樹莓RiPAL1基因克隆及生物信息學(xué)分析

孫華軍，劉盈，李雪靜，楊斯琪，錢麗麗，李躍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163316）

樹莓（Rubus idaeusL.）屬于薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬多年生小灌木，又稱覆盆子、托盤、木莓等[1]。成熟的樹莓果實(shí)色澤宜人、酸甜適口、軟嫩多汁，富含多酚、類黃酮和花青素等多種有益活性成分及人體必需的氨基酸，具有增強(qiáng)免疫力和抗癌的功效[2-4]。由于富有極高的營養(yǎng)價(jià)值，樹莓也被譽(yù)為“第三代黃金水果”[5,6]。苯丙烷代謝途徑是植物重要的次級(jí)代謝途徑之一，該途徑會(huì)產(chǎn)生多種活性成分，如黃酮、多酚和花青素等[7]。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia-Lyase，PAL）是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，通過催化L-苯丙氨酸產(chǎn)生反式肉桂酸，反式肉桂酸是植物合成黃酮類等次級(jí)代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)，是調(diào)控下游黃酮類成分合成信號(hào)通路的關(guān)鍵成員[8]。黃酮類化合物是一類重要的次生代謝天然有機(jī)化合物，具有抗氧化等生物學(xué)功能，可清除體內(nèi)的自由基和毒素，能抗菌、消炎、抗腫瘤，對(duì)人體健康大有裨益[9]。樹莓中含有豐富的黃酮類和花色苷等酚類物質(zhì)，對(duì)預(yù)防心血管疾病和腫瘤等有良好效果[10,11]。FAO推薦其為“生命之果”[12]。

研究表明，PAL與黃酮積累有關(guān)，劉金福等[13]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎黃酮的產(chǎn)生與PAL活性呈正相關(guān)。趙則海等[14]對(duì)攀援型和矮生型四棱豆的苯丙氨酸解氨酶活性和黃酮含量進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在兩種不同類型的四棱豆中，PAL活性和總黃酮含量之間均呈顯著正相關(guān)。在樹莓中，一氧化氮處理能通過增強(qiáng)PAL和其他相關(guān)酶活性，加快黃酮和總酚的積累速率，提升果實(shí)的抗氧化能力[15]。目前，已對(duì)云錦杜鵑[16]、百蕊草[17]、牛大力[18]和陸地棉[19]等多種植物的PAL基因進(jìn)行了克隆、序列分析以及蛋白質(zhì)的功能研究，而有關(guān)樹莓PAL基因的研究報(bào)道仍較少。關(guān)于樹莓中黃酮類次生代謝物的代謝機(jī)制和調(diào)控機(jī)理尚未深入研究，研究調(diào)控樹莓黃酮類代謝的關(guān)鍵基因的序列和結(jié)構(gòu)等信息，對(duì)于闡明樹莓類黃酮的代謝機(jī)理至關(guān)重要。

因此，本研究根據(jù)前期樹莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）法克隆獲得RiPAL1基因序列，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確RiPAL1基因的序列、結(jié)構(gòu)和親緣信息，以期為研究樹莓RiPAL1基因在黃酮類物質(zhì)生物合成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

樹莓果實(shí)采自于黑龍江省尚志縣漿果基地，采摘后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用液氮快速冷凍后于-80 ℃保存。

1.2 主要儀器設(shè)備

RNA提取試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×3 G Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成和測(cè)序技術(shù)服務(wù)由金唯智生物科技有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樹莓果實(shí)RNA提取及cDNA第一鏈的合成

從-80 ℃冰箱中取出樹莓果實(shí)樣品，于液氮中迅速研磨成粉末狀，參照CWBIO OminiPlant RNA Kit（DNAse I，適用于多糖多酚）試劑盒說明書提取總RNA。再參照HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.3.2 樹莓RiPAL1基因的克隆

