河鲀毒素的檢測技術(shù)與應用*

楊成芳 郭 晗 趙魯明 王梁華

（海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，上海 200433）

海洋生物毒素是微藻、微生物等多種海洋生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，可在魚類、貝類等組織中積累，經(jīng)食物鏈傳遞至人類，導致人類中毒或死亡事件的發(fā)生。在沿海地區(qū)的食物中毒事件中，河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）中毒較為常見且病死率較高［1］，對食品安全與人類健康造成了嚴重威脅，故TTX是重要的生物安全風險因子，需警惕并加強監(jiān)管。在法規(guī)方面，日本政府規(guī)定河鲀魚組織中的TTX含量不得超過2 mg/kg［2］，歐洲則禁止四齒豚科魚類流入市場，同時，針對貝類中的TTX，歐洲食品安全局建議貝類中的TTX不得超過44 μg/kg［3］。為方便監(jiān)管部門日常監(jiān)測，保障人類食用海產(chǎn)品的安全性，有效防范TTX污染的食品流入市場，發(fā)展快速、靈敏、有效、可靠的分析方法來檢測這些TTX對于海產(chǎn)品管理和預防食源性中毒至關(guān)重要。

1 TTX是重要的生物安全風險因子

1.1 結(jié)構(gòu)

20 世紀60 年代，Woodward［4］、Tsuda［5］、Goto［6］團隊分別解析了TTX的結(jié)構(gòu)（圖1），為氨基全氫喹唑啉，分子質(zhì)量為319 u，分子式為C11H17N3O8，是罕見的籠狀分子，有一個胍基連接在高含氧碳骨架上，碳骨架由2,4-二氧雜金剛烷結(jié)構(gòu)組成，并修飾有5個羥基。TTX至少有27種衍生物，其結(jié)構(gòu)與分子式分別如圖2與表1所示，因其衍生物難以實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)故限制了其研究進展。

Table 1 TTX and its analogues表1 TTX及其類似物

Fig.1 The structure of TTX［7］圖1 TTX的結(jié)構(gòu)［7］

Fig.2 Analogues from TTX［8］圖2 TTX衍生物［8］

1.2 致死劑量

TTX是毒性極強的麻痹性生物堿毒素，毒性是氰化物的1 000倍［9］。TTX對昆明小鼠腹腔注射、皮下注射、灌胃給藥LD50值分別為：10.7、12.5、532 μg/kg，LD99值分別為：12.5、14.5、622 μg/kg，且雄性小鼠比雌性的毒性反應更敏感。TTX對大耳白家兔肌肉注射給藥與靜脈注射給藥的最低致死劑量為5.3 μg/kg與3.1 μg/kg，全死劑量為5.8 μg/kg與3.8 μg/kg［10］。推斷50 kg成人的最小致死劑量僅為2 mg［2］，該毒性劑量可能會因年齡、健康狀況和對毒素的敏感性等個體因素存在一些差異。

1.3 作用機制

TTX發(fā)揮毒性作用機制（圖3）為帶正電的胍基基團通過靜電吸附作用與神經(jīng)、肌肉細胞上電壓門控性 Na+通道（voltage-gated Na+channel，VGSC）的氨基酸殘基高效結(jié)合，從而形成空間位阻，阻礙Na+通過神經(jīng)細胞的細胞膜［11］，從而阻止動作電位的產(chǎn)生，進而引發(fā)一系列機體功能紊亂。迄今為止，已從哺乳動物中成功鑒定出10種VGSC亞型。根據(jù)α亞基的差異，分別命名為Nav1.1～Nav1.9 和 NavX。其中 Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7對TTX高度敏感，主要表達于骨骼肌和神經(jīng)系統(tǒng)［12］。

Fig.3 TTX toxicity mechanism［13］圖3 TTX作用機制示意圖［13］

1.4 中毒表現(xiàn)

