磁分離結(jié)合qPCR快速檢測(cè)醬鹵肉中的沙門氏菌

潘暉，許銀*，王小紅，丁一峰，王世雙，龔芳，鐘聲揚(yáng)

（1.荊州市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北荊州 434000）（2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科技學(xué)院，湖北武漢 430070）

食源性疾病是一項(xiàng)重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，粗略估算我國(guó)一年發(fā)生2.1億人次以急性胃腸炎為典型癥狀的食源性疾病，2018年監(jiān)測(cè)到食源性疾病事件6 537起，涉及患者41 750人，死亡135人。因微生物引起的食源性疾病者達(dá)到12 226人，其中沙門氏菌感染導(dǎo)致的疾病位列微生物食源性疾病第二位[1]。美國(guó)每年有900萬人罹患食源性疾病，56 000人住院，1 300人死亡[2]，根據(jù)美國(guó)CDC數(shù)據(jù)，2009至2018年期間監(jiān)測(cè)到8,131起疫情，131 525起食源性疾病，其中5 986（74%）人有確診或疑似病因，在確診或疑似病因中沙門氏菌位列第2（諾如病毒2 798，47%；沙門氏菌1 191，20%；細(xì)菌毒素617，10%和STEC O157150，3%）[3]。當(dāng)前多數(shù)研究把沙門氏菌列為除大腸桿菌O157:H7以外重點(diǎn)關(guān)注的病原體[4]。

沙門氏菌作為世界第二大食源性致病菌，是一種常見的食源性革蘭氏陰性致病菌[5,6]，在生鮮類產(chǎn)品中檢出率較高，特別是雞肉和豬肉中[7,8]，是食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象之一，消費(fèi)者食用了被沙門氏菌感染的食物后，4~48 h發(fā)病，因此開發(fā)靈敏、特異性的沙門氏菌快檢方法，對(duì)沙門氏菌引起的食源性食品安全事故進(jìn)行早識(shí)別早預(yù)警一直是食品安全監(jiān)督領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的問題。

目前國(guó)內(nèi)食品中沙門氏菌快速檢測(cè)方法主要分為免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和生物傳感器法。在一定程度上縮短了沙門氏菌的檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，但也面臨一些挑戰(zhàn)，例如上述方法均不能有效區(qū)分死細(xì)菌和活細(xì)菌。免疫學(xué)方法存在抗體生產(chǎn)成本高、批次不穩(wěn)定、易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問題，免疫磁分離技術(shù)（Immunomagnetic Separation，IMS）可在磁性微球上鍵合功能分子（抗體），與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)病原菌的分離與富集，一定程度上可取代增菌培養(yǎng)，但I(xiàn)MS也存在一定局限性，抗體對(duì)免疫磁分離效果影響極大，且易產(chǎn)生抗藥性，篩選長(zhǎng)效的特異性靶抗體[9,10]是研究的關(guān)鍵要素。細(xì)菌噬菌體（簡(jiǎn)稱為噬菌體）[11]可有效克服上述檢測(cè)方法的不足。噬菌體是世界上數(shù)量最龐大的非細(xì)胞生命，是分布極廣的特異性感染細(xì)菌的病毒。噬菌體作為寄生于細(xì)菌的病毒，對(duì)宿主細(xì)胞具有特異性[12,13]。噬菌體侵染寄主細(xì)胞的吸附識(shí)別是噬菌體編碼的受體結(jié)合蛋白與細(xì)菌表面受體發(fā)生特異性結(jié)合的過程，受體的性質(zhì)隨噬菌體而異，對(duì)其他種、型不發(fā)揮作用[14-17]。

本研究構(gòu)建了基于噬菌體的磁分離探針，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）快速準(zhǔn)確檢測(cè)沙門氏菌的方法，可有效區(qū)分死細(xì)菌和活細(xì)菌，通過引入噬菌體磁性顆粒（Phage T102 Magnetic Beads，pMB）復(fù)合物，利用超順磁顆粒的特性，借助外加磁場(chǎng)提高了在食品檢測(cè)中，高蛋白、高鹽、高糖的復(fù)雜樣品基質(zhì)中沙門氏菌的分離富集效率；驗(yàn)證了以鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028特異性噬菌體T102為新型分子識(shí)別物[18,19]，利用噬菌體磁分離偶聯(lián)物對(duì)樣品中的沙門氏菌進(jìn)行分離富集，結(jié)合qPCR方法進(jìn)行快速檢測(cè)，靈敏度高于部分文獻(xiàn)報(bào)道[20]；同時(shí)選取300批市售的醬鹵肉樣品進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果與GB 4789.4-2016進(jìn)行了比對(duì)。該研究結(jié)果可為完善沙門氏菌的快檢方法提供參考依據(jù)，并且擴(kuò)展了噬菌體在食品安全中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料原料

