等離子體活化乳酸溶液對常見食源性致病菌的殺滅效果

李佳鴻，嚴(yán)龍飛，戴凡煒，陳敏惠，王玲，陳飛平，羅政，葉明強*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）（2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

食源性致病菌污染是我國食品安全的重要危害之一。我國每年都會發(fā)生由大腸埃希氏菌、沙門氏菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌等引起的食物中毒事件，嚴(yán)重危害我國人民健康和食品安全[1]。在食品從原料生產(chǎn)到終端消費的過程中，其生產(chǎn)、運輸、加工、銷售等環(huán)節(jié)均易受到不同程度的致病菌污染，從而導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生，危害消費者健康。

等離子體冷殺菌技術(shù)是近年來新興的一種非熱殺菌技術(shù)，具有安全清潔、綠色環(huán)保、簡單高效等特點，在食品安全領(lǐng)域備受關(guān)注。等離子體活化水（Plasma-Activated Water，PAW）是通過等離子體發(fā)生裝置在水表面或水下進行等離子體放電處理后制得富含活性基團的水溶液[2,3]。因等離子體活化水具有良好的流動性、無毒無殘留等優(yōu)點，相較于大氣壓等離子體冷殺菌技術(shù)在食品領(lǐng)域更受學(xué)者青睞。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對等離子體活化水的滅菌機理、理化性質(zhì)、生產(chǎn)應(yīng)用均有報道，康超娣[4]研究發(fā)現(xiàn)P.deceptionensisCM2經(jīng)活化60 s的PAW處理6 min后可滅活3.43 lg CFU/mL的細(xì)菌；鉏曉艷等[5]研究發(fā)現(xiàn)活化60 min的PAW處理30 min后對巴氏葡萄球菌的抑菌率為95.25%；汪家權(quán)等[6]發(fā)現(xiàn)用活化60 min的PAW處理金黃色葡萄球菌生物膜30 min后能滅活約4.8個對數(shù)值的細(xì)菌。

乳酸是自然界中廣泛存在的有機酸，被公認(rèn)為天然抗菌劑，美國食品及藥物管理局認(rèn)定其為“公認(rèn)安全的”，常用于冷鮮肉、新鮮果蔬等食品的抑菌保鮮以及食品加工中[7,8]。Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)用40 ℃、1%乳酸清洗染菌菠菜幼葉5 min，可有效殺滅2.7個對數(shù)值的大腸桿菌O157:H7；Youssef等[10]研究發(fā)現(xiàn)使用2%～5%的乳酸可以有效抑制牛肉表面的大腸埃希氏菌的生長；Mahmoud[11]研究發(fā)現(xiàn)用150 mg/mL的乳酸溶液浸泡牡蠣10 min后可使牡蠣表面的創(chuàng)傷弧菌降低至檢測限以下；Aline等[12]研究發(fā)現(xiàn)5%乳酸在染菌雞皮貯藏期間能有效抑制空腸彎曲桿菌和腸炎沙門氏菌的生長。

PAW的殺菌效果隨著處理時間延長而提高，但過長的處理時間易導(dǎo)致新鮮蔬果、肉類及其制品等食品的品質(zhì)下降。研究表明PAW與抑菌物質(zhì)復(fù)配使用可以提高殺菌效率[13]。Jing等[14]發(fā)現(xiàn)分別用一定濃度乳酸溶液制成的等離子體活化乳酸溶液（Plasma-Activated Lactic Acid，PALA）和PAW處理沙門氏菌，前者細(xì)菌形態(tài)有更明顯的破壞，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷水平更高。此外，乳酸的存在可以進一步降低溶液的pH值，并改變細(xì)胞膜的通透性[15]，使由等離子體產(chǎn)生的活性物質(zhì)更易進入細(xì)胞內(nèi)。本研究以純培養(yǎng)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌和沙門氏菌等常見食源性致病菌為模型，研究PALA對純培養(yǎng)食源性致病菌的殺滅效果，為食品保鮮及安全生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)以及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，GDMCC 1.223=CMCC(B)44102）、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，GDMCC 1.347=ATCC19115）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus.Aureus，GDMCC 1.441=ATCC6538）、沙門氏菌（Salmonella enteritidis，GDMCC1.237=CMCC(B)50115），廣東省科學(xué)院微生物研究所；平板計數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Nutrient Broth，NB）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Nutrient Agar，NA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉、硫代硫酸鈉，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；乳酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器設(shè)備

PG-1000ZD型低溫等離子液體處理發(fā)生器，南京蘇曼等離子科技有限公司；5810R型高速離心機，德國Eppendorf公司；GR60DP型高壓滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；DY-200B全溫培養(yǎng)搖床，天津市泰斯特儀器有限公司；Master Touch-Q15型去離子純水機，上海和泰儀器有限公司；LRH-150F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計，德國Sartorius公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備菌懸液