TTX中毒后的臨床表現(xiàn)見表2。

Table 2 Clinical classification of TTX poisoning［1，8，14］表2 TTX中毒的臨床分級［1，8，14］

1.5 臨床治療

目前，尚無TTX特效解毒劑，對于TTX中毒患者的治療多為對癥治療。在孟加拉國TTX中毒事件中［15］，21名患者被給予新斯的明和阿托品肌松拮抗藥，但未見其改善病情。泰國TTX中毒事件［16］的治療表明，為TTX中毒患者提供呼吸支持直至TTX排出體內(nèi)可降低病死率，245例患者接受氣管插管和機械通氣治療，其中239例（97.5%）完全恢復，5例（2%）死亡，1例（0.4%）出現(xiàn)缺氧性腦損傷。在TTX中毒早期，可使用活性炭減少TTX在胃中的釋放［17-18］。在中毒后60 min內(nèi)，可通過洗胃來干預病情惡化，但洗胃治療可能導致喉痙攣、鼻出血、水中毒或機械性胃損傷等并發(fā)癥［19］。

2 TTX檢測技術(shù)

TTX可通過食物鏈蓄積，在海洋生物體內(nèi)傳遞并富集，因誤食TTX而導致的中毒事件在日本［2］、澳大利亞［14］、孟加拉國［15］均有報道。中國浙江、江蘇、福建近海領域螺類TTX污染較為嚴重，春夏季是毒素污染的高發(fā)期，遼寧與天津近海領域捕撈的河鲀魚體內(nèi)TTX水平較高［20］。鑒于TTX中毒事件給公共安全與食品安全帶來了巨大挑戰(zhàn)，TTX的檢測能夠起到風險預警的作用，為監(jiān)管TTX提供技術(shù)保障?；跈z測原理可將傳統(tǒng)檢測方法分為：生物檢測法、化學檢測法與免疫檢測法。近年來，隨著適配體技術(shù)的發(fā)展，以適配體作為新型檢測元件的適配體檢測技術(shù)也蓬勃發(fā)展。

2.1 檢測樣品制備

在實驗室的實際檢測中檢測樣品的制備方式有兩種，一是直接從有毒動物組織中提取TTX，二是將無毒組織中摻入商品化TTX。提取TTX的過程涉及樣品前處理方式的差異，首先是提取液的必要成分乙酸濃度的差異，提取液的種類是否含有甲醇及其他有機溶劑，其次是稱取樣品的重量差異，再次是具體處理流程的差異。同樣，摻入商品化TTX的樣品制備方法根據(jù)實驗設計也有諸多方案，樣品制備作為實際檢測特別關(guān)鍵的一環(huán)，需要嚴格的標準化制備方式。實驗室實際檢測應參照最新的GB 5009.206-2016《食品安全國家標準水產(chǎn)品中河豚毒素的測定》，該標準不僅規(guī)定了傳統(tǒng)的生物、化學、免疫檢測的標準方法，同樣規(guī)定了各種檢測方法中樣品提取的標準方法。

2.2 以TTX毒性特性為基礎的生物檢測法

小鼠生物法作為最早且使用最廣泛的TTX檢測方法［21］，是一種針對TTX毒性的檢測方法，曾被日本、美國等作為標準方法。其操作方法為選取20～22 g無特定病原體的健康雄性小鼠［22］，通過腹腔注射不同濃度的TTX，觀察并記錄小鼠的死亡時間。根據(jù)小鼠死亡時間與劑量呈線性關(guān)系，進而實現(xiàn)TTX的定量檢測。TTX的毒力用“鼠單位”（mouse unit，MU）表示，1 MU是指向小鼠腹腔中注射一定劑量的TTX，使小鼠在30 min內(nèi)死亡的最小劑量［23］。該方法優(yōu)勢在于操作簡單、直觀，不足在于結(jié)果易受小鼠的體重與健康程度、飼養(yǎng)條件等個體差異影響，因此重復性差。小鼠生物法檢測結(jié)果還受TTX溶液中其他溶劑的影響，難以運用于臨床血樣與尿液的檢測，需要一定數(shù)量的小鼠才能反映TTX的毒性水平，難以實現(xiàn)樣品中TTX的準確定量，大量使用活體小鼠在倫理上存在爭議。同時，難以通過小鼠的中毒癥狀區(qū)分TTX與其類似物以及石房蛤毒素（saxitoxin，STX）等麻痹性貝類毒素。