1.1.1 菌株和樣品

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門氏菌噬菌體T102，食品安全監(jiān)管抽檢樣品。

1.1.2 儀器和試劑

TS-100B恒溫?fù)u床、雙人超凈工作臺(tái)、BKQ-B50II立式滅菌器，山東博科消毒設(shè)備有限公司；SPX-150型生化培養(yǎng)箱，惠科電子有限公司；BD PhoenixTM全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；DTD-3R超聲波清洗機(jī)，湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司；HH數(shù)顯三用恒溫水箱，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；PuriMagTM磁分離器，普睿邁格生物科技有限公司；MiniQ-10PC迷你離心機(jī)、MiniQ-4C離心機(jī)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；MiniOpticon雙色熒光定量PCR儀，伯樂生物科技有限公司；CF16RN高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司。

LB肉湯、LB瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PuriMagTMG-COOH羧基磁珠，普睿邁格生物科技有限公司；EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽）、NHS（N-羥基硫化琥珀酰亞胺鈉鹽），上海麥克林生化科技有限公司；MES（2-嗎啉乙磺酸）緩沖液、PBS緩沖液、BSA，北京索萊寶科技有限公司；沙門氏菌熒光定量PCR試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食品中沙門氏菌的富集與分離

1.2.1.1 宿主菌株復(fù)蘇與培養(yǎng)

將凍存的鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）在LB液體培養(yǎng)基平板上劃線37 ℃培養(yǎng)活化12 h，然后在LB固體平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)1~2 d。挑取單個(gè)典型菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃（180 r/min）培養(yǎng)6 h，用稀釋平板計(jì)數(shù)法確定細(xì)菌數(shù)，菌液4 ℃保存，備用。

1.2.1.2 噬菌體活化

將T102噬菌體（0.1 mL）和活化后的沙門氏菌液（0.1 mL）在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩（160 r/min）活化12 h，離心（9 000 r/min）15 min，0.22 μm濾膜過濾，收集濾液，梯度稀釋噬菌體菌液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 pMB（噬菌體納米磁珠）的制備

取100 μL超聲重懸后的羧基磁珠液（10 mg/mL，200 nm）于2 mL EP管中，用MES（50 mmoL/L）洗滌兩次并重懸，磁力架回收磁珠，加入80 μL EDC（50 mg/mL）、80 μL NHS（50 mg/mL）、240 L MES（50 mmoL/L），在37 ℃（180 r/min）活化30 min，磁分離3 min，用等體積的PBS（10 mg/mL）沖洗磁珠2次后重懸，加入1 mL噬菌體，4 ℃孵化12 h。吸推移液槍頭偶聯(lián)噬菌體納米磁珠，加入500 μL BSA（5.0%），37 ℃（180 r/min）封閉30 min，舍封閉液，準(zhǔn)確加入1 mL PBS緩沖液，重懸得到1 mg/mL的偶聯(lián)磁珠液，保存于4 ℃，備用。

1.2.1.4 pMB富集分離沙門氏菌

稱取25 g樣品于225 mL BPW中均質(zhì)，取100 μL樣液，加入25 μL噬菌體-磁珠偶聯(lián)液，37 ℃（180 r/min）反應(yīng)20 min富集待測(cè)樣品中的沙門氏菌，通過磁力架回收納米磁珠。取偶聯(lián)混合稀釋液及宿主沙門氏菌稀釋液（102CFU/mL級(jí)）進(jìn)行涂布，計(jì)算捕獲率C。

式中：

C——噬菌體捕獲率，%；

S——沙門氏菌菌數(shù)，個(gè)；

P——偶聯(lián)混合液菌數(shù)，個(gè)。

1.2.2 qPCR測(cè)定沙門氏菌

采用熱裂解法（沸水浴10 min）提取噬菌體納米磁珠富集的沙門氏菌DNA。根據(jù)GenBank中公布的沙門氏菌的invA基因序列，選定上游引物：5-gtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3，下游引物：5-tcatcgcaccg tcaaaggaacc-3[21-23]。qPCR反應(yīng)參數(shù)見表1、表2。

表1 qPCR擴(kuò)增體系Table 1 qPCR amplification system

表2 qPCR反應(yīng)參數(shù)Table 2 qPCR parameters

1.2.3 噬菌體納米磁珠結(jié)合qPCR用于食品沙門氏菌的定量分析

稱取25 g均質(zhì)后陰性樣品，200 ℃滅菌30 min，加入1 mL 109沙門氏菌液參照1.2.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度平行測(cè)定2次。計(jì)算本方法的檢出限、精密度及線性范圍。

1.2.4 300 批次對(duì)比實(shí)驗(yàn)

選取食品安全抽檢樣品300批，與GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用WPS和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，利用Origin軟件進(jìn)行作圖。P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌富集與分離效率評(píng)價(jià)

