貴州茯茶散茶發(fā)花條件優(yōu)化及微生物多樣性分析

張舟瓊，曹霞，任錫毅，黃永會，劉永翔，譚玉梅*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006）（2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,貴州貴陽 550006）

茯磚茶，也稱“金花茶”，屬于后發(fā)酵茶，在黑茶市場中深受歡迎[1]。作為傳統(tǒng)的茶葉產(chǎn)品之一，因其獨特的品質(zhì)風味及突出的保健作用被廣大消費者所認可[2-4]。但傳統(tǒng)的茯磚茶加工工藝復(fù)雜繁瑣、發(fā)花時間長、質(zhì)量不可控、磚茶不便于攜帶和沖泡等嚴重阻礙了該茶的發(fā)展。

為了解決這些問題，“散茶發(fā)花”這一概念應(yīng)運而生?！吧⒉璋l(fā)花”指的是在茶葉上進行人工接種“金花菌”并通過調(diào)節(jié)條件使其提前發(fā)花，產(chǎn)生大量金黃色閉囊殼（俗稱“金花”）的過程[5,6]。賈洪信等[7]以湖南地區(qū)不同處理的金湘黑毛茶為原料，研究其發(fā)花過程。結(jié)果表明金湘黑毛茶發(fā)花的最佳條件為含水量28%～32%（m/m）、接種量0.5‰～1.0‰（m/m）、溫度28 ℃；秦俊哲等[8]通過人工接種冠突曲霉發(fā)酵陜西涇渭黑毛茶制作散茯茶，得出最適發(fā)酵條件為含水量40%（m/m）、渥堆溫度50 ℃和接種量0.12%（m/m）。發(fā)花條件的優(yōu)化能使散茶發(fā)花好，生產(chǎn)周期縮短，提高茶葉產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。目前關(guān)于“散茶發(fā)花”的研究多集中在湖南、陜西、浙江等地，且不同產(chǎn)地、不同原料的茶葉在散茶發(fā)花工藝上有所差別[9,10]。

貴州茶樹品種資源豐富，2022年，貴州省茶園總面積700萬畝，但產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一[11]，80%以上夏秋茶資源得不到充分利用，茯磚茶為夏秋茶的利用提供了有利條件[12]。安順鎮(zhèn)寧縣是貴州省重要名優(yōu)茶葉產(chǎn)區(qū)，鎮(zhèn)寧團葉茶作為有名的夏秋茶，茶葉味苦，口感較澀，品質(zhì)雖比不上春茶，但其營養(yǎng)價值高。而發(fā)花工藝的優(yōu)化能夠改善夏秋茶的滋味和品質(zhì)，提高茶葉質(zhì)量[7]。因此探究貴州“散茶發(fā)花”的最佳工藝條件，能夠提高貴州夏秋茶的質(zhì)量和品質(zhì)。

之前的研究多集中于磚茶工藝條件優(yōu)化及冠突曲霉孢子液直接接種于黑毛茶，對散茯茶發(fā)花工藝及純菌種制備發(fā)酵劑的研究較少[13]。而人工接種純種發(fā)酵劑，可促進“金花菌”的快速繁殖，縮短茯茶的“發(fā)花”周期，有效改善茯茶品質(zhì)[14,15]。發(fā)花過程是多種微生物共同參與的發(fā)酵過程，能促使散茶形成獨特的色澤、香氣和滋味[16-19]。研究表明，“散茶發(fā)花”后微生物的變化是影響茯磚茶品質(zhì)和風味的關(guān)鍵[20]。而不同產(chǎn)地、不同原料的散茯茶中微生物群落組成不同，所以需要對貴州黑毛茶發(fā)花過程中微生物多樣性進行研究。因此，本研究在前期發(fā)酵劑的制備基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化散茶發(fā)花條件，通過探究發(fā)花過程中真菌微生物多樣性的變化規(guī)律和主要的理化成分變化規(guī)律對茶品質(zhì)的影響，建立穩(wěn)定的散茶發(fā)花工藝，為茯磚茶穩(wěn)定生產(chǎn)及其深加工產(chǎn)品研發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突曲霉（Aspergillus cristatus，菌株保藏號為：CGMCC 7.193）由貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存；黑毛茶（品種：鎮(zhèn)寧團葉）為貴州安順地區(qū)采集；發(fā)酵劑由實驗室自制，用于人工接種[21]。

