計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散及濃度對釀酒酵母計數(shù)的比較

徐娟，陳翔宇，李蒙蒙，林麗軍，陸利霞，劉元建，熊曉輝

（南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211816）

微球（聚苯乙烯微球）廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、分析化學(xué)、標(biāo)準(zhǔn)計量以及吸附等領(lǐng)域[1]。熒光修飾的微球可作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)毎M行計數(shù)[2,3]。Cunningham等[4]添加已知濃度計數(shù)微球?qū)悠分械牟《具M行熒光顯微鏡計數(shù)，結(jié)果表明在每毫升2.17×106～1.37×108個病毒的范圍內(nèi)該方法與膜過濾的計數(shù)結(jié)果無顯著性差異（P=0.531）。Ou等[5]在對濃度為每毫升104～108個活死菌進行計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)利用熒光微球的流式細胞術(shù)與瓊脂平板計數(shù)之間線性關(guān)系一致。另外，用于流式細胞儀的標(biāo)準(zhǔn)微球類型不同，報道有濃度為每毫升1.0×108個的6.0 μm微球，濃度為每毫升106個的5.0～7.9 μm微球等[6,7]。但未有研究報道標(biāo)準(zhǔn)微球用于計數(shù)不同濃度細胞（病毒）時的適宜使用濃度。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 39730-2020《細胞計數(shù)通用要求流式細胞測定法》中對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的使用濃度未說明，且對標(biāo)準(zhǔn)微球使用中的聚集問題缺少措施。ISO 20391-1:2018中對懸浮液中的細胞及微球需要保證均一性，才可實現(xiàn)所取樣反映實際樣品中的數(shù)量。已有研究表明體積分數(shù)低于1%的Tween 20和體積分數(shù)低于5%的Tween 80可有效降低微生物聚集且不會對細胞活性造成影響[8,9]。但缺少使用Tween 20和Tween 80促進標(biāo)準(zhǔn)微球的分散研究。本研究中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)微球在液體中會發(fā)生聚集、結(jié)團現(xiàn)象，導(dǎo)致細胞計數(shù)的不準(zhǔn)確，且產(chǎn)生顯著影響。

依據(jù)計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法，對細胞和微球直接計數(shù)時統(tǒng)計的細胞和微球數(shù)量與計數(shù)結(jié)果相關(guān)。在顯微鏡直接計數(shù)過程中，當(dāng)載玻片上統(tǒng)計的細胞或微球數(shù)量大于350個時，才能獲得可靠的結(jié)果[10,11]。Braun等[12]在顯微鏡計數(shù)干燥土壤中的總細胞數(shù)實驗中要求統(tǒng)計的細胞數(shù)量大于1 000個。而GB/T 39730-2020中僅說明需采集的微球及細胞的數(shù)量，但并未說明不同細胞濃度所對應(yīng)的計數(shù)數(shù)量。

本文以計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球和釀酒酵母ATCC9080為實驗對象，研究了計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散條件及微球濃度對釀酒酵母細胞計數(shù)的影響，分析了標(biāo)準(zhǔn)微球及細胞統(tǒng)計數(shù)量對計數(shù)結(jié)果的影響，并將標(biāo)準(zhǔn)微球計數(shù)與平板計數(shù)結(jié)果進行了比較，為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球用于微生物的準(zhǔn)確計數(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球（直徑8 μm），知益微球科技有限公司；釀酒酵母ATCC9080（S.cerevisiae），本實驗室保藏菌株；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS，pH值7.0），上海生工生物工程有限公司；Tween 20和Tween 80，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生物顯微鏡BM1000，南京江南永新光學(xué)有限公司；智能生化培養(yǎng)箱SHP-100，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的懸液制備及分散

