病原哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株基因組分析

李辰睿，徐榮亮，張小旭，陳東萍，邱于洋，陳偉琴，覃映雪

(集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021)

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)為嗜鹽性革蘭氏陰性菌，隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌屬(Vibrio)，在海洋環(huán)境中廣泛分布，是海水魚蝦養(yǎng)殖過程中常見的條件致病菌[1-4]。受該菌感染后的對蝦通常會出現(xiàn)肌肉白灼、紅腿等癥狀[2，5]，在幼體階段被感染的對蝦死亡率高達100%[6]。哈維氏弧菌還可通過傷口或消化道感染魚體，魚類被感染后通常會出現(xiàn)眼球突出、角膜不透明、充血，腸胃炎，肌肉潰爛，鰭條基部、肛門紅腫等癥狀，更甚者直接死亡[7]。目前已報道哈維氏弧菌可感染的魚類包括大黃魚(Larimichthyscrocea)[8]、鱸魚(Centrupomusundecimalis)[9]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[10]、大西洋牙鲆(Paralichthysdentatus)[11]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[12]等重要海水經(jīng)濟魚類。此外，哈維氏弧菌還可作為機會病原體感染人類，導致腹瀉、敗血癥、中耳炎等[13]。因此，對哈維氏弧菌致病機制的研究受到廣泛關(guān)注。

目前關(guān)于哈維氏弧菌致病機制的研究已取得較大進展。研究發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌的主要毒力因子包括溶血素、胞外酶(如半胱氨酸蛋白酶)、外膜蛋白、脂多糖、酯酶、鐵載體及噬菌體介導的毒力基因等等，這些毒力因子相互協(xié)調(diào)，直接或間接參與致病過程，誘發(fā)對宿主有害的病理反應[14-15]。同時，研究也發(fā)現(xiàn)，不同來源的哈維氏弧菌菌株的毒力存在較大差別，因此有必要對不同菌株的毒力及致病機制進行更為有針對性的研究，以獲得更為有效的防治方法[16]。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，通過全基因組測序開展毒力因子研究已成為揭示病原菌致病機理的重要技術(shù)手段之一[17]。本文以分離自福建海域的患潰瘍病青石斑魚(Epinephelusawoara)病原哈維氏弧菌TS-628菌株為研究對象，對該菌株進行基因組測序及序列分析，預測其基因功能，挖掘毒力相關(guān)基因，以期為哈維氏弧菌致病機制以及哈維氏弧菌病防治技術(shù)的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

哈維氏弧菌TS-628菌株分離自福建海域患潰瘍病的青石斑魚[18]，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 實驗材料

LB培養(yǎng)基(2% NaCl)、TCBS培養(yǎng)基，細菌基因組提取試劑盒。

1.3 菌株的純化與擴大培養(yǎng)

將上述菌株從-80 ℃冰箱中取出，先在TCBS培養(yǎng)基上使用平板劃線法分離單菌落，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取單菌落后接種于LB液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4 菌株基因組DNA提取

使用細菌基因組DNA提取試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司生產(chǎn))，參照說明書中革蘭氏陰性細菌基因組抽提的方法進行相應操作，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA的完整性。

1.5 基因組測序

將電泳檢測合格的DNA樣品送測序公司測序，主要操作步驟如下：采用超聲波破碎儀隨機打斷基因組DNA，收集滿足要求的DNA片段(400～500 bp)，對DNA片段的3’端加堿基A，與3’端帶有T堿基的接頭進行連接，以構(gòu)建合格的基因文庫，完成整個文庫制備。基因組測序采用第二代Illumina Hiseq平臺與第三代 PacBio平臺，每個樣品需同時提供不低于基因組100×的Illumina PE150測序數(shù)據(jù)和100×的PacBio測序數(shù)據(jù)，以避免單純插入10～20 kb片段的PacBio文庫造成小質(zhì)粒(<15 kb)信息的丟失，保證更完整精確的組裝。測序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號PRJNA874896 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA874896)。

1.6 生物信息分析流程

1.6.1 基因組組分分析

使用GennMarkS軟件[19]對基因組進行編碼基因的預測，使用CGView Server[20]繪制基因組圖解。

1.6.2 致病性和耐藥性分析

為從基因組水平了解菌株的毒力因子和耐藥性情況，分別使用致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence factors database，VFDB)對TS-628菌株基因組的毒力因子基因進行鑒定；使用耐藥基因數(shù)據(jù)庫(Comprehensive antibiotic resistance database，CARD)對耐藥基因進行分析；使用Effective T3軟件及在線工具[21]對其分泌系統(tǒng)進行預測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈維氏弧菌TS-628菌株的基因組組裝分析

