核酸適配體在分子醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用*

張鑫娜 黃智勇 彭瑞資 1，**

（1）浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江省核酸適體與臨床診治重點實驗室，中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與腫瘤研究所，杭州 310022；2）天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072；3）湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長沙 410082）

分子醫(yī)學(xué)需要從疾病發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)出發(fā)，發(fā)展出預(yù)測、診斷和治療的個性化模式。作為生命體重要的遺傳物質(zhì)，核酸在分子醫(yī)學(xué)中起到重要功能，與遺傳、代謝、生物分子調(diào)控及生命體健康息息相關(guān)。天然核酸主要有脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的提出開啟了分子生物學(xué)的時代。作為一類重要的功能核酸，核酸適配體最初得名于能結(jié)合小分子有機染料的RNA片段，取自拉丁文“aptus”與希臘單詞“meros”，意為“fit”［1］，是Ellington和Tuerk兩位科學(xué)家在1990年的《自然》和《科學(xué)》雜志上首次提出來的。它通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得［2］，即從合成的單鏈DNA、RNA或者XNA（增強型的修飾核苷酸）［3］、HNA（特定結(jié)構(gòu)型的核苷酸如G四鏈體）文庫中獲得的對特定靶標(biāo)有高親和力、能調(diào)控生物活性的單鏈寡核苷酸分子［4］。核酸適配體靶標(biāo)范圍廣泛，可精確識別金屬離子、小分子、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和細(xì)胞，被譽為“化學(xué)家的抗體”［5］。作為一類識別分子，核酸適配體應(yīng)用于分子醫(yī)學(xué)能識別疾病標(biāo)志物、辨認(rèn)病變細(xì)胞，且分子質(zhì)量較小，可自動化、模塊化合成，穩(wěn)定性好、毒性低，適合于臨床應(yīng)用的分子探針和治療藥物［6-7］。本文主要綜述核酸適配體在疾病診斷、分子成像、靶向治療、腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

1 分子醫(yī)學(xué)中的核酸適配體

作為繼抗體和小分子后的又一類識別分子（寡聚核苷酸），核酸適配體在分子醫(yī)學(xué)中顯示出優(yōu)異的性能：a.在篩選周期上，核酸適配體篩選周期短，適合突發(fā)疾病靶標(biāo)的分子識別；b.在化學(xué)穩(wěn)定性上，物化性質(zhì)穩(wěn)定，可耐受較大范圍的酸堿度、溫度和較廣泛的有機溶劑，便于存儲；c.在分子質(zhì)量上，核酸適配體相對分子質(zhì)量更小，有良好的組織穿透能力和較低的免疫原性，不易引起機體的免疫反應(yīng)；d.在生產(chǎn)周期方面，可通過化學(xué)合成進行大量合成（亞磷酰胺法），合成成本低、批間差異??；e.在化學(xué)修飾方面，易于修飾改造，能連接眾多基團，實現(xiàn)與不同納米顆粒偶聯(lián)。核酸適配體的分子識別不依賴于堿基互補配對，而是折疊成特定的二級與三級結(jié)構(gòu)，通過空間結(jié)構(gòu)和靶標(biāo)分子構(gòu)象匹配［8-10］。