5%（m/V）NaCl MYA培養(yǎng)基：麥芽提取物20 g/L、蔗糖30 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 50 g/L、瓊脂粉15 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SS-325高壓滅菌鍋，日本Tomy Kogyo公司；Milli-Q A10超純水機，Millipore公司；5418型低速離心機，德國Eppendorf公司；THZ-98恒溫搖床，上海一恒儀器有限公司；超凈工作臺、普通冰箱及其它小型儀器均為國產(chǎn)儀器。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備

基于實驗室前期茯磚茶最佳制備工藝進行金花發(fā)酵劑的制備[21]，散茶40～50 ℃干燥1 d后常溫保存。

1.3.2 散茶發(fā)花工藝流程

原料選擇→含水量調(diào)節(jié)→滅菌→接種→發(fā)花→包裝→散茯茶成品

1.3.3 人工接種散茶發(fā)花工藝優(yōu)化

稱取400 g黑毛茶，將設(shè)置好的含水量（31.96%，m/m）用噴壺均勻地噴灑在黑毛茶上，密封滅菌10 min，取出，冷卻，用制備好的發(fā)酵劑進行接種，置于恒溫培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)相應(yīng)溫度，濕度70%培養(yǎng)，放入烘箱70 ℃，烘干4 h；設(shè)置不同的含水量（10%、20%、30%、40%、50%，m/m）、溫度（20、24、28、32、36 ℃）及接種量（0、1:10、1:100、1:1 000、1:10 000，m/m），觀察不同發(fā)酵時間（3、5、7、9、11 d）對散茯茶發(fā)花的影響，每個實驗重復(fù)三次，取平均值。

以單因素實驗為基礎(chǔ)，以含水量、溫度、接種量和發(fā)酵時間為因素設(shè)計L9（34）正交實驗，以孢子數(shù)為測量指標，確定散茶發(fā)花最優(yōu)工藝，正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.3.4 冠突曲霉孢子數(shù)量測定

取1 g散茯茶，放入滅菌過的三角瓶，加入滅菌水和適量的玻璃珠，搖勻震蕩過濾，無菌水沖洗3～5次，100倍稀釋孢子液，用血球計數(shù)板計數(shù)，公式如下：

式中：

n——孢子數(shù)量，每毫升中的個數(shù)。

N——采用25×16規(guī)格的血球計數(shù)板，5個中方格孢子總數(shù)[15]。

1.3.5 理化指標分析方法

理化指標測定及感官品質(zhì)評審委托國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心進行。水分檢測：GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》；水浸出物檢測：GB/T 8305-2013《茶 水浸出物的測定》；游離氨基酸檢測：GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測定》；茶多酚檢測：GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；總灰分檢測：GB 5009.4-2016《茶 總灰分的測定》。感官評定方法參考GBT 23776-2009。

1.3.6 高通量測序

同一批發(fā)酵茶分別取0、3、6、9 d后的散茯茶樣品于-80 ℃低溫保存。取25 g茶樣與125 mL無菌水混合，加玻璃珠，充分震蕩混勻，靜置20 min；搖床（150 r/min）震蕩15 min，超聲波洗菌10 min（12 000 Hz）。用三層無菌紗布過濾后，4 ℃，離心10 min（18 000 r/min）。編號0 d為A組（A1、A2、A3）、3 d為B組（B1、B2、B3）、6 d為C組（C1、C2、C3）、9 d為D組（D1、D2、D3），共12組，通過E.Z.N.A土壤DNA試劑盒提取微生物基因組DNA。

Illumina Miseq 高通量基因測序委托北京百邁克生物科技有限公司完成。DNA序列測序、拼接、質(zhì)控及生物信息學分析由該公司協(xié)助完成。具體如下：

PCR產(chǎn)物合并：提取樣品總 DNA 后，根據(jù)全長引物序列合成帶有 Barcode 的特異引物，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物進行進行濃度（Qubit）和條帶（瓊脂糖凝膠電泳）的檢測，符合條件的樣品進行混樣。

建庫測序：對PCR產(chǎn)物定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫再進行上機測序。

質(zhì)控分析：Miseq測序結(jié)果是雙端序列數(shù)據(jù)，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和拼接的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