參考相啟森等[16]的方法并稍作改進，分別從-80 ℃冰箱中取出單核增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌等菌種凍干管，室溫解凍后挑取一環(huán)菌液于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，選取活力旺盛的單菌落接種至營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。取20 mL培養(yǎng)物于50 mL離心管，于25 ℃、4 000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入等體積無菌生理鹽水并混勻，制成濃度約為8 log CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.2 等離子體活性乳酸溶液的制備

參照趙瑩等[17]的方法并略作修改，選用空氣為工作氣體，調(diào)整低溫等離子液體處理發(fā)生器工作電壓為19 kV，工作電流0.024 mA，電流頻率為20 kHz，取250 mL一定濃度的乳酸溶液于500 mL燒杯中，將等離子體射流裝置噴槍置于燒杯液面下約10 mm處理一定時間，制得一定濃度PALA備用。

1.3.3 單因素實驗

保持低溫等離子液體處理發(fā)生器的工作狀態(tài)不變，分別考察PALA體積分?jǐn)?shù)（0%、0.05%、0.1%、0.2%，V/V）、活化時間（0、30、60、90和120 s）、反應(yīng)時間（0、2、4、6、8、10 min）對純培養(yǎng)大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌的影響，以微生物實驗結(jié)果評價PALA的殺菌效果，確定最佳因素水平。在考察單一變量對4種食源性致病菌的影響時，其余變量均保持最高水平。

1.3.4 微生物測定

參照《GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》并略做修改[18]，取2 mL菌懸液和等體積等離子體活化乳酸于10 mL離心管中，均質(zhì)后靜置反應(yīng)一定時間后加入50 μL 0.1 mol/L Na2S2O3以終止反應(yīng)[19]。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%無菌NaCl進行梯度稀釋后，吸取1 mL稀釋液與約10 mL冷卻至46 ℃的PCA混勻，待瓊脂冷卻凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，進行菌落計數(shù)并統(tǒng)計，結(jié)果以lg CFU/mL表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

所有實驗均獨立重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較進行顯著性差異分析。采用Origin 2020進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)PALA對食源性致病菌的影響

由圖1a、1b可知，在保持PALA活化時間為120 s、反應(yīng)時間為10 min不變的前提下，大腸埃希氏菌及沙門氏菌2種革蘭氏陰性菌菌落總數(shù)隨著PALA體積分?jǐn)?shù)的升高而不斷下降，大腸埃希氏菌菌落總數(shù)減少了7.48個對數(shù)值，沙門氏菌菌落總數(shù)減少了4.43個對數(shù)值，其中在PALA體積分?jǐn)?shù)達到0.2%時，大腸埃希氏菌的殺滅率達100%；而在圖1c、1d）中，金黃色葡萄球菌及單核增生李斯特菌的菌落總數(shù)隨PALA體積分?jǐn)?shù)升高而緩慢降低，金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)減少了3.28個對數(shù)值，單核增生李斯特菌菌落總數(shù)減少了3.29個對數(shù)值，其中金黃色葡萄球菌的菌落總數(shù)在0.1%和0.2%體積分?jǐn)?shù)的PALA處理后無顯著差異（P＜0.05）；對比圖1a、1b和圖1c、1d，發(fā)現(xiàn)陽性對照組0.00%濃度（即等離子體活化水，Plasma-Activated Water，PAW）可以殺滅2.95 log CFU/mL的大腸埃希氏菌和沙門氏菌，而僅能殺滅0.79 log CFU/mL金黃色葡萄球菌和0.70 log CFU/mL單核增生李斯特菌。這與相啟森等[16]研究結(jié)果一致。這是因為革蘭氏陽性菌G+相比革蘭氏陰性菌G-具有更厚的細(xì)胞壁，其肽聚糖結(jié)構(gòu)更為致密，能在一定程度上阻礙PALA中活性基團對其細(xì)胞膜的氧化。研究表明，在等離子體放電過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮（Reactive Nitrogen Species，RNS）基團，這些活性基團向水?dāng)U散的過程中進一步反應(yīng)生成ONOO-、NO2-、NO3-、HO2·、H2O2、O3、1O2（單線態(tài)氧）等活性化學(xué)物質(zhì)，在酸性環(huán)境下HO2·會促使細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化，并與其他活性物質(zhì)共同作用，促使微生物細(xì)胞裂解[20-23]。PALA生成過程中產(chǎn)生的ROS和RNS部分反應(yīng)見表1。隨著環(huán)境中的H+的增加，PALA中活性基團的氧化能力進一步增強，加快微生物細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化破裂，誘導(dǎo)微生物細(xì)胞氧化應(yīng)激，造成微生物細(xì)胞損傷和死亡[24-27]。

表1 PALA產(chǎn)生過程中部分化學(xué)反應(yīng)Table 1 Part of the chemical reaction for PALA production

圖1 不同濃度PALA對4種食源性致病菌菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PALA on the total number of colonies of four foodborne pathogens