2.1.1 噬菌體效價(jià)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)室自制（4 ℃保存6個(gè)月）的T102噬菌體測(cè)定效價(jià)為2.7×109PFU/mL，可滿足實(shí)驗(yàn)需要。如圖1所示。

圖1 （a）10-7沙門氏菌和（b）10-5噬菌體Fig.1 (a) 10-7Salmonella and (b) 10-5 Bacteriophage

2.1.2 沙門氏菌捕獲率

在100 μL梯度稀釋的沙門氏菌液中，加入25 μL偶聯(lián)磁珠液（10-5）進(jìn)行富集條件試驗(yàn)，用平板涂布實(shí)驗(yàn)計(jì)算捕獲率以確定濃度范圍。如圖2所示，結(jié)果表明：當(dāng)沙門氏菌的濃度小于106CFU/mL（10-3），捕獲率大于80.0%，可滿足檢測(cè)需求。當(dāng)沙門氏菌濃度為102CFU/mL（10-7）時(shí)，捕獲率達(dá)到100%。

圖2 不同濃度沙門氏菌磁分離實(shí)驗(yàn)的捕獲率Fig.2 Capturerate of Salmonella in magnetic separation experiments with different concent rations

2.2 噬菌體磁分離結(jié)合qPCR檢測(cè)沙門氏菌

以鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028為宿主菌，噬菌體T102為特異性分子識(shí)別物，探究了Rahn K針對(duì)沙門氏菌invA基因設(shè)計(jì)引物的可靠性，選取腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌、檸檬酸桿菌等常見細(xì)菌作為沙門氏菌的干擾物進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明本方法有良好的特異性。其中沙門氏菌Ct值為16.98（n=2，16.83、17.13），其他細(xì)菌Ct值在25~30之間，有顯著差異，如圖3A所示；沙門氏菌熔解曲線峰值86.68，其他細(xì)菌熔解曲線峰值均大于88，差值大于1如圖3B所示。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。其中陽(yáng)性對(duì)照以沙門氏菌為DNA模板，陰性對(duì)照以ddH2O為DNA模板，空白對(duì)照不加模板DNA，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染或形成引物二聚體等。

圖3 （A）不同細(xì)菌的循環(huán)曲線圖和（B）不同細(xì)菌的熔解曲線峰值圖Fig.3 (A) Circulation curvediagram of different bacteria and (B)Peak melting curvediagram of different bacteria

對(duì)本實(shí)驗(yàn)的靈敏度進(jìn)行評(píng)估，以沙門氏菌最小可檢出濃度定義檢出檢出限，沙門氏菌濃度為102CFU/mL時(shí)，Ct值為37.59，本方法檢測(cè)限為100 CFU/mL即0.1 CFU/PCR反應(yīng)。如圖4b所示。同其他方法比較見表3，本實(shí)驗(yàn)特異性為91.2%，結(jié)果見表4。

圖4 （a）不同濃度沙門氏菌熔解分離實(shí)驗(yàn)與Ct值的線性關(guān)系圖；（b）不同濃度沙門氏菌磁分離實(shí)驗(yàn)的循環(huán)曲線圖；（c）不同濃度曲線峰值圖Fig.4 (a) The linear relationship between magnetic separation test and Ct values of Salmonella at different concentrations (b)Cyclic curves of magnetic separation experiments for Salmonella at different concentrations; (c) Peak diagram of melting curve for magnetic separation experiments of Salmonella with different concentrations

表3 4種方法檢測(cè)時(shí)間與檢出限的對(duì)比Table 3 Comparison of detection time and detection limit of four methods

表4 快檢方法的特異性率Table 4 The specificity rate of the rapid detection method

提取梯度稀釋的沙門氏菌DNA，取1 μL進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙門氏菌在102~109CFU/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，如圖4c所示線性方程為y=44.14-3.29X，（X=lg[沙門氏菌(CFU/mL)]，R2=0.999）。對(duì)106CFU/mL級(jí)別濃度進(jìn)行測(cè)定（n=4），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%，結(jié)果見表5。

表5 沙門氏菌的精密度測(cè)定Table 5 Precision determination of Salmonella

注：方法1為GB 4789.4-2016；方法2為TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)沙門氏菌能力驗(yàn)證樣品的快速檢測(cè)與鑒定；方法3為多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)檢測(cè)冷凍蔬菜中4種食源性致病菌[24]。

2.3 結(jié)果驗(yàn)證

隨機(jī)選取食品安全監(jiān)督抽檢樣品（含醬鹵肉制品、雞蛋、飲料等）300批（見表6）樣品進(jìn)行檢測(cè)，按照GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》對(duì)沙門氏菌進(jìn)行預(yù)增菌、增菌，得到7株疑似沙門氏菌菌株，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒別，發(fā)現(xiàn)均不是沙門氏菌，鑒定結(jié)果見表7。檢測(cè)結(jié)果超過96 h。