1.3.1.1 計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散處理實驗

（1）Tween 20對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

在無菌PBS緩沖液中加入不同體積的Tween 20，得到體積分數(shù)為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的Tween 20，采用0.22 μm濾膜過濾后得到不同體積分數(shù)的PBS吐溫20溶液（PBS-Tween 20，PBST2）。稱取0.0150 g微球粉末分別溶解于10 mL無菌PBS緩沖液和不同體積分數(shù)的PBST2中，經(jīng)超聲（50 Hz）分散至無肉眼可見結(jié)塊后得到待測微球溶液。每個處理組重復(fù)三次。以無菌PBS緩沖液處理組為對照組，計算不同體積分數(shù)Tween 20處理的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)（I）。

（2）Tween 80對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

在無菌PBS緩沖液中加入不同體積的Tween 80，得到體積分數(shù)為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的Tween 80，采用0.22 μm濾膜過濾后得到不同體積分數(shù)的PBS吐溫80溶液（PBS-Tween 80，PBST8）。其它同（1）處理，計算不同體積分數(shù)Tween 80處理的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)（I）。

1.3.1.2 計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)測定

使用血球計數(shù)板計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球溶液，觀察分散處理前后微球分散情況，分散指數(shù)（I）計算見公式1[8]。

式中：

I——分散指數(shù)；

T1——分散后標(biāo)準(zhǔn)微球在血球計數(shù)板五個中格總數(shù)，個；

T0——對照組標(biāo)準(zhǔn)微球在血球計數(shù)板五個中格總數(shù)，個。

1.3.2 釀酒酵母菌懸液的制備

取用酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基在30 ℃，160 r/min培養(yǎng)18 h的釀酒酵母液體培養(yǎng)液，重懸后用無菌的PBS溶液進行十倍稀釋得到一系列菌懸液。采用血球計數(shù)板對菌懸液進行三次重復(fù)計數(shù)，選取其中濃度為每毫升105～107個的菌液作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法和平板計數(shù)法的計數(shù)樣品。

1.3.3 釀酒酵母濃度計數(shù)

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)微球計數(shù)釀酒酵母濃度

將0.0150 g微球粉末溶解于5 mL 0.08%的PBST2，用0.08% PBST2稀釋后經(jīng)血球計數(shù)板計數(shù)得到每毫升4.25×104、8.60×105、7.56×106、2.17×107個的微球溶液。移取100 μL制備的不同濃度微球溶液分別與100 μL待測釀酒酵母溶液混勻，制成微球、釀酒酵母的混合溶液后，用扁平玻璃毛細管吸取部分混合溶液在10×40倍鏡下進行顯微鏡計數(shù)”，隨機獲取20～45個顯微鏡圖像，使用ImageJ軟件計數(shù)圖像中釀酒酵母和微球[13]。每個樣品進行三次重復(fù)并計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計算結(jié)果間的變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）。

標(biāo)準(zhǔn)微球計數(shù)釀酒酵母濃度計算參考GB/T 39730-2020，見公式2。

式中：

C——釀酒酵母濃度，個/mL；

Ncell——單個圖像中釀酒酵母的平均數(shù)量，個；

Nball——單個圖像中標(biāo)準(zhǔn)微球的平均數(shù)量，個；

Qball——釀酒酵母中添加的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球總數(shù)量，個；

V——與標(biāo)準(zhǔn)微球混合的待測釀酒酵母溶液的原體積，mL；

D——釀酒酵母溶液的稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 平板計數(shù)釀酒酵母濃度

將標(biāo)準(zhǔn)微球與釀酒酵母混合懸液采用平板計數(shù)釀酒酵母濃度，依據(jù)GB 4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Microsoft Office Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理；Origin 2018進行圖像繪制；IBM SPSS Statistics 26軟件采用沃勒-鄧肯法（Waller-Duncan）進行顯著性分析，P＜0.05為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散處理結(jié)果

2.1.1 Tween 20對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

在使用流式細胞儀對熒光微球計數(shù)之前，先采用渦旋混合器對微球溶液進行混勻，但未說明標(biāo)準(zhǔn)微球是否分散及其效果[14]。圖1是計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在不同體積分數(shù)Tween 20中的分布情況。

圖1 不同體積分數(shù)的Tween 20對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散現(xiàn)象Fig.1 Dispersion of counting standard microspheres with different volume fractions of Tween 20