統(tǒng)計組裝序列的GC含量及reads覆蓋平均深度以分析基因組的GC偏向性及重復序列，分析結(jié)果如圖1所示，菌株TS-628的基因組含量分布趨向一致，GC含量集中在40%～50%的范圍內(nèi)，且圖中沒有明顯橫向區(qū)塊分布，說明此數(shù)據(jù)樣本不存在其他物種污染。測序結(jié)果顯示，TS-628菌株的基因組含2條染色體和2個質(zhì)粒，長度為6.15 Mb，GC含量為44.68%(表1)，共編碼基因5 658個。2個主染色體的基因組長度為5.87 Mb，平均GC含量為44.86%。在2個質(zhì)粒中，1個質(zhì)粒為已知，1個質(zhì)粒為新發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒(表2)。已知質(zhì)粒序列較大，長度為217 kb；新發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒長度為66 kb，其堿基分布為：組裝結(jié)果的GC含量占總基因含量的44.56%，與染色體GC%較為接近。

表1 TS-628菌株基因組組裝結(jié)果Tab.1 The genome assembly results of strains TS-628

表2 TS-628菌株基因組組裝詳情Tab.2 The genome assembly details of strains TS-628

注：散點圖的橫坐標為GC含量，縱坐標為reads覆蓋深度；右、上兩側(cè)直方圖，分別為GC含量、測序深度的滑窗頻數(shù)分布。Notes：The abscissa of the scatter chart is the GC content，and the ordinate is the read coverage depth；the histogram at right and up sides shows the frequency distribution of sliding window of GC content and sequencing depth，respectively.

2.2 基因組圈圖

通過CGView軟件繪制菌株TS-628組裝架構(gòu)的基因組圈圖(圖2)，發(fā)現(xiàn)新發(fā)現(xiàn)質(zhì)?？傞L度為66 335 bp，不存在tRNA基因。根據(jù)CG View圖的COG注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒B(圖2D)含功能基因種類較少，在二十六類基因功能中，關(guān)于胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌和小泡運輸?shù)南嚓P(guān)基因最多，此類蛋白基因與菌株介導生物膜內(nèi)外化學的化學物質(zhì)及信號交換有密切聯(lián)系；其次是關(guān)于復制、重組和修復的相關(guān)基因，此類蛋白基因會影響菌株穩(wěn)定遺傳和基因的損傷修復。此外，新發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒還含有少量關(guān)于轉(zhuǎn)錄、細胞周期控制、細胞分裂和染色體分裂以及碳水化合物轉(zhuǎn)運代謝的相關(guān)基因，并且占其基因組比例約10%的蛋白基因具有的潛在的生物學功能未被注釋到數(shù)據(jù)庫中。

注：圖2A為染色體1；圖2B為染色體2；圖2C為質(zhì)粒A；圖2D為質(zhì)粒B。從內(nèi)圈到外圈，第1圈代表基因組全長；第2圈表示GC skew，其中綠色表示G-C>0，紫色則相反，綠色和紫色的交接處分別表示復制起始點和終止點；第3圈黑色表示GC含量，峰值向外突出的部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量，向內(nèi)則相反；第4圈和第5圈分別表示正、負鏈上的基因，其中包括tRNA、rRNA、CDS和其他基因。Notes:Figture 2A is chromosome 1；Figture 2B is chromosome 2；Figture 2C is plasmid A；Figture 2D is plasmid B.From the inner circle to the outer circle，the first circle represents the total length of the genome；the second circle represents the GC skeleton，where green represents G-C>0，while purple represents the opposite，the intersection of green and purple represents the start point and end point of replication，respectively；the black in the third circle indicates the GC content，and the protruding part of the peak indicates that the GC content in this region is higher than the average GC content of the whole genome，while the opposite is true inward；the fourth and fifth circles respectively represent genes on the positive and negative chains，including tRNA，rRNA，CDS and other genes.