1978年，《日本食品衛(wèi)生檢驗手冊》［24-25］將小鼠生物法作為官方TTX檢測方法。1995年，《美國官方分析化學家協(xié)會官方分析方法》［24］也將小鼠生物法定為麻痹性貝類毒素的標準檢測方法。目前，小鼠生物法被廣泛應用于TTX實際檢測中，Indumathi等［26］采用0.1%的乙酸溶液萃取印度泰米納度的欽奈海岸捕獲的橫紋東方豚組織中TTX，并利用小鼠生物法檢測其毒性。其選擇了體重在18～22 g的雄性ddY小鼠，通過小鼠生物檢測，確定了橫紋東方豚的卵巢毒性最高（163 MU/g），其次是肝臟（143.33 MU/g）、皮膚（75.88 MU/g），肌肉組織無毒性。研究者同時采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）與高效液相色譜（HPLC）法對橫紋東方豚的毒性進行定性、定量檢測：GC-MS定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.05 mg，檢測限（limit of detection，LOD）為0.005 mg，結(jié)果顯示，10 g不同組織樣品中，卵巢TTX含量最高（34.5 μg），其次是肝臟（32.5 μg）和皮膚（16.5 μg）；HPLCLOQ為0.1 mg，LOD為0.01 mg，結(jié)果顯示，10 g不同組織樣品中，卵巢TTX含量最高（51 μg），其次是肝臟（48 μg）和皮膚（18 μg）。色譜檢測法與小鼠生物法檢測結(jié)果一致，驗證了小鼠生物法在毒性初步判斷方面準確可靠。

2.3 以TTX抗原特性為基礎的免疫檢測法

免疫檢測法是基于抗原抗體特異結(jié)合原理，對樣品中的TTX進行定性或定量檢測的方法。由于TTX體積較小，缺乏免疫原性，難以作為全抗原刺激免疫動物產(chǎn)生抗體。1989年，Huot等［27］通過甲醛將TTX偶聯(lián)于鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）上，從而使其形成全抗原，免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠。當小鼠體內(nèi)抗TTX抗體滴度達到最高水平時，將其脾內(nèi)B淋巴細胞與NS-1小鼠骨髓瘤細胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細胞，在所檢測的9 329個單克隆抗體中，337個（3.6%）抗體為抗TTX陽性。最終，分離到TD2C5和TD13al高度穩(wěn)定反應的單克隆抗體，IC50值分別為2×10-7mol/L與5×10-7mol/L，且不與STX產(chǎn)生交叉反應，具有較高的穩(wěn)定性和特異性。免疫檢測法優(yōu)勢在于其高度的靈敏度與特異性，且樣品消耗量少，檢測速度較快，制備成試劑盒后無需昂貴的設備與專業(yè)的操作人員，可用于TTX的現(xiàn)場檢測。其不足在于TTX抗體獲得難度較大，成本高且周期長，因此限制了其規(guī)模應用。最常用的TTX免疫檢測法主要包括酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbnent assay，ELISA）與膠體金免疫層析技術(shù)。

2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗

在早期TTX單克隆抗體制備過程中，常采用TTX偶聯(lián)于KLH作為全抗原免疫動物的方法，有研究指出這種方法難以產(chǎn)生高親和力的TTX抗體。Kawatsu等［28］在初步研究中用TTX-KLH偶聯(lián)物免疫的小鼠獲得的抗體對游離TTX沒有反應，于是改進了免疫原的制備過程：將0.1%乙酸萃取而得的TTX耦聯(lián)到牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）上作為全抗原免疫BALB/c小鼠，最終得到與4,9-anhydroTTX有輕微免疫交叉反應的TTX的單克隆抗體。進一步建立了快速靈敏的競爭性酶免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA），可在30 min左右實現(xiàn)TTX定量檢測，且定量分析的范圍為2～100 μg/L。除了TTX單克隆抗體，多克隆抗體的出現(xiàn)也為TTX檢測提供了新思路。由于TTX有一系列類似物，為了快速檢測實際樣品中TTX及其類似物的成分，Sato等［29］將4,9-anhydroTTX依次與1,2-乙二硫醇、KLH反應，然后免疫家兔，獲得與4,9-anhydroTTX、TTX、4-epiTTX、11-oxoTTX、5,6,11-trideoxyTTX均有免疫反應的多克隆抗體，從而建立了ELISA，對TTX、4-epiTTX、11-oxoTTX的LOD約為3 nmol/L，5,6,11-trideoxyTTX、4,9-anhydroTTX的LOD分別約為10 nmol/L、300 nmol/L，且不與阻滯Na+通道的麻痹性貝類毒素產(chǎn)生交叉反應，具有較好的特異性。