用USEARCH軟件包中的UPARSE對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)按照3%序列差異的標準，序列按照標準進行OTU聚類歸組[22,23]；在每個OTU聚類中，選擇豐度最高的序列作為該OTU代表性序列，并對OTU代表序列進行分類學分析（RDP classifier貝葉斯算法），最后生成一個OTU表。表中對每個樣品的群落組成情況在各個分類水平（界、門、綱、目、科、屬、種）描述，設(shè)置置信閾值為70%，各分類學水平下的群落結(jié)構(gòu)圖使用R語言工具繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 含水量對散茶發(fā)花的影響

含水量對茯磚茶發(fā)花具有重要影響[7]。本實驗研究了不同含水量對散茶發(fā)花的影響（表2），結(jié)果表明，當含水量為10%（m/m）時，冠突曲霉孢子數(shù)為2.3×108CFU/mL，發(fā)花較少且不均勻；含水量增加到30%（m/m）時，冠突曲霉孢子數(shù)增加，滋味醇和且有菌花香；含水量增加到50%（m/m）時，冠突曲霉孢子數(shù)減少將近1倍，口感欠純正。本研究結(jié)果表明含水量過低，冠突曲霉的生長受到抑制；含水量過高，其他雜菌大量生長，冠突曲霉孢子數(shù)變少。在本研究中，含水量30%時最有利于冠突曲霉的生長。

表2 含水量對冠突曲霉孢子數(shù)及感官評審的影響Table 2 The influence of water content on the number of Aspergillus cristatus and sensory evaluation

2.1.2 接種量對散茶發(fā)花的影響

接種量是影響發(fā)花的一個重要指標。本實驗研究不同接種量對發(fā)花的影響，結(jié)果表明（表3），當接種量比例為1:10時，金花茂盛且茶滋味醇和，冠突曲霉數(shù)孢子數(shù)較少，為2.5×108CFU/mL；當接種量比例為1:100時，冠突曲霉孢子數(shù)顯著增加為3.4×108CFU/mL，茶滋味醇和且有菌花香；當接種發(fā)酵劑過少時（1:1 000），發(fā)花不均勻且影響滋味。推測是由于發(fā)酵過程中菌體基數(shù)較大，微生物營養(yǎng)供給不足導(dǎo)致冠突曲霉孢子數(shù)較少，導(dǎo)致發(fā)花不完全；而發(fā)酵劑過多，在工藝上會導(dǎo)致大量發(fā)酵劑的浪費。本研究中最佳接種量為1:100時，冠突曲霉孢子數(shù)多，滋味好。

表3 接種量對冠突曲霉孢子數(shù)及感官評審的影響Table 3 The influence of inoculation amount on the number of Aspergillus cristatus and sensory evaluation

2.1.3 溫度對散茶發(fā)花的影響

發(fā)花是通過控制一定的溫度促使微生物的優(yōu)勢菌種生長，從而產(chǎn)生大量金黃色的閉囊殼。因此控制適宜的溫度能提高發(fā)花質(zhì)量。從表4可以看出，當發(fā)酵溫度為20～24 ℃時，冠突曲霉生長較慢，發(fā)花不均勻且冠突曲霉孢子數(shù)較少；當溫度在28 ℃時，金花茂盛且滋味醇和，冠突曲霉孢子數(shù)達到最大為2.6×108CFU/mL；隨著溫度的持續(xù)升高，冠突曲霉的生長受到抑制，冠突曲霉孢子數(shù)也開始降低，雜菌生長導(dǎo)致茶滋味較差。本研究中，28 ℃是冠突曲霉最適生長溫度。

表4 溫度對冠突曲霉孢子數(shù)及感官評審的影響Table 4 The influence of temperature on the number of Aspergillus cristatus and sensory evaluation

2.1.4 發(fā)酵時間對散茶發(fā)花的影響

發(fā)酵時間對冠突曲霉生長起著重要作用。由表5可知，當發(fā)花到3 d時，微發(fā)花；當發(fā)花到7 d時，發(fā)花茂盛且口感醇和，冠突曲霉孢子數(shù)達到最大為3.6×108CFU/mL；當發(fā)花時間為11 d時，金花茂盛，滋味醇和，但隨著發(fā)酵時間的增加，散茯茶營養(yǎng)物質(zhì)消耗完，冠突曲霉生長緩慢。過長的發(fā)花時間在工藝上會降低生產(chǎn)效率。張銳[24]對散茶發(fā)花工藝優(yōu)化表明，在最佳發(fā)酵條件下，其冠突曲霉孢子數(shù)為2.58×108CFU/mL；而冠突曲霉發(fā)酵杜仲茶的最優(yōu)條件下孢子數(shù)僅為1.13×106CFU/mL[25]，低于本研究得到的孢子數(shù)。

