EB病毒BART miRNAs在胃癌中的作用機制研究進展

王巧祎，王寧寧,2，劉晴晴,2，成 軍（.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院檢驗科，杭州 3003；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233000）

EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）又稱人類皰疹病毒4型，是一種γ皰疹病毒，它感染了全世界90%以上的人口，并建立了終身潛伏感染。EBV是首個被證明與人類腫瘤發(fā)生有關(guān)的病毒，尤其與胃癌、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和NK/T細(xì)胞淋巴瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。胃癌是全球第四大常見的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。其中EBV相關(guān)胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）約占所有胃癌病例的10%，具有獨特的病理特征和分子特征[2]。EBVaGC多見于EBV潛伏感染I型和潛伏感染Ⅱ型，表達的病毒潛伏期基因有EBV核抗原1（EBV-encoded nuclear antigen 1，EBNA1）、表達EBV編碼的RNAs（EBV encoded RNAs，EBERs）、BARTs編碼的miRNAs和潛伏膜蛋白2A（LMP2A）[3]。

EBV也是第一個被證明編碼miRNA的人類病毒。miRNA是一種含有18～22個核苷酸的非編碼小RNA。成熟的miRNA是由miRNA的初級轉(zhuǎn)錄本經(jīng)Drosha和Dicer的順序加工而形成的[4]。EBV編碼miRNA通過完全或不完全的堿基配對與病毒或宿主mRNA的3’-UTR區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或者翻譯抑制。miRNA的前體分布在EBV基因組的兩個區(qū)域，BamHI-H右向開放讀碼框1（BamHI fragment H rightward open reading frame 1，BHRF1）產(chǎn)生3個miRNA前體，生成4個成熟的miRNAs，BART產(chǎn)生22個miRNA前體，生成40個成熟的miRNA[5]。其中BART分成BART cluster 1和BART cluster 2這兩個簇。BART cluster 1包含8個miRNA前體，包括BART1，BART3，BART4，BART5，BART6，BART15，BART16和BART17。BART cluster 2包含14個miRNA前體，包括BART2，BART7，BART8，BART9，BART10，BART11，BART12，BART13，BART14，BART18，BART19，BART20，BART21和BART22。BART miRNA在淋巴瘤中的表達相對較低，在NPC和EBVaGC中的表達較高[6]。越來越多的研究表明，BART miRNAs可以通過靶向宿主細(xì)胞或病毒的相關(guān)基因，抑制基因的表達，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，包括維持病毒潛伏感染、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、免疫逃逸甚至放化療敏感性，見表1。本文的目的是對BART miRNAs在EBVaGC發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行總結(jié)，為胃癌患者尋找潛在的治療靶點提供新思路。

1 BART miRNAs對胃癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的影響

部分研究表明BART miRNA在胃癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移中起促進作用。例如，EBV-miR-BART3-3p和EBV-miR-BART11分別靶向TP53[7]和FOXP1[8]促進胃癌細(xì)胞增殖。EBV-miR-BART10-3p，EBVmiR-BART11，EBV-miR-BART17-5p和EBV-miRBART1-3p分別靶向DKK1[9]，F(xiàn)OXP1[10]，KLF2[11]和DAB2[12]促進胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。然而，并不是所有BART miRNA都能促進胃癌細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移，部分研究表明BART miRNA在胃癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移中起負(fù)調(diào)控的作用。EBV-miR-BART1-5p，EBV-miR-BART2-3p和EBV-miR-BART11-3p分別靶向GCNT3[13]，ULK1[14]和eIF4E[15]均抑制了胃癌細(xì)胞的遷移生長。此外，某些BART miRNA靶向不同的宿主基因卻能起到相反的調(diào)控作用，靶向DAB2促進胃癌遷移的EBV-miR-BART1-3p，它在靶向E2F3后卻誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞G0/G1期停滯，抑制了胃癌細(xì)胞的增殖[16]。BART miRNA影響胃癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移能力，因此，通過人為干預(yù)BART miRNA的表達可能可以抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展，最終達到治療的目的。

2 BART miRNAs靶向促凋亡基因/抗凋亡基因

細(xì)胞凋亡是指機體為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在基因的調(diào)控下，細(xì)胞產(chǎn)生主動、有序的死亡。細(xì)胞凋亡由促凋亡基因和抗凋亡基因共同調(diào)控。促凋亡蛋白包括BAD，BID，BIM，PUMA，BAX和BAK等，它們介導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起到了重要的作用。研究顯示EBV-miR-BART5通過靶向抑制促凋亡蛋白PUMA，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞存活[17]。EBV-miR-BART4-5p靶向促凋亡蛋白BID在EBVaGC細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用[18]?？沟蛲龌虬˙CL2，BCL2L2，DDX42和BRUCE等，BART miRNA也可以靶向一些凋亡抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，EBV-miR-BART15-3p通過靶向凋亡抑制劑BRUCE誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制了胃癌細(xì)胞的增殖[19]。這說明BART miRNA可以通過靶向下調(diào)這些與凋亡相關(guān)的基因，影響胃癌細(xì)胞凋亡，改變胃癌細(xì)胞的結(jié)局。