2.3.2 膠體金免疫層析技術(shù)

Huang等［30］成功地制備了兩種膠體金免疫層析試紙條用于TTX的高效靈敏檢測，其分別基于可增強信號的多支納米金（AuNF）和大粒徑乳膠微球（LM）兩種報告分子。所開發(fā)的免疫層析試紙對于的檢測具有良好的特異性和靈敏度：基于AuNF試紙的LOD為9.49 μg/L，基于LM試紙的LOD為5.40 μg/L。研究者試紙條檢測了黃魚、草魚、鱸魚和河鲀4個樣品，10 min內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，與ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致，在保障食品安全方面具有良好的應用前景。

免疫檢測法的關(guān)鍵在于抗體的獲得，而TTX無免疫原性，需設計偶聯(lián)物制備成全抗原，抗原的設計會極大影響抗體的性能。有研究發(fā)現(xiàn)，TTX與KLH偶聯(lián)免疫動物難以獲得高親和力的單克隆抗體，于是有學者改進了TTX的偶聯(lián)方式，將TTX與BSA偶聯(lián)作為全抗原，所得TTX抗體的親和力大大提升，僅與4,9-anhydroTTX有輕微的交叉反應，特異性也有所提高。針對各種水生生物中檢測TTX及其類似物，有學者將4,9-anhydroTTX的C4與KLH偶聯(lián)制備了新抗原，免疫家兔得到了多克隆抗體，其對TTX及多種類似物結(jié)合而不與其他麻痹性神經(jīng)毒素作用，被識別的TTX類似物的C9有一致性，因此推斷C9是多克隆抗體的識別的關(guān)鍵部位，與之前單克隆抗體作用的關(guān)鍵部位為C9與C10的結(jié)論一致。TTX全抗原的制備一般會保留其活性基團胍基，在此基礎上，未來應在偶聯(lián)物、偶聯(lián)部位的選擇上探索設計新抗原，以期獲得高親和力的TTX抗體。

2.4 以TTX化學特性為基礎的化學檢測法

TTX的化學檢測方法主要包括核磁共振（NMR）檢測法、GC-MS檢測法、液相色譜-熒光（LC-FLD）檢測法與液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）檢測法，這幾種方法不僅能夠檢測樣品中的TTX，同時還能夠分析TTX的類似物及其他毒素，從而更全面地評估風險。由于TTX及其類似物的熒光強度差異很大，如6-epTTX和11-norTTX-6（R）-ol的熒光強度分別比TTX高20倍和10倍，而5-deoxyTTX和11-deoxyTTX的熒光強度分別比TTX低1/20和1/100［31-32］，此外樣品基質(zhì)也會干擾背景信號，故LC-FLD不適合用于實際樣品的檢測分析。而NMR在實際樣品檢測中，也因樣品基質(zhì)組分的強烈干擾會影響光譜的質(zhì)量而受限。GC-MS雖已被用來檢測樣品中的TTX，但由于TTX是非揮發(fā)性的，在GC-MS分析前需要將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性C9堿衍生物，因此會產(chǎn)生重現(xiàn)性差的問題，同時衍生化需要大量的樣品，費時費力且成本較高。因此，LC-MS特別是LC-MS/MS是測定TTX及相關(guān)化合物的最佳選擇，在定量檢測方面擁有不可取代的地位。但LC-MS因涉及液相色譜儀與質(zhì)譜儀的使用，需要大型昂貴的儀器，樣品前處理與儀器操作較為復雜，需要專業(yè)人員來操作，故限制了其應用場景，不適用于TTX的現(xiàn)場快速檢測。