質(zhì)粒A(圖2C)含有的功能基因種類也較少，主要有關(guān)于復制、重組和修復，以及無機離子轉(zhuǎn)運代謝和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌和小泡運輸?shù)南嚓P(guān)基因。2個染色體(圖2A、圖2B)含有的功能基因種類較為豐富，主要包括能量生成和轉(zhuǎn)換，氨基酸轉(zhuǎn)運代謝，碳水化合物轉(zhuǎn)運代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成以及細胞運動相關(guān)基因，這些種類的蛋白基因與菌株的各類生命活動密切相關(guān)，影響著細菌的能量供應、物質(zhì)代謝與穩(wěn)定傳代。

2.3 基因組組分分析

根據(jù)基因長度分布圖結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)長度低于200 bp的基因數(shù)量較少，共有200個；在200 bp至1 000 bp的長度區(qū)間內(nèi)，各長度基因數(shù)量差距較小，平均基因數(shù)量為432個，基因長度分布集中在大于1 000 bp，有2 003個(圖3)，約占編碼基因的35.4%。

2.4 毒力基因預測

將哈維氏弧菌TS-628基因組序列通過VFDB數(shù)據(jù)庫進行比對，預測TS-628菌株共有毒力基因747個，其中附著類相關(guān)的毒力基因數(shù)量最多為132個，鐵攝取相關(guān)的毒力基因數(shù)量為130個，分泌系統(tǒng)相關(guān)的毒力基因數(shù)量為107個，抗吞噬類的毒力相關(guān)基因數(shù)量為36個，調(diào)控相關(guān)的毒力相關(guān)基因數(shù)量為35個，細菌毒素的毒力相關(guān)基因數(shù)量為30個，其他類型的毒力相關(guān)基因數(shù)量均小于30個(表3、圖4)。

表3 毒力基因預測分類表Tab.3 The prediction and classification of virulence genes

2.5 分泌系統(tǒng)及調(diào)控系統(tǒng)分析

根據(jù)預測結(jié)果，TS-628存在多種分泌系統(tǒng)，按照分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的數(shù)量進行分析，TS-628的分泌系統(tǒng)應以Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型和Sec-SRP型為主(表4、圖5)。同時該菌株具有多個雙組份調(diào)控系統(tǒng)(表5)，其中包含149個調(diào)控子、63個感應子以及30個具有混合功能的雙組分調(diào)控基因。

表4 分泌系統(tǒng)分類統(tǒng)計表Tab.4 The classification and statistics of secretory system

表5 雙組分調(diào)控分類統(tǒng)計表Tab.5 The statistics of two-component regulation classification

注：分泌系統(tǒng)通路圖對每個樣本中所有分泌系統(tǒng)的圖示化展示。其中紅色框標記的是在該樣本中預測到的分泌系統(tǒng)相關(guān)基因。Notes：The secretory system pathway diagram is a graphical representation of all secretory systems in each sample.The red box marks the genes related to the secretion system predicted in the sample.

2.6 耐藥基因預測

通過CARD進行比較、注釋，將讀數(shù)直接映射至參考數(shù)據(jù)庫來預測耐藥性決定因素。結(jié)果預測TS-628共攜帶耐藥基因294個，至少對11種抗生素耐藥。耐藥基因預測分類統(tǒng)計見圖6。TS-628對四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、氟喹諾酮和青霉素4類抗生素具有較多抗性基因。此外，對氯霉素類、頭孢菌素類、糖肽類、三氯生類、氨基糖苷類等其他至少7類抗生素有抗性基因。

3 討論

3.1 基因組概況分析

在基因高效、快速的探索中，基因組測序技術(shù)已被廣泛運用。如徐先棟[22]利用全基因組測序技術(shù)對華南海水養(yǎng)殖地區(qū)哈維氏弧菌GDH11385進行了測定，并對該菌株基因組序列進行了基因組注釋、基因功能分類、細菌關(guān)鍵毒力基因等分析，為哈維氏弧菌病的防治研究提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

一般對于原核生物細菌而言，基因組的序列越長，表達的蛋白越多。目前在NCBI的數(shù)據(jù)庫中已公布24株哈維氏弧菌的全基因組序列，如Wang Z等[23]于2015年公布的V.harveyiATCC 33843的基因組全長5.881 490 Mb，表達基因數(shù)量為5 332個。Moriyama E N等[24]的研究顯示原核生物較長的基因長度會表現(xiàn)出對高效翻譯密碼子的偏好，可改善翻譯效率，進而影響細菌對環(huán)境的適應性。本研究TS-628的序列大小比多數(shù)公布序列大，為6.151 198 Mb，編碼基因數(shù)量為5 658個，且基因長度分布集中在大于1 000 bp，約占編碼基因的35.4%，綜合分析認為TS-628菌株的長基因序列增強了該菌株對環(huán)境變化的適應性，可能具有更為復雜的生理生化等功能。