由圖1a可知計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在未添加Tween 20的PBS溶液中存在大量聚集和分層現(xiàn)象（在顯微鏡圖像中有的微球模糊），可見多個計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球聚集體以及部分微球懸浮或沉淀情況。而計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的聚集會直接影響標(biāo)準(zhǔn)微球計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在計數(shù)之前需要對標(biāo)準(zhǔn)微球進行混勻或者分散處理。

由圖1b～1d可發(fā)現(xiàn)，不同體積分數(shù)的Tween 20促進標(biāo)準(zhǔn)微球分散，并隨著Tween 20的體積分數(shù)增加，微球的聚集和分層現(xiàn)象逐漸改善；且體積分數(shù)在0.08%時微球聚集團變?yōu)閱蝹€分散的微球，不再分層。分散指數(shù)是指處理組與對照組在血球計數(shù)板五個中格總數(shù)的差值與對照組五個中格總數(shù)的比值。對于同一濃度微球懸液，處理后的分散指數(shù)越大，則說明與對照組相比，微球聚集減少，進入計數(shù)區(qū)的粒子數(shù)量越多，說明微球分層和聚集導(dǎo)致問題得到了改善。因此可通過分散指數(shù)判斷分散效果。

由圖2可知，不同體積分數(shù)的Tween 20處理組的分散指數(shù)較對照組均顯著增加（P＜0.05），表明該處理改善了微球的聚集情況，且隨著Tween 20體積分數(shù)的增加，分散指數(shù)先增加后趨于穩(wěn)定。其中當(dāng)Tween 20體積分數(shù)為0.08%時，釀酒酵母分散指數(shù)為3.32，此后隨著Tween 20體積分數(shù)增加，分散指數(shù)變化不顯著（P＞0.05），即體積分數(shù)為0.08%～0.12%的Tween 20對標(biāo)準(zhǔn)微球均有促分散效果。但增大Tween 20體積分數(shù)，在分散時會產(chǎn)生較多氣泡。Brando等[15]發(fā)現(xiàn)渦旋或混勻時產(chǎn)生的微氣泡會聚集微球并使得移取液中微球的數(shù)量發(fā)生變化。研究表明0.2%～1.0% Tween 20不會影響釀酒酵母細胞活性[8]。因此采用更低體積分數(shù)的0.08% Tween 20的微球溶液計數(shù)釀酒酵母也不會對其活性造成影響。另外如圖3所示，實驗中發(fā)現(xiàn)在含0.08% Tween 20的微球溶液中，除去因出芽繁殖形成的少數(shù)聚集外，釀酒酵母并未出現(xiàn)明顯的聚集。Cilliers等[16]在奶酪勻漿中回收微生物群時，使用0.02%Tween 20和1 mmol/L EDTA來對微生物進行分散。然而在0.08% Tween 20中微球仍會存在極少數(shù)2～3個微球聚集（圖1d），但這部分聚集僅占計數(shù)區(qū)域微球總數(shù)的1%，并不會對計數(shù)結(jié)果造成誤差。

圖2 不同體積分數(shù)的Tween 20對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different volume fractions of Tween 20 on the dispersion index of counting standard microspheres

圖3 釀酒酵母在含有0.08% Tween 20的微球溶液中的分散狀態(tài)Fig.3 Dispersion of S.cerevisiae in a microsphere solution containing 0.08% Tween 20

計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球易發(fā)生團聚現(xiàn)象并且表面具有疏水性，疏水作用使微球在PBS溶液中無法形成穩(wěn)定的溶液[17]。Tween 20是一種常用的非離子型表面活性劑，能在微球表面增加羧基、醚類等親水性基團，可改善微球在水溶液中的分散，使得微球在溶液中能夠均勻分散[18]。Jodar-Reyes[19]等也報道兩親性分子吸附在聚苯乙烯乳膠顆粒表面主要是依靠表面疏水區(qū)域之間的疏水吸引。因此通過Tween 20可改善標(biāo)準(zhǔn)微球聚集。