目前，不同的實驗室所使用的LC-MS/MS檢測方案不同（表3），導致檢測限、定量限與檢測范圍的較大差異。加之，各驗室的色譜柱、色譜儀、質(zhì)譜儀一系列儀器來源于Agilent、Waters等不同廠家的不同型號，同時樣品的處理方式各有不同，這就使得已報道的一些檢測方法中的儀器使用參數(shù)不具有通用性，未來應該通過實驗室間的協(xié)作對LC-MS/MS方案進行標準化，以進一步提高實驗室LC-MS/MS法的精密度。

Table 3 Laboratory protocol for LC-MS/MS method表3 LC-MS/MS法的實驗室方案

2.5 以TTX配體特性為基礎的適配體檢測技術(shù)

適配體是具有特異性識別功能的單鏈寡核苷酸分子，可折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)從而高親和力高特異性地結(jié)合配體分子。適配體由指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選得到，具體操作步驟：將靶標加入到預先設計好的隨機單鏈寡核苷酸文庫中，孵育一定時間后，分離出與靶標結(jié)合較好的寡核苷酸序列，并將其擴增后作為次級文庫繼續(xù)進行孵育篩選循環(huán)直至得到高親和力的核酸適配體序列。若要提高所得核酸適配體的特異性，可向篩選文庫中加入反篩靶標，移除與反篩靶標結(jié)合的單鏈寡核苷酸序列，便可提高所得核酸適配體序列的特異性［42］。

2012年，邵碧英等［43］首次報道了TTX核酸適配體的制備，將TTX固定于丙烯酸環(huán)氧乙烷珠子，利用SELEX技術(shù)，成功獲得了親和力吸光度值為1.343的G10適配體，開創(chuàng)了TTX適配體篩選的先河。2014年，邵碧英等［44］又獲得了對TTX高親和力的適配體A3，其親和力吸光度值為1.254，并利用該適配體序列，建立了DNA適配體-熒光染料法，對TTX的檢出限為10-6mol/L。自此，隨著適配體技術(shù)的發(fā)展，適配體檢測技術(shù)開始廣泛應用于TTX的檢測領域，表4列舉了目前已報道的適配體作為新型的分子識別元件的TTX檢測方法。

Table 4 The detection method of TTX molecular recognition element based on aptamer was established表4 以適配體作為TTX分子識別元件的檢測方法建立

目前已報道的利用TTX適配體建立的檢測方法主要將適配體為新型的分子識別元件與熒光、電化學、表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）等技術(shù)聯(lián)用，并應用于實際樣品檢測中，靈敏度高、特異性強、可靠性好。適配體的親和力與特異性可媲美單克隆抗體，但同時又有著單克隆抗體不可比擬的優(yōu)勢（表5），在實際檢測中將有更廣闊的應用場景。

2.6 TTX檢測方法的比較

4種TTX常用檢測方法的優(yōu)勢和不足（表6）。

Table 5 List of aptamers compared with antibodies表 5 適配體與抗體比較列表

3 總結(jié)與展望

TTX毒性極強且理化性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)烹飪手段難以使其失活，若不慎誤食或處理不當，極易導致中毒事故，對生態(tài)安全、食品安全與公共安全等領域產(chǎn)生較大威脅。故快速、高效、靈敏、特異的檢測技術(shù)是有效防范與應對TTX中毒事件的重要措施。生物檢測法、免疫檢測法與化學檢測法是TTX傳統(tǒng)檢測方法，但仍存在抗干擾能力不強且靈敏度不足的缺點，而適配體這一新型分子識別元件的出現(xiàn)，開辟了TTX檢測的新路徑，尤其是適配體與熒光技術(shù)、SERS技術(shù)等生物傳感器平臺聯(lián)合讓TTX的快速、超靈敏、實時檢測的實現(xiàn)成為可能。

TTX類似物較多，目前難以實現(xiàn)其商品化生產(chǎn)，故極大限制了其檢測等研究的發(fā)展，LC-MS法仍是分辨其類似物的最佳方式。隨著TTX多克隆抗體的出現(xiàn)，可以快速靈敏地檢測TTX及其類似物，而適配體技術(shù)的興起則展現(xiàn)出比抗體更大的優(yōu)勢，其易體外修飾改造的特性將為TTX類似物的識別提供巨大的優(yōu)勢與廣闊的應用前景。