3 BART miRNA參與信號通路

胃癌中miRNA參與Wnt/β-catenin，PTEN/PI3K/AKT，JAK/STAT，NF-κB等多種信號通路的調(diào)控[20-24]。Wnt信號通路在組織胚胎發(fā)育、組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及腫瘤中發(fā)揮重要作用[25]，研究表明EBV-miR-BART10-3p和EBV-miR-BART22同時靶向APC和DKK1，激活Wnt信號通路，促進EBVaGC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[26]。NF-κB信號通路在腫瘤性炎癥中起關(guān)鍵作用[27]，EBV-miRBART11可以通過靶向FOXP1激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，增強腫瘤局部炎癥反應(yīng)，促進胃癌細(xì)胞增殖[8]。BART miRNA參與信號通路的調(diào)節(jié)，通過激活或抑制相應(yīng)的信號通路可以改變胃癌細(xì)胞的表型，從而發(fā)揮促進或者抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。

4 BART miRNA誘導(dǎo)宿主基因甲基化

DNA甲基化是腫瘤最常見的表觀遺傳調(diào)控機制之一，它通常發(fā)生在富含CpG島的啟動子區(qū)域，正常情況下該區(qū)域處于非甲基化狀態(tài)，在癌細(xì)胞中該區(qū)域發(fā)生甲基化阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平降低或轉(zhuǎn)錄沉默。相較于EBV陰性胃癌細(xì)胞（EBV-negative gastric carcinoma，EBVnGC），高甲基化在EBVaGC中更加普遍。宿主基因高甲基化是EBVaGC一個獨特的分子特征，也是導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉默的潛在機制。其中，PIK3CA，ARID1A和CDKN2A基因啟動子在EBVaGC中甲基化的比例較高。有研究證實BART miRNA如EBV-miR-BART19-3p也可以誘導(dǎo)宿主基因WIF1，NLK和APC的啟動子發(fā)生甲基化，增強Wnt通路的活性，促進細(xì)胞的增殖能力，抑制細(xì)胞的凋亡能力[28]。這提示BART miRNA誘導(dǎo)某些宿主基因的高甲基化會促進EBV感染的胃癌細(xì)胞惡性生長，應(yīng)用去甲基化劑5-氮雜胞苷可能可以成為治療的策略。

5 BART miRNA與EMT相關(guān)

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的主要過程是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)樣細(xì)胞，上皮細(xì)胞喪失極性，中斷了細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附作用，從而獲得了較高的轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞間的黏附作用是由E-cadherin維持的，在EMT過程中，E-cadherin在Snail，Twist，ZEB1和ZEB2等轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)變?yōu)镹-cadherin。BART miRNA靶向EMT相關(guān)蛋白在EBVa-GC中發(fā)揮作用，TSAI等[29]人的研究表明EBVmiR-BART9直接靶向EMT相關(guān)蛋白E-cadherin，下調(diào)miR-200a和miR-141的表達，從而促進胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。LI等[30]人的研究表明EBV-miR-BART12直接靶向EMT誘導(dǎo)物Snail，誘導(dǎo)G2/M期停滯，促進胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的增殖和遷移。此外，BART miRNA也可以影響EMT過程，研究表明EBV-miR-BART12與TPPP1結(jié)合并下調(diào)它的表達，進而抑制α-tubulin的乙?；?，促進微管的動態(tài)組裝，重塑細(xì)胞骨架，增強β-catenin的乙?；＆?catenin激活EMT過程，從而促進胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移[31]。EBV-miR-BART6-3p可以靶向和下調(diào)一種長非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）LOC553103，逆轉(zhuǎn)EMT過程抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[32]，LOC553103可以直接結(jié)合STMN1 mRNA的3’-UTR區(qū)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖[33]。了解EMT相關(guān)BART miRNA的作用有助于進一步探索其在胃癌中潛在的治療價值。