從本實(shí)驗(yàn)室已有的樹莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得RiPAL1基因序列，用primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)RiPAL1基因的特異性引物（F：ATGGAGTTTAATAAA AACGGC；R：TTAAGATATAGGCAGGGG）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，包含25 μL的2×3G Taq Master Mix，2 μL上游引物，2 μL下游引物，1 μL樹莓果實(shí)cDNA，20 μL滅菌水。PCR反應(yīng)的條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸3 min；共33個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%（m/m）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的條帶單一且明亮則送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.3 樹莓RiPAL1基因的生物信息學(xué)分析

測(cè)序無誤的樹莓RiPAL1基因序列用ORF finder軟件預(yù)測(cè)其完整開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。在線預(yù)測(cè)樹莓RiPAL1基因編碼氨基酸的蛋白保守結(jié)構(gòu)域及超家族。利用在線軟件預(yù)測(cè)樹莓RiPAL1基因編碼蛋白理化性質(zhì)（ExpasyProtParam）、信號(hào)肽（SignalP 4.1）、跨膜結(jié)構(gòu)（TMHMM 2.0）、糖基化位點(diǎn)（NetNGlyc 1.0）、磷酸化位點(diǎn)（NetPhos 3.1）和親疏水性（ExPasy-ProtScale）并進(jìn)行分析。使用SOPMA軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，采用MEGA 7軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

在NCBI blastn中比對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序后得到的基因序列，并命名為樹莓RiPAL1基因。使用NCBI中的BlastP工具查找與樹莓RiPAL1同源性較高的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓RiPAL1基因的克隆及序列分析

提取樹莓果實(shí)RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。以cDNA為模板，F(xiàn)（ATGGAGTTTAATAAAAAC GGCAAC）和R（TTAAGATATAGGCAGGGGGGCAC）為引物進(jìn)行RiPAL1基因的全長擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在2 000 bp偏上處有條帶單一的高亮度目標(biāo)條帶（圖1）。將剩余的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到全長為2 133 bp的基因序列，經(jīng)NCBI blastn比對(duì)后命名為樹莓RiPAL1基因。

圖1 樹莓RiPAL1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of RiPAL1 gene in respberry

利用ORF finder確定RiPAL1基因的開放閱讀框?yàn)? 133 bp（圖2a），編碼710個(gè)氨基酸（圖2b）。

圖2 RiPAL1開放閱讀框（a）及編碼區(qū)氨基酸序列（b）Fig.2 Open reading frame (a) and coding amino acid sequences of RiPAL1 (b)

2.2 RiPAL1編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

關(guān)鍵保守結(jié)構(gòu)域是蛋白發(fā)揮催化功能的基礎(chǔ)。對(duì)樹莓RiPAL1編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析表明，RiPAL1蛋白包含PLN02457結(jié)構(gòu)域，屬于Lyase_Ⅰ_Like超家族（圖3）。在RiPAL1蛋白的192～208位氨基酸處是苯丙氨酸解氨酶典型的酶活性中心，序列為GTITASGDLVPLSYIAG（圖2b)。利用ExPASy-ProtParam在線軟件對(duì)RiPAL1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其分子式為C3422H5491N949O1045S27，相對(duì)分子量為77.50 ku，總原子數(shù)為10 934，理論等電點(diǎn)為6.21，不穩(wěn)定系數(shù)為35.00（＜40.00），推測(cè)為穩(wěn)定蛋白。半衰期約為30 h，在構(gòu)成樹莓RiPAL1蛋白的20種氨基酸中亮氨酸（Leu）的比例最高，為10.80%；色氨酸（Trp）的比例最低，為0.60%。脂肪族氨基酸616個(gè)，占86.80%；芳香族氨基酸39個(gè)，占5.50%；酸性氨基酸85個(gè)，占12.00%。對(duì)RiPAL1蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，RiPAL1是一種無信號(hào)肽蛋白，從而推測(cè)其可能是非分泌蛋白（圖4）。TMHMM 2.0在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，RiPAL1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5）。利用ExPasy-ProtScale軟件在線預(yù)測(cè)編碼蛋白的親疏水性，結(jié)果顯示RiPAL1蛋白疏水性最大值為4.50，最小值為-4.50，平均疏水指數(shù)為-0.49，故推測(cè)該蛋白為親水性蛋白（圖6）。

