惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710和circRNA_0079593的水平表達及其臨床價值

張曉宇，張亞茹，張 瑩，蔣志芳，劉惠敏（保定市第二中心醫(yī)院檢驗科，河北涿州 072750）

惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高、預(yù)后較差的皮膚科腫瘤[1]。由于缺乏對致癌基因的了解和鑒定，使得惡性黑色素瘤的早期診斷及治療存在局限性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀核糖核酸（circular RNA，circRNA）在惡性黑色素瘤組織和正常組織中具有顯著性差異表達，參與惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展，可能為該病的診斷及靶向治療帶來幫助[2-3]。以往的研究指出，circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中存在異常表達，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在惡性黑色素瘤的早期發(fā)現(xiàn)及指導治療等方面均具有重要意義[4-5]。由此我們推測，circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是惡性黑色素瘤的潛在分子標志物。然而，關(guān)于circRNA_0020710及circRNA_0079593是否可作為預(yù)測惡性黑色素瘤發(fā)生及疾病進展的生物標志物尚未清楚。因此，本研究通過檢測惡性黑色素瘤組織circRNA_0020710及circRNA_0079593的表達，分析其診斷惡性黑色素瘤及預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值，旨在為該病的診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對象 61例皮膚惡性黑色素瘤患者選自2019年1月～2022年3月保定市第二中心醫(yī)院，男性37例，女性24例，年齡35～72（55.62±10.18）歲。納入標準：①符合中國惡性黑色素瘤規(guī)范化病理診斷專家共識(2017年版)[6]；②>18歲，行手術(shù)切除術(shù)，有完整臨床資料和結(jié)果。排除標準：①已接受過其他方法治療；②并發(fā)免疫性疾病、感染性疾病及其他惡性腫瘤者。22例患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，39例患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；組織學分級，41例Ⅰ～Ⅱ級，20例Ⅲ～Ⅳ級；腫瘤部位：36例四肢和軀干（肢端），25例消化道、鼻和泌尿系黏膜（非肢端）；分化程度：34例中高分化，27例低分化。

1.2 儀器和試劑 ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒和Trizol試劑盒（Qiagen公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。

1.3 方法 采集惡性黑色素瘤組織和正常組織（取距病灶>2cm的正常皮膚組織），使用Trizol試劑提取組織總RNA（將組織樣本置于液氮內(nèi)研磨，每50～100mg樣本加Trizol 1ml），置于-80℃保存待檢。circRNA_0020710及circRNA_0079593檢測：circRNA_0020710引物（上游：5’-AGCACTGC TTGATGCTCGAACTA-3’，下游：5’-TATCGCCTAC GAGTACTACTG-3’），circRNA_0079593引物（上游：5’-AGACTAGCTATCTGATGAGAATA-3’，下游：5’-TACACGGTACAGCTCAATGTG-3’）。以甘油醛3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因（上游：5’-TCAGCTG ATGCTAGGAGCGTAT-3’，下游：5’-ACGACTGG CACTGTTACGCT-3’），用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測circRNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min（1個循環(huán)）；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算circRNA表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析circRNA_0020710及circRNA_0079593診斷惡性黑色素瘤及預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593表達 惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平均明顯高于正常組織（4.95±2.37 vs 1.84±0.92，2.70±1.15 vs 0.91±0.34），差異具有統(tǒng)計學意義（t=18.946，15.248，均P<0.001）。

2.2 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達與惡性黑色素瘤患者的臨床特征 見表1。惡性黑色素瘤患者circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平升高與組織分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤部位、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義（均P<0.001）。