表5 發(fā)酵時間對冠突曲霉孢子數(shù)及感官評審的影響Table 5 The influence of fermentation time on the number of Aspergillus cristatus and sensory evaluation

2.2 散茶發(fā)花過程中感官審評與理化成分變化規(guī)律分析

在茶葉加工過程中，理化成分的變化對茶葉品質(zhì)和滋味有顯著的影響。影響茯磚茶滋味的成分主要有：氨基酸、水浸出物、茶多酚等[26]。有研究表明，散茯茶加工過程中茶多酚呈下降趨勢，從原料到成品相對下降幅度可達54.62%[27]；本研究中茶多酚含量總體也呈下降趨勢（圖1）。從圖1a可以看出，發(fā)花初期3 d時茶多酚含量為11.6%，到發(fā)花末期11 d時散茯茶中茶多酚含量為9.4%，其相對下降幅度為18.9%；這也與張銳[24]的研究結(jié)果一致。推測是由于在發(fā)酵過程中，濕熱作用能在較短時間內(nèi)促進茶葉內(nèi)含物質(zhì)的氧化、聚合、降解、轉(zhuǎn)化等[28]，冠突曲霉菌體代謝越旺盛，分泌的胞外酶越多，茶多酚及咖啡堿等轉(zhuǎn)化成一些小分子風味物質(zhì)就多，磚茶的品質(zhì)也就越好[29-31]。而發(fā)花7 d時茶多酚的含量上升，可能是由于不同茶樹上采集的茶葉本身茶多酚含量差別較大的原因，7 d時采集到的茶葉茶多酚含量本身較其他同時間段的茶葉茶多酚含量高，張銳[24]的研究中茶多酚含量為14.08%～18.81%，黃浩等[32]的研究中不同茶葉茶多酚含量從6.13%～13.24%不等，這表明不同茶葉茶多酚含量差異較大。茶多酚是茯磚茶中澀味的主要來源成分，這種苦澀味主要是茶多酚中的酯型兒茶素帶來，在茯磚茶的加工過程中，酯型兒茶素轉(zhuǎn)化為簡單兒茶素，使茯磚茶滋味醇和，同時，部分兒茶素也轉(zhuǎn)化形成茶色素，從而使得茯磚茶湯色明亮、橙紅[33]。本研究中在發(fā)花第9天時茶葉茶湯橙色、明亮、滋味醇和，是由于茶多酚在發(fā)酵第9天時含量大幅度下降，多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成一些小分子風味物質(zhì)，減少了茯茶的粗澀味，增加了醇和味道。

圖1 散茶發(fā)花過程中主要理化成分含量變化Fig.1 The content change of main components in the process of Loose Fu-Tea

水浸出物含量是評價茶葉品質(zhì)好壞的標準之一，水浸出物的含量與茶葉的內(nèi)含物質(zhì)成正比[34]。研究表明，時間越長，茶水水浸出物含量越低。從圖1可以看出，水浸出物含量呈現(xiàn)一個動態(tài)變化的過程。圖1a中水浸出物表現(xiàn)為先增加后降低，但下降幅度并不顯著，相對減少幅度為4.2%。推測主要原因為微生物維持生長需要消耗部分的水浸出物，水解反應(yīng)也使難溶性大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能溶于水的小分子物質(zhì)，導(dǎo)致水浸出物的含量增加。而水溶性物質(zhì)之間互相轉(zhuǎn)化生成難溶性物質(zhì)，所以水浸出物含量又降低，因而，雙向變化最終使水浸出物含量在發(fā)花過程中有所減少[32]。而在不同含水量條件下（圖1d）水浸出物含量不斷增加，茶葉內(nèi)含物質(zhì)也不斷豐富。水浸出物是茯磚茶中的呈味物質(zhì)，與茯磚茶滋味、湯色、色澤等密切相關(guān)[35]。本研究中水浸出物含量豐富，遠高于國標規(guī)定（≥20.0%）的合格茯磚茶產(chǎn)品，對發(fā)酵茶的紅艷湯色和滋味有積極作用。