圖3 RiPAL1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Analysis of functional domain of RiPAL1 protein

圖4 RiPAL1蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of signal peptides of RiPAL1 protein

圖5 RiPAL1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of potential transmembrane domains of RiPAL1 protein

圖6 RiPAL1蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of hydrophobicity of RiPAL1 protein

2.3 RiPAL1蛋白的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析

生命活動(dòng)中離不開蛋白質(zhì)，在細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括磷酸化和去磷酸化兩個(gè)主要部分，其中蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)酶活性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[20]，并影響蛋白質(zhì)活性和亞細(xì)胞鑒定[21]。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式之一，直接或間接影響蛋白質(zhì)自身的活性、穩(wěn)定性以及亞細(xì)胞定位[22]，指由蛋白激酶（Protein Kinases，PKs）催化的，將三磷酸腺苷（ATP）的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定氨基酸殘基上的過程，廣泛參與植物生命過程的調(diào)節(jié)[23]。蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3類氨基酸殘基上[24]。通過NetNHlyc 1.0軟件在線預(yù)測(cè)RiPAL蛋白的糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在RiPAL1蛋白中存在4個(gè)潛在N糖基位點(diǎn)，分別為NGTA254、NLTG436、NPSL442和NTSI606（圖7）。通過NetPhos 3.1軟件在線預(yù)測(cè)RiPAL1蛋白的磷酸化位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)105個(gè)可能存在的磷酸化位點(diǎn)，其中共分析出67個(gè)特異性激酶位點(diǎn)，包括38個(gè)絲氨酸（S）、22個(gè)蘇氨酸（T）、7個(gè)酪氨酸（Y），其中酪氨酸主要分布在第102、324、345、428、429、447、572氨基酸處（圖8）。

圖7 RiPAL1蛋白的糖基化位點(diǎn)分析Fig.7 Analysis of glycosylation sites of RiPAL1 protein

圖8 RiPAL1蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of phosphorylation sites of RiPAL1 protein

2.4 RiPAL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SOPMA軟件在線預(yù)測(cè)RiPAL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析發(fā)現(xiàn)RiPAL1蛋白中的氨基酸主要參與形成了α螺旋（Hh）、無規(guī)則卷曲（Cc）、延伸鏈（Ee）和β折疊（Tt）結(jié)構(gòu)，占比分別為54.93%、31.13%、7.61%和6.34%（圖9）。利用Phyre 2在線軟件，以歐芹（Petroselinum crispum）PAL酶（PDB：1W27）的晶體結(jié)構(gòu)為模板對(duì)樹莓RiPAL1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其預(yù)測(cè)部分的可信度為100%，兩者序列相似性高達(dá)84%，RiPAL1蛋白以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，由四個(gè)同型蛋白單體組成四聚體（圖10）。

圖9 RiPAL1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of secondary structure of RiPAL protein

圖10 RiPAL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of tertiary structure of RiPAL1 protein

2.5 RiPAL1蛋白的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用NCBI中的BlastP工具查找與樹莓RiPAL1同源性較高的蛋白，利用DNAMAN中的多序列比對(duì)對(duì)包括樹莓RiPAL1蛋白在內(nèi)的13種植物的PAL蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同植物的PAL蛋白長度存在一定的差異性，但序列一致性高達(dá)91.83%，RiPAL1和其他物種PAL氨基酸序列中均含包含一段典型的PAL酶家族保守結(jié)構(gòu)域（GTITASG DLVPLSYIAG），表明PAL氨基酸序列在不同物種中高度保守（圖11）。利用MEGA7對(duì)樹莓RiPAL1和其它植物PAL的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明樹莓RiPAL1與草莓FaPAL1、月季RcPAL1和玫瑰RrPAL親緣關(guān)系最近，它們都屬于薔薇科植物，該聚類結(jié)果基本符合植物形態(tài)學(xué)分類規(guī)律（圖12）。