6 BART miRNA削弱免疫系統(tǒng)的攻擊

腫瘤免疫逃逸對腫瘤的生存和發(fā)展至關(guān)重要，這有助于它們避免被免疫系統(tǒng)識別和攻擊。PD-L1過表達是EBVaGC一個獨特的分子特征。EBVaGC通過PD-L1/PD-L1通路逃避T淋巴細(xì)胞的免疫監(jiān)視[34]。PD-L1在胃癌細(xì)胞表面形成屏障，與T細(xì)胞表面受體PD-L1相互作用，從而抑制T細(xì)胞的毒性。WANG等[35]人研究表明EBV-miR-BART11和EBV-miR-BART17-3p分別通過靶向FOXP1和PBRM1來上調(diào)PD-L1的表達，從而促進胃癌的免疫逃逸。SYOON等[36]人的研究表明EBV-miRBART5-5p直接靶向PIAS3，并通過EBV-miRBART5-5p/PIAS3/pSTAT3/PD-L1途徑調(diào)控，有助于EBV相關(guān)胃癌細(xì)胞抗凋亡、增殖、侵襲、遷移和免疫逃逸，最終促進胃癌發(fā)生發(fā)展，惡化臨床結(jié)果。這使PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑作為EBVaGC的潛在治療方法成為可能。

7 BART miRNAs改變胃癌細(xì)胞對化療的敏感性

目前，對EBVaGC的治療尚無特殊的方法，手術(shù)切除是大多數(shù)患者獲得根治的唯一可能方法，手術(shù)與一般胃癌相同，且術(shù)后容易復(fù)發(fā)。所以，聯(lián)合放化療仍是胃癌有效的治療手段，胃癌對放化療的耐藥性是胃癌難以治療的重要原因。耐藥性的潛在機制十分復(fù)雜，有研究表明miRNA通過影響藥物外排、細(xì)胞凋亡、自噬、EMT、癌癥干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）和細(xì)胞周期等胃癌細(xì)胞功能調(diào)節(jié)胃癌對化療藥物的敏感性[37-38]。已經(jīng)觀察到BART miRNAs的異常表達可以改變胃癌細(xì)胞對化療的敏感性，EBV-miR-BART20-5p通過直接靶向BAD增加了對5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）和多西紫杉醇的耐藥性[39]。EBV-miR-BART15-3p通過靶向TAX1BP1增加了胃癌細(xì)胞對5-FU的化學(xué)敏感性[40]。TP53可以被EBV-miR-BART5-3p直接靶向抑制，下調(diào)對化療藥物敏感和誘導(dǎo)電離輻射的p53的表達，最終導(dǎo)致加速細(xì)胞周期進程，抑制細(xì)胞凋亡[6]。總之，BART miRNA的異常表達可能改變藥物反應(yīng)，甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥，改善患者的不良預(yù)后。

8 BART miRNA調(diào)節(jié)EBV編碼的基因

BART miRNA可以調(diào)節(jié)EBV編碼基因的表達。EBV有潛伏期和裂解期兩種狀態(tài)，BRLF1和BZLF1這兩個EBV編碼的立即早期基因與EBV感染由潛伏期向裂解期轉(zhuǎn)變密切相關(guān)[41]。研究發(fā)現(xiàn)EBV-miR-BART20-5p通過抑制BAD介導(dǎo)的caspase-3依賴性細(xì)胞凋亡，間接抑制EBV即刻早期基因BRLF1和BZLF1的表達，在維持EBV相關(guān)胃癌的潛伏期和腫瘤持續(xù)性發(fā)展中發(fā)揮重要作用[42]。EBV潛伏膜蛋白LMP1在EBVaGC中不表達，EBV-miR-BART16在EBVaGC中表達豐富，ZHANG等[43]人的研究表明EBV-miR-BART16可能是LMP1在EBVaGC表達缺失的原因，它的表達抑制了細(xì)胞的增殖和存活。這表明，BART miRNA與某些EBV編碼基因具有拮抗作用，它們之間互相形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響胃癌的進展，但具體機制仍需進一步研究闡明。

9 展望

近年來，BART miRNA在EBVaGC中的致病機制已經(jīng)受到了越來越多的關(guān)注，并且取得了許多重大的進展。然而同時存在一些問題：①EBV與胃癌和NPC等上皮細(xì)胞腫瘤密切相關(guān)，部分BART miRNA例如EBV-miR-BART8-3p[44]和EBVmiR-BART13-3p[45]已經(jīng)被證實可以在NPC中促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是它們在胃癌中的作用尚未見報道，還有待于進一步研究;②不同的BART miRNA靶向同一種宿主基因起到的作用不同，同一種BART miRNA靶向不同宿主基因起到的作用也不相同，它們之間存在著復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入研究具體的調(diào)控機制對科研工作者仍是一個巨大的挑戰(zhàn);③BART miRNA與EBVaGC治療的關(guān)系均停留在基礎(chǔ)研究階段，在應(yīng)用于臨床之前仍需要進行大規(guī)模實驗來進行驗證。胃癌的轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因，這給胃癌的臨床治療帶來了很大的困難。目前尚無胃癌的靶向治療藥物，對BART miRNAs在EBVaGC中的作用機制的總結(jié)有助于理解腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制，可以為EBVaGC的靶點治療提供新的線索。BART miRNA有望成為胃癌潛在的診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物，也可能成為EBVaGC免疫治療的重要靶點。