圖1可以看出，隨著發(fā)酵時間增加，游離氨基酸含量減少，但減少幅度不顯著。推測是由于在發(fā)酵過程中，微生物分泌出多種酶類使部分的蛋白質(zhì)水解成為氨基酸。但由于冠突曲霉的孢子數(shù)量急劇上升，需要大量的營養(yǎng)成分來滿足微生物自身生長繁殖、代謝的需要，蛋白質(zhì)水解的氨基酸又被作為碳源或氮源消耗，這一雙向變化最終使游離氨基酸含量在發(fā)花過程中略微減少。研究表明茶葉中游離氨基酸是茶葉滋味與香氣形成的前體物質(zhì)，是茶葉獨特滋味的重要成分之一[36]。本研究中游離氨基酸總體變化不大，在游離氨基酸的協(xié)同作用下，茶葉收斂苦澀、滋味醇和甘厚。

2.3 正交實驗結(jié)果

以單因素實驗為基礎(chǔ)，含水量、接種量、溫度及發(fā)酵時間4個因素，以冠突曲霉數(shù)為評價指標，進行L9（34）正交實驗，正交實驗結(jié)果見表6。

表6 正交實驗結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment

由表6可知，影響散茶發(fā)花因素主要是A＞D＞C＞B，即含水量＞接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度。通過正交試驗結(jié)果得知，散茶發(fā)花最佳工藝條件為A2B1C3D2，即含水量30%（m/m）、溫度24 ℃、發(fā)酵時間9 d、接種量1:100（m/m）。但在正交實驗中并未出現(xiàn)這一組合，因此再對實驗進行驗證，對散茶發(fā)花最優(yōu)組合（A2B1C3D2）進行3次平行試驗，記錄冠突曲霉孢子數(shù)取平均值。得到該條件下的冠突曲霉孢子數(shù)為3.0×108CFU/mL，水分含量為3%（m/m），茶多酚含量為12%（m/m），水浸出物含量42.6%（m/m），游離氨基酸含量為2.4%（m/m），總灰分含量為6.8%（m/m）。從研究結(jié)果表7可知，黑毛茶通過發(fā)花形成散茯茶，理化性質(zhì)明顯優(yōu)于原茶及散茯茶，也優(yōu)于國標GB/T 9833.3-2013茯磚茶中的理化指標，說明成品散茯茶完全能達到國家標準。在此條件下散茯茶金花茂盛，香氣純正，滋味醇和。

表7 成品散茯茶理化性質(zhì)含量Table 7 Physicochemical properties and contents of finished Loose Fu-Tea

2.4 發(fā)花過程中真菌群落的優(yōu)勢菌屬及真菌多樣性分析

2.4.1 分類學分析

根據(jù)物種注釋情況，對不同水平各個樣品群落組成進行統(tǒng)計，分為4個門、14個綱、21個目、27個科、30個屬。說明散茯茶在發(fā)花過程中的真菌多樣性較為豐富，選取豐度最高的10個屬進行豐度變化分析。

2.4.2 屬的分類水平上的相對豐度

在屬的分類水平上，如圖2所示，在0 d時，樣品A1、A2、A3真菌的多樣性高，分別有粗糙孔菌屬（Trechispora）、酒香酵母屬（Brettanomyces）、球殼菌屬（Plectosphaerella）、鐮刀霉屬（Fusarium）、畢赤酵母屬（Pichia）、分子孢子菌屬（Cladosporium）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、被孢霉屬（Mortierella）和曲霉屬（Aspergillus）。在發(fā)酵初期（A1、A2、A3），曲霉屬（Aspergillus）相對豐度最高，分別達90.3%、98.1%、96.5%，其余9組樣品（發(fā)酵3、6、9 d）曲霉屬豐度均高于98.8%，是絕對優(yōu)勢屬。黑毛茶發(fā)酵初期實際上是以冠突曲霉為主體多種微生物共同參與的過程，加工中除了優(yōu)勢菌-冠突曲霉之外，還伴生有其他曲霉、孢子菌、酵母菌和大量的細菌，而非冠突曲霉單一菌種的演變，獨特品質(zhì)和風味的形成也是多種微生物共同作用的結(jié)果。

圖2 屬分類水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance at the phylum classification level