質(zhì)粒是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子。質(zhì)粒天然存在于某些生物體細胞中，一個細胞里可同時有一種或多種質(zhì)粒存在。Tao Y等[25]的實驗表明大腸桿菌的質(zhì)粒上含有抗四環(huán)素基因；Levinson B L等[26]和Singer J T等[27]均發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶的基因可以賦予細胞額外的生理代謝能力，提高細菌的致病力。本研究的哈維氏弧菌TS-628菌株的基因組共含2條染色體和2個質(zhì)粒，其中1個質(zhì)粒為新發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，長度為66 kb。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，菌株TS-628的2個主染色體攜帶關(guān)于各類物質(zhì)合成和代謝相關(guān)的基因數(shù)量較多，推測2個染色體影響著細菌的自身生長和繁殖，新發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶接合轉(zhuǎn)運與復制重組的相關(guān)基因較多，推測該質(zhì)粒對細菌生物膜形成、驅(qū)動細菌菌株適應環(huán)境和快速進化[28]以及在細菌感染宿主的過程中的快速繁殖穩(wěn)定傳代方面有重要意義。

3.2 毒力因子分析

哈維氏弧菌的致病性與多種毒力因子有關(guān)，包括鐵攝取系統(tǒng)、群體感應機制、類細菌素物質(zhì)、對噬菌體感染的敏感性等毒力因子[29-30]，研究哈維氏弧菌的致病及耐藥基因?qū)榇_定其致病及耐藥機制提供重要的基礎(chǔ)。VFDB數(shù)據(jù)庫整合了病原細菌毒力因子信息，通過數(shù)據(jù)庫注釋可獲得每個樣本中含有的毒力基因信息。

已有研究發(fā)現(xiàn)，在哈維氏弧菌的致病機制中，宿主物種不同會影響菌株毒力菌株的變異性[31]。在NCBI數(shù)據(jù)庫已公布全基因組序列的24株菌株中，只有少數(shù)菌株進行了關(guān)于毒力機制的分析，其中菌株QT-520[32]分離自中國橋頭深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，其含有附著類、抗吞噬類、毒素相關(guān)的毒力基因數(shù)量較多；菌株345[33]分離自中國深圳養(yǎng)殖污染區(qū)的感染石斑魚，含有附著類、免疫逃避、運動性相關(guān)、分泌類毒力基因數(shù)量較多；本研究表明哈維氏弧菌TS-628基因組攜帶多種與調(diào)節(jié)細菌黏附作用、細菌持續(xù)感染和營養(yǎng)代謝等相關(guān)的毒力因子。通過對比分析發(fā)現(xiàn)(表6)，分離自不同魚類的哈維氏弧菌均具有2條染色體，而具有的質(zhì)粒數(shù)量有所不同。3株不同種類宿主的哈維氏弧菌的主要毒力因子類型也有一定差別，其中與附著相關(guān)的毒力基因在3株菌株中均存在，說明附著相關(guān)毒力因子在哈維氏弧菌致病過程普遍發(fā)揮作用，鐵攝取和分泌相關(guān)基因也是病原性哈維氏弧菌較常見的毒力因子。

表6 3株哈維氏弧菌主要毒力因子比較分析表Tab.6 Comparative analysis table of the main virulence factors of 3 strains of V.harveyi

病原菌入侵宿主是引起疾病感染的首要條件，其首先黏附于宿主體表，才能達到增殖、感染的目的。研究已發(fā)現(xiàn)菌毛[34]、外膜蛋白[35]、血凝素[36]等物質(zhì)參與黏附作用。本研究TS-628的附著類相關(guān)毒力基因有132個(17.7%)，為預測毒力基因數(shù)量最多的一類，推測該菌可通過增強黏附能力而在感染早期便對宿主進行黏附。