圖11 RiPAL與其他植物PAL的多序列比對(duì)Fig.11 Multiple alignment of the RiPAL protein with other plant PAL proteins

圖12 RiPAL與其他植物PAL的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.12 A phylogenetic tree between RiPAL and other plant PAL

2.6 其他植物PAL分析

研究表明，PAL與黃酮積累有關(guān)，劉金福等[13]在研究苦蕎中的黃酮發(fā)現(xiàn)，苦蕎中黃酮的產(chǎn)生與PAL活性呈正相關(guān)。趙則海等[14]在研究攀援型和矮生型四棱豆中的黃酮發(fā)現(xiàn)，在兩種不同類型的四棱豆中，總黃酮含量和PAL活性之間均呈顯著正相關(guān)。王俊文等[15]在研究樹莓中的黃酮發(fā)現(xiàn)，NO處理能顯著提高苯丙烷代謝中的PAL和SKDH等關(guān)鍵酶活性，加快了苯丙烷代謝能力，從而促進(jìn)下游產(chǎn)物如黃酮類物質(zhì)的積累。在藍(lán)莓和蘋果中也有類似的結(jié)果[25,26]。目前，在對(duì)多種植物的PAL基因克隆、序列分析以及蛋白質(zhì)的功能研究中，呂思佳等[16]發(fā)現(xiàn)云錦杜鵑組織中的苯丙氨酸含量與RhPAL基因表達(dá)量呈高度相關(guān)。張文香等[17]發(fā)現(xiàn)PAL是百蕊草中黃酮類成分合成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。耿曉姍等[18]發(fā)現(xiàn)PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，在植物的類黃酮類物質(zhì)的合成中起著重要作用。楊郁文等[19]發(fā)現(xiàn)PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，與植物抗病性密切相關(guān)。表明PAL基因?qū)φ{(diào)控黃酮代謝有重要作用，因此展開對(duì)樹莓黃酮代謝中PAL基因的解析，是揭示影響樹莓黃酮類活性物質(zhì)生物合成機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3 結(jié)論

本研究基于樹莓轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從樹莓中克隆了RiPAL1基因，該基因編碼710個(gè)氨基酸組成蛋白，該蛋白屬于苯丙氨酸解氨酶家族成員。通過對(duì)樹莓RiPAL1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，RiPAL1蛋白為無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的親水性蛋白，相對(duì)分子量為77.50 ku，總原子數(shù)為10 934，理論等電點(diǎn)為6.21，半衰期約為30 h。在構(gòu)成樹莓RiPAL1蛋白的20種氨基酸中亮氨酸（Leu）的比例最高，為10.80%；色氨酸（Trp）的比例最低，為0.60%。脂肪族氨基酸616個(gè)，占86.80%；芳香族氨基酸39個(gè)，占5.50%；酸性氨基酸85個(gè)，占12.00%。RiPAL1蛋白中發(fā)現(xiàn)105個(gè)可能存在的磷酸化位點(diǎn)，其中共分析出67個(gè)特異性激酶位點(diǎn)，其中絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化位點(diǎn)較多，酪氨酸殘基的磷酸化位點(diǎn)較少，此外RiPAL1蛋白還存在4個(gè)潛在N糖基位點(diǎn)，所預(yù)測(cè)出的磷酸化和糖基化位點(diǎn)可為研究樹莓RiPAL1蛋白的翻譯后修飾提供參考。RiPAL1蛋白以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，由四個(gè)同型蛋白單體組成四聚體。多序列比對(duì)表明RiPAL1蛋白具有較強(qiáng)的保守性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明樹莓RiPAL1蛋白與同為薔薇科的草莓、月季和玫瑰聚為一支，推測(cè)RiPAL1蛋白可能在薔薇科植物的進(jìn)化過程中高度保守，為今后深入研究薔薇科植物的進(jìn)化提供參考。

本研究利用RT-PCR法成功克隆出樹莓RiPAL1基因，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)RiPAL1蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，以及同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，闡明了該基因重要的分子特征，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究樹莓黃酮類化合物的合成和基因調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。