2.4.3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

用于衡量Alpha多樣性的指數(shù)主要有Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）等。其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)與物種豐富度正相關(guān)；Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)越小，則群落多樣性越大[37]。由表8可知，A組發(fā)酵時間起始時（0 d）的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高，說明在黑毛茶初始階段真菌多樣性及豐富度最高。隨著發(fā)酵時間增加，以冠突曲霉為主的微生物占據(jù)主要優(yōu)勢，其他微生物種類逐漸減少，多樣性相應(yīng)降低。到發(fā)酵第9天時，發(fā)花效果較好，優(yōu)勢菌種增多，真菌群落多樣性降低。

表8 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計量Table 8 Alpha diversity index statistics

2.4.4 真菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）能反應(yīng)樣品間的相似性，樣品距離越近，其組成越相似[38]。如圖3所示，主成分對樣品差異貢獻值為99.77%，表明圖3較好地反映出各組之間的種群結(jié)構(gòu)差異能夠通過圖較好地反映出來。圖中B組、C組、D組距離較近，A組距離較遠，說明B組、C組、D組的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，A組樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)及豐度與其他組差異較大。而A組內(nèi)樣品間距離也較遠，說明剛開始發(fā)酵時，散茯茶內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，微生物種類多。而發(fā)酵到后期以冠突曲霉為主，微生物組成相似，這也與上述結(jié)果一致。

圖3 主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis diagram

3 討論

探究散茶發(fā)花最佳工藝實質(zhì)上是綜合評估水分、接種量、發(fā)酵時間和溫度等因素對發(fā)花質(zhì)量影響。加工過程實質(zhì)也是以冠突曲霉為主多種微生物共同參與的復(fù)雜的發(fā)酵過程。散茶發(fā)花工藝對散茯茶品質(zhì)至關(guān)重要，但目前貴州散茯茶發(fā)花工藝研究不足。其他學者[39,40]對發(fā)花工藝做了大量研究，研究結(jié)果表明，冠突曲霉具有很強的適生性，與其生產(chǎn)環(huán)境和加工工藝有很大關(guān)系。而環(huán)境和工藝的不同會導(dǎo)致發(fā)花過程中的微生物多樣性不同，這也是不同地域生產(chǎn)的茯磚茶品質(zhì)和口感不同的原因。

影響發(fā)花質(zhì)量的因素很多，涉及生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)。在本研究以鎮(zhèn)寧團葉黑毛茶為原料，將發(fā)酵劑接種黑毛茶，進行發(fā)花工藝條件的優(yōu)化。研究結(jié)果表明，最佳工藝條件為：原料含水量30%（m/m），接種量為1%（m/m），溫度24 ℃、發(fā)酵時間9 d。在此條件下，茶葉品質(zhì)好，金花茂盛，孢子數(shù)多，滋味醇和，金花香氣濃郁。秦俊哲等[8]人工接種冠突曲霉發(fā)酵制作散茯茶，其適宜發(fā)酵條件含水量為40%（m/m），最佳接種量為0.12%（m/m）；李飛鳴等[41]以桑葉毛茶和黑毛茶混合作為茶坯原料，人工接種冠突曲霉發(fā)酵制成散茯茶，茶坯含水量為28%（m/m）；賈洪信[7]的研究表明散茶接種量為0.5‰～1.0‰（m/m）時最有利于發(fā)花。含水量的高低顯著影響冠突曲霉的生長，當含水量過低時，影響冠突曲霉生長；含水量過高，霉菌等許多雜菌容易生長，導(dǎo)致冠突曲霉生長代謝受阻，抑制菌落生長，減弱產(chǎn)孢能力，影響散茯茶口感。而接種量也是影響發(fā)花的一個重要指標[42]。當冠突曲霉接種量較少時，發(fā)花不均勻；接種量越多，冠突曲霉越容易生長成優(yōu)勢菌，其生長代謝旺盛，能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物。但接種量過大時，底物的含量有限，在工藝上會造成發(fā)酵劑大量的浪費，對微生物的生長也有影響[43]。研究表明散茶發(fā)花工藝的最適溫度范圍是24～30 ℃[39,40,44]，本實驗室前期對冠突曲霉的生長發(fā)育進行研究發(fā)現(xiàn)，24～28 ℃是最有利于“金花菌”生長的溫度范圍；最適發(fā)酵時間從7～10 d不等，因為發(fā)酵時間的長短影響散茯茶的品質(zhì)，發(fā)酵天數(shù)較少，冠突曲霉生長周期可能不完全，發(fā)酵不徹底。若發(fā)酵天數(shù)過長，不利于生產(chǎn)，降低生產(chǎn)效率[39,40]。以上結(jié)果表明，不同研究中由于原料、地域、加工環(huán)境等的不同，散茯茶最佳發(fā)花條件有所差異。研究者們對散茶發(fā)花工藝的研究多為直接接種冠突曲霉孢子液。而本研究通過制作發(fā)酵劑接種，顯著改善了黑毛茶的發(fā)花效果，縮短發(fā)花時間，在工藝改良取得了成功。