2.1.2 Tween 80對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

圖4是計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在不同體積分數(shù)的Tween 80中的分布情況。由圖4a可知，計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在未添加Tween 80的PBS溶液中存在計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球聚集體以及部分微球懸浮或沉淀情況。與對照組相比，隨著Tween 80體積分數(shù)增加，微球聚集的現(xiàn)象逐漸改善，微球聚集團減少并呈現(xiàn)單個分散的微球，表明Tween 80有助于計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散。

圖4 不同體積分數(shù)Tween 80對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散現(xiàn)象Fig.4 Dispersion of counting standard microspheres with different volume fractions of Tween 80

根據(jù)圖5可知，隨著Tween 80體積分數(shù)的增加，分散指數(shù)先增加后趨于穩(wěn)定。其中當(dāng)Tween 80體積分數(shù)為0.06%時，釀酒酵母分散指數(shù)為3.37，此后隨著Tween 80體積分數(shù)增加，分散指數(shù)變化不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，Tween 80對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散有顯著效果（P＜0.05），且當(dāng)Tween 80體積分數(shù)達到0.06%～0.12%，分散結(jié)果達到最佳。與0.08%Tween 20相比，0.06% Tween 80也能使微球的最大分散指數(shù)達到3.30。

圖5 不同體積分數(shù)的Tween 80對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)的影響Fig.5 Effect of different volume fractions of Tween 80 on the dispersion index of counting standard microspheres

與Tween 20類似，Tween 80是一種親水性的表面活性劑，其分子結(jié)構(gòu)中含有親脂性的脂肪鏈和親水性的氧乙烯鏈，對疏水性物質(zhì)有助溶作用。因此加入Tween 80可能改變聚苯乙烯微球表面的疏水性，從而促進微球聚集體的分散。此外，對油脂類樣品中微生物進行計數(shù)時，也常使用Tween 80形成均勻分散溶液，且5% Tween 80不會影響菌落總數(shù)的平板計數(shù)結(jié)果[9,20]。

2.2 計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球濃度對不同濃度釀酒酵母細胞計數(shù)的影響

采用已知數(shù)量的微球?qū)︶劸平湍高M行計數(shù)是利用單個圖像中釀酒酵母細胞與微球數(shù)量的比值等于原混合溶液中兩者的比例，從而間接計算出待測釀酒酵母細胞的數(shù)量。當(dāng)流式細胞儀無法精確控制或監(jiān)測檢測樣本的體積，可通過加入已知數(shù)量的微球獲得細胞的濃度[21]。為獲得計數(shù)釀酒酵母細胞適宜的微球濃度，實驗分別使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)︶劸平湍妇哼M行計數(shù)。

實驗發(fā)現(xiàn)，采用濃度小于每毫升105個的標(biāo)準(zhǔn)微球進行計數(shù)，大量圖像中無微球存在，單個圖像中微球平均數(shù)量小于1個。即微球濃度太低會導(dǎo)致其在單個圖像中分布的數(shù)量較少，計數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性差。Seo等[22]報道單個顯微圖像的細胞數(shù)小于45個會導(dǎo)致細胞計數(shù)結(jié)果之間的高度差異。當(dāng)過濾器上細菌細胞數(shù)量小于105個時，顯微鏡計數(shù)會高估真實細菌濃度且高估范圍為15.0%～99.3%[23]。另外，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)微球的濃度大于每毫升107個時，導(dǎo)致整個圖像中全部被微球充滿，而影響對釀酒酵母細胞的識別統(tǒng)計。因此實驗選取每毫升105、106、107個標(biāo)準(zhǔn)微球進行分析。

對不同濃度釀酒酵母分別添加不同濃度計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球，采集顯微圖像后，計算獲得釀酒酵母濃度結(jié)果見表1。表1表明，同一釀酒酵母樣品添加每毫升105～107個微球，對釀酒酵母濃度結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）。但通過比較添加不同濃度微球計數(shù)釀酒酵母的變異系數(shù)CV可知，對每毫升105～107個釀酒酵母進行計數(shù)使用每毫升106個的微球更優(yōu)，且不同比例時組內(nèi)變異系數(shù)分別為5.13%、1.56%、3.47%。