4種食源性致病菌的菌落總數(shù)均隨著PALA的體積分?jǐn)?shù)升高而降低。這與趙電波等[28]發(fā)現(xiàn)一致。趙電波等[28]研究發(fā)現(xiàn)，等離子體活性水聯(lián)合苯乳酸處理大腸桿菌O157:H7，其殺滅率隨苯乳酸濃度的升高而增強。因0.2%的PALA對4種致病菌殺滅效果最好，經(jīng)處理后大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及單核增生李斯特菌分別減少了7.48、4.43、3.28和3.29 log CFU/mL，殺菌率達99.9%以上（P＜0.05），故選擇體積分?jǐn)?shù)為0.2%的PALA進行后續(xù)實驗。

2.2 不同反應(yīng)時間對食源性致病菌的影響

由圖2可知，在保持PALA體積分?jǐn)?shù)為0.2%、活化時間為120 s不變的前提下，PALA對4種致病菌的殺菌率隨著反應(yīng)時間的增加而增大，在10min時大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及單核增生李斯特菌分別減少了7.76、4.56、4.48和4.27 log CFU/mL，4種致病菌的殺菌率均達到99.9%（P＜0.05）。周小霞等[29]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理30 min后有5.53 log CFU/mL的金黃色葡萄球菌生物膜被滅活，PAW對金黃色葡萄球菌生物膜的滅活效果隨等離子體處理時間的延長而增加，這與本研究結(jié)果一致。圖2a中的大腸埃希氏菌在反應(yīng)10 min后殺菌率可達100%（P＜0.05），圖2b～d中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌的殺菌率達99.9%以上（P＜0.05）。而沙門氏菌在反應(yīng)10 min后仍有3.39 log CFU/mL，相比同為G-的大腸埃希氏菌對PALA的敏感性更低。這可能是沙門氏菌可以通過改變流出系統(tǒng)、孔蛋白和膜滲透性來增強自身的耐藥性[30]，降低PALA對其細(xì)胞膜的氧化損傷，防止胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等流失。

圖2 不同反應(yīng)時間對4種食源性致病菌菌落總數(shù)的影響Fig.2 Effects of different reaction times on the total number of colonies of four foodborne pathogens

2.3 不同活化時間PALA對食源性致病菌的影響

由圖3可知，在保持PALA體積分?jǐn)?shù)為0.2%、反應(yīng)時間為10 min不變的前提下，空白對照組（CK）與陽性對照組（活化0 s，即0.2%乳酸溶液）對4種致病菌的影響較小，未經(jīng)活化的0.2%乳酸溶液僅能殺滅0.39 log CFU/mL大腸埃希氏菌、0.26 log CFU/mL金黃色葡萄球菌、0.09 log CFU/mL沙門氏菌和0.25 log CFU/mL單核增生李斯特菌，說明單純的乳酸溶液無法高效殺滅食源性致病菌，這與汪陳潔[8]的研究結(jié)果相似。在保持濃度和反應(yīng)時間不變的情況下，隨著活化時間的增加，PALA對4種致病菌的殺滅率逐漸升高：活化30 s可殺滅菌落總數(shù)0.09～1.49 log CFU/mL；活化60 s時可殺滅菌落總數(shù)1.98～2.39 log CFU/mL；活化90 s時可殺滅菌落總數(shù)2.37～3.53 log CFU/mL；活化120 s時殺滅菌落總數(shù)均大于3.9 log CFU/mL。這可能因為PALA中的活性物質(zhì)需要一定時間積累并達到一定濃度才能高效殺滅微生物，當(dāng)活化時間較短時，溶液中的ROS和RNS等未能積累達到殺滅微生物的閾值。研究表明，ROS和RNS會導(dǎo)致溶液的氧化還原電位（Oxidation-Reduction Potential，ORP）升高，而ORP是影響細(xì)菌失活的重要原因之一，且ORP值隨等離子體活化時間的延長而增加并逐漸趨于平穩(wěn)[4,24,27]。

圖3 不同活化時間PALA對4種食源性致病菌菌落總數(shù)的影響Fig.3 Effects of different activated times on the total number of colonies of four foodborne pathogens

3 結(jié)論

綜上所述，PALA能夠有效殺滅大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌，且其殺滅效果隨PALA體積分?jǐn)?shù)的升高、活化時間以及反應(yīng)時間的延長而提升。經(jīng)活化120 s最終體積分?jǐn)?shù)為0.2%的PALA反應(yīng)10 min，4種純培養(yǎng)食源性致病菌殺滅率均達99.9%（P＜0.05），其中約殺滅了大腸埃希氏菌7.71 log CFU/mL、沙門氏菌4.52 log CFU/mL、金黃色葡萄球菌4.03 log CFU/mL、單核增生李斯特菌3.90 log CFU/mL。在今后的研究中應(yīng)進一步明確PALA的殺菌機理，系統(tǒng)評價PALA對食品表面微生物的殺滅效果以及對食品感官、理化性質(zhì)、營養(yǎng)價值和貯藏期等指標(biāo)的影響，為未來PALA在食品領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；膽?yīng)用提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支撐。