“散茶發(fā)花”其獨特的發(fā)花工序，是通過控制一定的溫度、濕度條件，促使優(yōu)勢微生物生長繁殖，使茶葉內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生了復(fù)雜的變化過程，這一過程伴隨著微生物發(fā)酵。微生物在散茶發(fā)花過程中扮演著重要的作用，我們對不同發(fā)酵天數(shù)的散茯茶微生物多樣性進行了研究。結(jié)果表明，發(fā)酵起始時微生物多樣性高，包含較多種屬；發(fā)酵3 d之后曲霉屬（Aspergillus）相對豐度達到98.8%，成為絕對優(yōu)勢屬。表明茯磚茶加工中除了接種的優(yōu)勢菌冠突曲霉菌之外，還存在其他各種大量真菌，并非只是冠突曲霉單一菌種的發(fā)酵過程。而隨著發(fā)酵時間的延長，其他各種大量真菌受冠突曲霉這一優(yōu)勢菌種及其他環(huán)境條件（含水量、溫度、接種量等）的影響，在優(yōu)勝劣汰的自然選擇后，微生物群落發(fā)生了時間和空間上的變化。這與趙仁亮等[45]的研究結(jié)果相似。趙仁亮等采用Illumina MiSeq技術(shù)分析不同地區(qū)茯磚茶微生物多樣性的研究表明，不同地區(qū)的茶葉產(chǎn)品真菌群落存在差異，其中曲霉屬Aspergillus在茯磚茶產(chǎn)品中相對豐度均為92%以上。其相對豐度略低于本研究中采集到的（98.8%）。Li等[46]研究了茯磚茶產(chǎn)品的加工過程中微生物群落變化，結(jié)果表明，在加工過程中曲霉屬相對豐度均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這也與本研究結(jié)果吻合。由于冠突曲霉能夠直接反映茯磚茶的品質(zhì)，因此，茯磚茶中曲霉屬的豐度越高，表明條件控制得越好，品質(zhì)也越高。

貴州茶葉歷史已有100萬余年，但以綠茶發(fā)展為主線的思維占據(jù)主導(dǎo)，導(dǎo)致茶葉結(jié)構(gòu)單一。貴州黑茶的研究起步較晚，近十年才受到廣泛關(guān)注。夏秋茶資源浪費嚴重，目前貴州黑茶主要以茯磚茶為主，品種單一，市場認可度低。因此做好安順黑茶產(chǎn)業(yè)能夠豐富貴州茶資源，促進貴州茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[47]。本研究以貴州安順地區(qū)的鎮(zhèn)寧團葉作為原料，人工接種“金花菌”發(fā)酵劑，工藝優(yōu)化后形成品質(zhì)優(yōu)良的散茯茶，豐富了貴州黑茶產(chǎn)業(yè)的研究，對促進貴州黑茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，首次對貴州安順鎮(zhèn)寧團葉進行接種，將冠突曲霉接種到黑毛茶中制成發(fā)酵劑再接種到黑毛茶上，進行“散茶發(fā)花”，并成功優(yōu)化了散茯茶的發(fā)花工藝。確定最佳發(fā)花工藝條件為：含水量30%（m/m）、溫度24 ℃、發(fā)酵時間9 d、接種量1:100（m/m）。在此條件下冠突曲霉數(shù)為3×108CFU/mL，水分含量為3%（m/m），營養(yǎng)成分豐富，金花茂盛，香氣純正，滋味醇和。進一步利用高通量測序技術(shù)進行多樣性分析，揭示貴州地區(qū)散茶發(fā)花過程中的微生物多樣性，解決了散茯茶發(fā)花難、發(fā)花易污染的工藝難題，為茯茶生產(chǎn)提質(zhì)增效提供技術(shù)支持。發(fā)花工藝技術(shù)改進是提高茯磚茶品質(zhì)的重要關(guān)鍵技術(shù)，為深加工產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供一定的實踐指導(dǎo)意義。