝上，置信度為99%（圖4），但與其他近緣種處于不同分枝上。綜上所述，供試菌株FJAT-32225和FJAT-32233均可鑒定為果生炭疽病菌C.fructicola。

2.4 病原菌致病性測定

將FJAT-32225和FJAT-32233菌株回接博落回健康葉片的發(fā)病率均為100%，且發(fā)病癥狀與田間癥狀相似，無菌水對照組不發(fā)病。重新分離回接，獲得的純培養(yǎng)物經(jīng)分子鑒定與所接種供試菌株一致。致病性測定結(jié)果符合柯赫氏法則，證實了供試的2株果生炭疽菌C.fructicola菌株為博落回炭疽病的病原菌。

3 討論與結(jié)論

炭疽菌是世界上危害多種植物病原菌之一，而炭疽菌的準確鑒定對后期的準確防控具有重要的實踐意義［20］。目前由于炭疽菌屬Colletotrichum種類多、形態(tài)簡單相似度高，分類鑒定存在一定難度。王樹和等［21］對河南省臭椿果生炭疽菌進行描述，菌落先白色后灰色，背面黑色，分生孢子為圓柱狀，兩端鈍圓，單孢，無色；李河等［13］對油茶果生炭疽菌的描述，在PDA板上，菌落圓形，顏色由白色漸變?yōu)榛疑交液谏稚咦訄F橘黃色，分生孢子橢圓形，單孢，無色；本研究從博落回發(fā)病的葉片中，獲得20株炭疽菌菌落形態(tài)特征與果生炭疽菌的十分相似，因此根據(jù)形態(tài)初步鑒定這20株病原菌為果生炭疽菌C.fructicola。

目前應用形態(tài)學和多基因分析方法，在鑒定炭疽菌屬真菌種類上提高了準確率。王成彬等［18］通過ITS、GAPDH、CHS-1、ACT和TUB2基因聯(lián)合分析，將鳶尾白蠟樹炭疽菌與形態(tài)上同其相似的白蠟樹炭疽菌復合群、禾谷炭疽菌復合群和平頭炭疽菌復合群中的一些種區(qū)分開來。本研究通過對供試菌株的ITS和TUB2序列進行比對，發(fā)現(xiàn)與果生炭疽病菌C.fructicola相應序列同源性達均達99%以上。隨后通過分別構(gòu)建ITS和TUB2基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果均顯示為供試菌株與果生炭疽病菌C.fructicola聚類于同一分支，因此可以確定這20株菌株為果生炭疽病菌C.fructicola。

本研究通過對三明明溪博落回炭疽菌病樣進行病原菌的分離純化獲得的菌株進行致病性測定證明分離的菌株可侵染博落回葉片癥狀與田間一致，分離純化的菌株與供試菌株一致。結(jié)合ITS和TUB2序列鑒定，明確引起博落回炭疽病的病原菌為果生炭疽菌C.fructicola。該病原菌首次在博落回中報道，但有關(guān)該病原菌在博落回上的侵染過程及防治措施有待進一步研究。

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（責任編輯：柯文輝）