表1 不同濃度計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)︶劸平湍傅挠嫈?shù)結(jié)果Table 1 Results of counting S.cerevisiae by different concentrations of counting standard microspheres

圖像計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性與采集的圖像數(shù)量有關(guān)。Muthukrishnan等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)載玻片上細菌不均勻分布時，至少需要計算20個隨機圖像或350個細菌細胞，才能可靠地估算載玻片上的細菌總數(shù)。Lander等[24]報道顯微鏡和原型激光掃描細胞儀對微球的計數(shù)結(jié)果存在波動，這是因為計數(shù)時隨機選取的計數(shù)區(qū)域小，小于計數(shù)濾膜總面積的10%，該方法的隨機性在對低濃度的粒子計數(shù)時會變得更加明顯。從表1結(jié)果表明與每毫升106～107個的釀酒酵母相比，每毫升105個釀酒酵母在單個圖像中的分布數(shù)量差異大，進而使計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)大。因此對于低濃度樣品需要統(tǒng)計更多的圖像才能使計數(shù)結(jié)果趨于穩(wěn)定。在本研究中也發(fā)現(xiàn)對每毫升105～107個釀酒酵母計數(shù)，對應(yīng)地采集圖像數(shù)分別大于32、20、12個時計數(shù)結(jié)果趨于穩(wěn)定。因此為保證計數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，對每毫升105～107個釀酒酵母分別采集45、30和20個圖像。

平板計數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)微球計數(shù)釀酒酵母的結(jié)果如表2所示。統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果顯示對于同一樣品，兩種定量檢測結(jié)果間均無顯著性差異（P＞0.05）。另外，如圖6所示，兩種計數(shù)方法的擬合曲線為y=0.954 8x+0.395 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9，說明兩者有較好的相關(guān)性，即使用標(biāo)準(zhǔn)微球計數(shù)的結(jié)果也是準(zhǔn)確的。

圖6 兩種計數(shù)結(jié)果的相關(guān)性曲線Fig.6 Correlation curve between the counting results of the two methods

2.3 采集的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量對不同濃度釀酒酵母計數(shù)的影響

對于微生物計數(shù)，一般要求計數(shù)結(jié)果應(yīng)保持在平均值±2SD范圍內(nèi)。另外，計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法中要求采集微球的總數(shù)目不應(yīng)少于1 000個[25]。實驗選取每毫升106個標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)γ亢辽?05～107個釀酒酵母進行計數(shù)，每個樣品進行3次重復(fù)，不同標(biāo)準(zhǔn)微球統(tǒng)計量對釀酒酵母計數(shù)結(jié)果的影響如圖7所示。從圖7表明，統(tǒng)計的微球總數(shù)量分別大于2 000個（采集細胞總數(shù)量大于200個）、1 500個（采集細胞總數(shù)量大于400個）、1 000個（采集細胞總數(shù)量大于2 600個）時，釀酒酵母計數(shù)濃度和單個圖像中微球的平均數(shù)量趨于穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差逐漸減小。此時圖7a～c中單個圖像中微球的平均數(shù)量分別為68個、69個、72個，表明單個圖像中微球的平均數(shù)量始終保持在平均值±2SD范圍內(nèi)（69.75±3.93個）。該結(jié)果補充了GB/T 39730中需要統(tǒng)計的微球及細胞數(shù)量，可更準(zhǔn)確、方便獲得細胞計數(shù)結(jié)果。

圖7 統(tǒng)計的微球總數(shù)量對釀酒酵母濃度和單個圖像中微球的平均數(shù)量的影響Fig.7 Effect of total statistical amounts of microsphere on the concentration of S.cerevisiae and the average number of microspheres in individual image