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平與惡性黑色素瘤患者臨床特征的關(guān)系（±s）

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平與惡性黑色素瘤患者臨床特征的關(guān)系（±s）

類 別ncircRNA_0020710t值P值circRNA_0079593t值P值年齡（歲）＜55284.74±2.281.2140.1522.60±1.101.1640.173≥55335.21±2.462.86±1.24性別男375.07±2.411.1360.1772.65±1.080.9840.251女244.82±2.302.78±1.20組織分級Ⅰ～Ⅱ級413.87±1.9616.712<0.0012.15±0.9813.328<0.001Ⅲ～Ⅳ級206.35±3.463.60±1.76腫瘤部位肢端364.61±2.089.620<0.0012.36±1.0411.106<0.001非肢端255.62±2.743.48±1.71分化程度中高分化344.09±1.9415.708<0.0012.40±1.0310.415<0.001低分化276.14±3.183.42±1.68潰瘍有295.30±2.511.6300.0942.92±1.281.4180.106無324.67±2.242.56±1.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有226.80±3.7020.713<0.0014.02±1.8118.635<0.001無393.26±1.551.64±0.72

2.3 circRNA_0020710及circRNA_0079593對惡性黑色素瘤的診斷價值 見表2和圖1。circRNA_0020710及circRNA_ 0079593診斷惡性黑色素瘤的最佳截斷值為3.15和1.78，其診斷惡性黑色素瘤的曲線下面積均大于0.800，敏感度分別為84.6%和81.0%，特異度分別為82.4%和77.5%。

圖1 circRNA_0020710及circRNA_0079593診斷惡性黑色素瘤的ROC曲線

表2 circRNA_0020710及circRNA_0079593對惡性黑色素瘤的診斷價值

2.4 circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值 見表3和圖2。circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳截斷值為4.83和2.75，其預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面積均大于0.835，其敏感度分別為87.4%和84.0%，特異度分別為85.7%和80.8%。

圖2 circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表3 circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價值（%）

3 討論

惡性黑色素瘤是一種侵襲能力強、惡性程度高，極易發(fā)生淋巴結(jié)及致死率高的皮膚癌，嚴重威脅人類健康[7]。最近有報道稱，一些circRNA在惡性黑色素瘤中有差異表達，細胞或組織特異性表達使其成為合適的候選診斷或治療生物標志物[8]。CONG等[8]研究指出，circRNA_0020710作為一種致癌基因，在惡性黑色素瘤中調(diào)控異常，并參與了癌變過程，對惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展影響較大。另有研究認為，circRNA_0079593參與惡性黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，可能在惡性黑色素瘤的癌變過程及治療方面發(fā)揮重大的作用，臨床應(yīng)用前景較好[9]。

本研究顯示，與正常組織比較，惡性黑色素瘤組織circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平均明顯升高，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中呈高表達，其可能是促進惡性黑色素瘤發(fā)生的主要基因之一。KHORSANDI等[10]研究表明，一些circRNA_0025039在惡性黑色素瘤組織中顯著上調(diào)，在惡性黑色素瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與惡性黑色素瘤癌變的進展。本研究組織分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤部位非肢端、低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平均顯著增加，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593表達水平升高與疾病進展有關(guān)，其高表達可能促進惡性黑色素瘤的進展過程。MONTICO等[11]研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤組織和細胞中circRNA_0084043顯著上調(diào)，circRNA_0084043的高表達促進細胞增殖、遷移和生長，在惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究circRNA_0020710及circRNA_0079593單項指標對惡性黑色素瘤診斷及其預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有一定價值，其敏感度和特異度均較好，說明circRNA_0020710及circRNA_0079593可作為惡性黑色素瘤的診斷及預(yù)測淋巴轉(zhuǎn)移的分子標志物，對疾病的診斷及預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有很好的幫助。HAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，circRNA_0079593在惡性黑色素瘤組織和細胞系中顯著高表達，其過表達顯著提高了惡性黑色素瘤細胞的增殖率和侵襲能力，可能是惡性黑色素瘤新的生物標志物。另有研究認為，circRNA_0079593作為惡性黑色素瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與疾病的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為惡性黑色素瘤潛在的診斷、治療和預(yù)測生物標志物[13]。

綜上所述，惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593水平明顯升高，與組織分級Ⅲ～Ⅳ級、腫瘤部位、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其對惡性黑色素瘤診斷及預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有很好的價值，可作為該病診斷及病情判斷的分子標志物。但本研究病例來源較單一，樣本量較少，未來仍需更多的臨床研究進一步證實。