鐵元素是大多數(shù)微生物生存所必需的重要營養(yǎng)元素。鐵離子不僅是許多基礎(chǔ)代謝通路的輔助因子，還是合成許多關(guān)鍵代謝酶類所必需的金屬元素輔基，可與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，參與DNA合成、基因調(diào)控、電子傳遞等生命活動過程[37-38]。細菌在宿主體內(nèi)的生存和毒力發(fā)揮都離不開鐵，但環(huán)境中游離的鐵離子濃度遠低于其生長代謝所需的濃度[39]，故鐵元素是病原菌和宿主必須爭奪的一種重要營養(yǎng)元素。鐵載體(Siderophores)是由細菌和真菌在低鐵環(huán)境中所產(chǎn)生的一類可與鐵離子特異性結(jié)合的螯合劑，與致病微生物的毒力機制有關(guān)。Naka H等[40]發(fā)現(xiàn)鐵載體能夠幫助病原菌從宿主的鐵結(jié)合蛋白上攝取鐵，并可通過特異性的細胞膜受體和內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將鐵運輸至細胞中并協(xié)助細菌生長代謝。本研究TS-628的鐵攝取相關(guān)毒力基因有130個(17.4%)，推測其在感染過程中會通過增強各類鐵攝取系統(tǒng)的表達，掠奪宿主體內(nèi)的鐵元素及含鐵蛋白，一方面有利于自身存活與繁殖，另一方面對宿主產(chǎn)生毒害，影響宿主體內(nèi)的需鐵代謝，從而導致感染的發(fā)生。

細菌分泌系統(tǒng)是一種重要的毒力因子，可將各種細菌毒力因子轉(zhuǎn)運到細菌細胞外，并具有與所處環(huán)境交流的功能。目前已發(fā)現(xiàn)8大細菌分泌系統(tǒng)[41]，如T1SS主要分泌黏附素、蛋白酶以及毒力因子等各種蛋白質(zhì)到宿主細胞中[42]。哈維氏弧菌一般含有4至5種分泌系統(tǒng)，如Huang W等[43]測得的分離自石斑魚體內(nèi)的致病哈維氏弧菌菌株ZJ0603基因草圖數(shù)據(jù)中顯示其含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型分泌系統(tǒng)，Espinoza-Valles I等[44]等對分離自對蝦體內(nèi)的致病哈維氏弧菌菌株CAIM1792進行測序，也得到相同結(jié)果。本研究對哈維氏弧菌TS-628基因組進行毒力基因篩查，發(fā)現(xiàn)其和哈維氏弧菌菌株ZJ0603、CAIM1792一樣，均含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型5種細菌分泌系統(tǒng)，同時，按照分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的數(shù)量分析，TS-628的分泌系統(tǒng)應以Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型和Sec-SRP型為主。

Ⅱ型分泌系統(tǒng)(T2SS)的分泌底物主要是蛋白酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和各種外毒素等[45-50]。T2SS將分泌底物從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到周質(zhì)空間后，再將底物分泌到細胞表面或細胞外環(huán)境中，參與生物膜的形成、養(yǎng)分的攝取、定植和入侵，繼而賦予細菌生存優(yōu)勢、參與細菌的致病機制[51]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是許多致病性革蘭氏陰性菌的關(guān)鍵毒力因子[52-54]，可在轉(zhuǎn)移效應分子以及改變宿主免疫反應方面發(fā)揮作用。T3SS通過直接將細菌胞漿毒力蛋白注入宿主細胞而參與到細菌的致病機制中[55]。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)的尾部復合物中具有一尾鞘結(jié)構(gòu)，可刺穿宿主細胞壁和細胞膜，直接進入宿主細胞質(zhì)中釋放毒性效應蛋白，在細菌竟爭和侵染寄主發(fā)病方面有重要作用[56-58]。鑒于此，推測哈維氏弧菌TS-628菌株可通過破壞宿主黏膜、免疫系統(tǒng)以及影響宿主生物膜形成等方式產(chǎn)生致病作用。

4 結(jié)論

本文通過基因組測序和基因組功能注釋分析獲得了哈維氏弧菌TS-628的基因組組成、毒力因子和耐藥因子等信息。該菌株基因組長度約為6.15 Mb，GC含量為44.68%，共編碼5 658個基因，共有2條主染色體、2個質(zhì)粒(其中1個為新發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒)。預測共有毒力基因747個，耐藥基因294個，存在多個分泌系統(tǒng)，具有多個雙組份調(diào)控系統(tǒng)。根據(jù)基因組信息推測，哈維氏弧菌TS-628菌株可能首先通過強大的黏附能力黏附到宿主上，再通過分泌系統(tǒng)等毒力因子對宿主細胞和組織造成損傷，進而突破宿主皮膚、黏膜生理屏障，之后通過各類鐵攝取系統(tǒng)與宿主競爭鐵等重要元素，在宿主機體內(nèi)定植、繁殖和擴散，最終引發(fā)疾病的產(chǎn)生。