表6 300批樣品明細(xì)Table 6 Details of 300 batches of samples

表7 7株細(xì)菌的來源及鑒定結(jié)果Table 7 Sources and identification results of 7 strains of bacteria

隨后對(duì)抽檢樣品按本快檢方法進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（如圖5），本方法從環(huán)境樣本中分離純化得到沙門氏菌噬菌體，使之與納米磁珠偶聯(lián)，基于沙門氏菌復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)[菌體（O）、鞭毛（H）和表面（Vi）]，通過外磁場(chǎng)作用，沙門氏菌抗原與包被在超順磁納米磁珠表面的沙門氏菌噬菌體抗體進(jìn)行特異性結(jié)合。在外磁場(chǎng)的作用下，使食品中沙門氏菌活體跟隨噬菌體免疫磁珠滯留在磁場(chǎng)中，不含沙門氏菌的非磁性樣品溶液被舍棄，從而實(shí)現(xiàn)食品中沙門氏菌的富集與分離。準(zhǔn)確檢測(cè)到添加至樣品中的標(biāo)準(zhǔn)沙門氏菌菌液，同時(shí)探究了針對(duì)沙門氏菌invA基因設(shè)計(jì)引物的可靠性。

圖5 （A）模擬實(shí)驗(yàn)循環(huán)曲線圖和（B）模擬實(shí)樣品+標(biāo)+偶聯(lián)磁珠熔解曲線峰值圖Fig.5 (A) Cyclecurve of simulated experiment and (B) Peak diagram of melting curve of simulated experiment

需要指出的此次批量檢測(cè)的樣品對(duì)象不含生鮮畜禽肉，主要為餐飲環(huán)節(jié)中現(xiàn)場(chǎng)制售的醬鹵肉制品以及少量雞蛋和飲料，沒有檢測(cè)到沙門氏菌。研究團(tuán)隊(duì)查閱了國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理局官網(wǎng)公布的2019~2021年公布的食品安全抽檢數(shù)據(jù)，在公布的84 345批次抽檢中僅有1批次檢出沙門氏菌，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)300批次樣品沙門氏菌零檢出結(jié)果的可靠性。沙門氏菌零檢出率可能與抗生素過度使用及近年來嚴(yán)格的食品安全監(jiān)管有關(guān)。值得注意的是在300批樣品中，在豬腳、飲料等樣品中篩出7例菌株，建議監(jiān)管及衛(wèi)健部門予以關(guān)注。

3 結(jié)論

自然界廣泛存在的噬菌體為病原菌微生物的特異性檢測(cè)提供了天然的寶庫(kù)，噬菌體在活菌體內(nèi)專一快速繁殖，能有效區(qū)分活菌與死菌。從環(huán)境樣本中分離純化得到的沙門氏菌噬菌體抗體，與待測(cè)樣品中的沙門氏菌活體菌抗原進(jìn)行專屬性結(jié)合，以滿足檢測(cè)需求。但由于食品組分相對(duì)復(fù)雜，高鹽、高糖和高蛋白基質(zhì)不利于目標(biāo)病原菌沙門氏菌的富集，因此在檢測(cè)中為提高靈敏度一般需要進(jìn)行增菌，增加了檢測(cè)時(shí)間。

納米磁珠與噬菌體的結(jié)合較好到解決了這一難題，當(dāng)磁性納米顆粒小于其極限尺寸（如Fe3O4＜30 nm）后成為單疇顆粒，單疇顆粒集合體內(nèi)總磁化強(qiáng)度為零，在有外加磁場(chǎng)存在時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)且有序的磁性，這一特性使得磁性納米顆粒能夠在外磁場(chǎng)的作用下方便定向分離并聚集，當(dāng)外磁場(chǎng)消失后磁性納米顆粒又能在均勻地分散到待測(cè)樣品中，在納米磁珠表面鍵合沙門氏菌噬菌體抗體，在外加磁場(chǎng)的作用下能定向?qū)崿F(xiàn)抗體抗原的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品中沙門氏菌的分離與富集，從而減少預(yù)增菌及增菌環(huán)節(jié)。

該項(xiàng)目提供的噬菌體磁分離結(jié)合qPCR快速檢測(cè)沙門氏菌方法可以作為傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的一個(gè)有力的補(bǔ)充，在實(shí)際食品微生物檢驗(yàn)工作中，用qPCR結(jié)合噬菌體磁分離方法對(duì)樣品進(jìn)行初篩，得到陽(yáng)性樣品后再用傳統(tǒng)方法進(jìn)行驗(yàn)證，可以大大減輕工作量，提高工作效率，縮短檢測(cè)時(shí)間。