3 討論

在采用標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)Σ煌瑵舛任⑸镉嫈?shù)時，微球的分散、使用濃度以及對應(yīng)的統(tǒng)計數(shù)量對計數(shù)結(jié)果有重要意義。已有研究表明微球聚集或取樣以及溶液中存在微氣泡均會導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差[15]。ISO 20391-1:2018中也提到聚集體或凝聚體會導(dǎo)致細胞計數(shù)不足，在計數(shù)前需制備分散良好的樣品。為解決標(biāo)準(zhǔn)微球聚集問題，本研究表明0.08% Tween 20或0.06% Tween 80可有效分散計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球，其較PBS對照組分散指數(shù)分別提高了3.32和3.37，微球濃度提高了4倍，表明微球分散均勻?qū)Y(jié)果的重要作用。這與Chae等[11]的研究成果一致，他認為微球在濾膜表面的分布不均會導(dǎo)致計數(shù)有偏差，因此在對微球進行計數(shù)時需要保證分布均勻，提高計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為確定標(biāo)準(zhǔn)微球用于計數(shù)不同濃度細胞時的適宜使用濃度，本研究表明，與每毫升105個微球?qū)γ亢辽?05～107個釀酒酵母計數(shù)相比，使用每毫升106個微球得到的計數(shù)結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定。這是因為當(dāng)微球濃度過低時移取液中微球為泊松分布[26]。依據(jù)計數(shù)微球粒徑，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)微球的濃度高于每毫升107個時，微球會鋪滿整個圖像進而影響對目標(biāo)細胞的識別與統(tǒng)計。因此，選擇適宜的計數(shù)微球濃度可利于結(jié)果的準(zhǔn)確性，也為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的應(yīng)用提供參數(shù)。

此外，對微生物進行直接計數(shù)需明確統(tǒng)計數(shù)量，如顯微鏡計數(shù)樣品至少需要統(tǒng)計400～1 000個細菌細胞[12,27]。通過本研究的統(tǒng)計分析，確立不同濃度細胞需要統(tǒng)計的微球數(shù)量，不同于GB/T 39730-2020中統(tǒng)計1 000個微球的要求，表明為準(zhǔn)確獲得細胞濃度需增加微球數(shù)量至2 000個。

本研究將計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球與顯微鏡圖像結(jié)合，為微生物快速計數(shù)提供了依據(jù)。傳統(tǒng)的顯微鏡計數(shù)需已知測定的體積或者面積，當(dāng)載玻片上形成菌膜的具體面積未知時，需要對載玻片上涂片的全部區(qū)域進行采集[28]。本實驗基于微球計數(shù)無需已知計數(shù)室體積，利用微球與釀酒酵母的比例進行計數(shù)，可在普通的載玻片上或者在不能準(zhǔn)確定量計數(shù)溶液的體積或過濾面積時進行計數(shù)。而傳統(tǒng)熒光顯微鏡計數(shù)是基于膜面積進行細菌計數(shù)，檢測成本高[29,30]。因此可進一步研究在載玻片上采用計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法代替膜過濾的方法對細菌進行計數(shù)。

4 結(jié)論

實驗表明0.08% Tween 20溶液和0.06% Tween 80溶液對微球的分散效果最佳，分散均勻的標(biāo)準(zhǔn)微球可用于微生物的準(zhǔn)確計數(shù)。以每毫升105～107個釀酒酵母為分析對象，每毫升106個標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)︶劸平湍赣嫈?shù)結(jié)果的穩(wěn)定性最好，統(tǒng)計的微球數(shù)量分別應(yīng)不小于2 000、1 500、1 000個，細胞數(shù)量分別應(yīng)不小于200、400、2 600個。在該計數(shù)條件下，其計數(shù)結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果一致。使用同一標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)Σ煌瑵舛柔劸平湍附M計數(shù)的單個圖像中微球平均數(shù)量始終保持在平均值±2SD范圍內(nèi)，可準(zhǔn)確獲得釀酒酵母濃度，明確了GB/T 39730-2020標(biāo)準(zhǔn)微球使用條件。