經(jīng)典的基于細(xì)胞的核酸適配體篩選步驟主要包括：第一步構(gòu)建文庫，文庫中的寡核苷酸通常由15～60種核苷酸組成，中間有一個隨機區(qū)域、兩端有固定序列，構(gòu)成多達(dá)425～1015個單鏈隨機寡核苷酸的文庫，RNA文庫還包含用于逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)合序列；第二步孵育，為了鑒定目標(biāo)特異性核酸適配體，需要將靶細(xì)胞與寡核苷酸文庫在指定溫度下孵育；第三步分離，先洗去未結(jié)合的非特異性序列再洗脫得到結(jié)合的序列；第四步反篩，將洗脫序列與陰性細(xì)胞孵育來進行反篩；第五步序列保留，去除與陽性分子和陰性分子都結(jié)合的序列，只保留與靶細(xì)胞結(jié)合而不與陰性細(xì)胞結(jié)合的特異性序列；第六步PCR擴增，特異結(jié)合靶細(xì)胞的DNA序列作為PCR擴增的模板，并且用作下一輪篩選的二級文庫。經(jīng)過多輪篩選和擴增（10～20輪），對靶細(xì)胞具有高親和力和高特異性的核酸適配體進行富集，通常親和力可以從2倍提高到29倍，潛在的核酸適配體在池中富集可以通過測序獲取DNA序列（圖1）。不同于DNA核酸適配體的 SELEX，RNA核酸適配體的 SELEX需使用T7 RNA聚合酶擴增以及PCR前需要逆轉(zhuǎn)錄［11］。依據(jù)經(jīng)典的SELEX篩選，已經(jīng)發(fā)展出很多高效的篩選方法，能夠簡化篩選過程或篩選得到改進的核酸適配體。最近開發(fā)了很多篩選方法，比如，從大型隨機L-DNA文庫中鏡像篩選出具有生物穩(wěn)定性核酸適配體［12］，將核酸適配體轉(zhuǎn)換為分子開關(guān)的大規(guī)模并行篩選［13］，能夠定量分離、可編程親和力的微流芯片篩選［14］，以官能團介導(dǎo)的靶向小分子的功能篩選［15］等。核酸適配體的分子修飾以及新篩選方法的開發(fā)，將極大擴展核酸適配體在分子醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

Fig.1 Schematic illustration of aptamer SELEX process圖1 核酸適配體篩選過程示意圖

2 核酸適配體在疾病診斷中的應(yīng)用研究

癌細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)的豐度、分布和構(gòu)象與正常細(xì)胞存在差異，上述特征可作為生物標(biāo)志物用于疾病診斷。通過核酸適配體對膜表面蛋白質(zhì)的分子識別，可實現(xiàn)對眾多腫瘤標(biāo)志物的體外檢測以及病理分析。目前已開發(fā)了一系列基于核酸適配體的診斷方法用于疾病早期篩查與診斷（圖2）。

Fig.2 Schematic illustration application of aptamers in disease diagnosis圖2 核酸適配體在疾病診斷中的應(yīng)用示意圖

2.1 基于核酸適配體的腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)

細(xì)胞膜作為細(xì)胞與周圍環(huán)境之間物質(zhì)和能量交換的門戶，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動方面起著至關(guān)重要的作用，在分子水平上實現(xiàn)癌癥相關(guān)膜蛋白的精確檢測尤為重要［16］。目前已報道了諸多腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)方法，比如蛋白質(zhì)組、二維凝膠電泳和差分成像凝膠電泳、質(zhì)譜、穩(wěn)定同位素、抗肽抗體捕獲和多重反應(yīng)監(jiān)測，但仍存在靈敏度和特異性低、穩(wěn)定性差等局限。其中，通過細(xì)胞篩選獲得與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的核酸適配體的方法是發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞膜表面標(biāo)志物的有利工具［7］。由于Cell-SELEX靶向的是活細(xì)胞，被核酸適配體靶向的生物標(biāo)志物可從細(xì)胞中分離出來，并通過質(zhì)譜分析鑒定。研究人員通過Cell-SELEX發(fā)現(xiàn)一系列有代表性的腫瘤標(biāo)志物（表1）。比如，Daniels等［17-18］利用核酸適配體GBI-10靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤衍生的細(xì)胞系U251鑒定到了Tenascin-C（腫瘤基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外蛋白質(zhì)），被認(rèn)為參與胚胎發(fā)生和致癌途徑。Mallikaratchy等［19］利用核酸適配體TD05發(fā)現(xiàn)了結(jié)合Ramos細(xì)胞膜表面的免疫球蛋白重μ鏈，可作為伯基特淋巴瘤的標(biāo)志物和治療靶點。上官棣華等［20-21］利用核酸適配體Sgc8c發(fā)現(xiàn)了跨膜受體PTK7的高表達(dá)與CCRF-CEM細(xì)胞之間存在強相關(guān)性，進一步發(fā)現(xiàn)PTK7蛋白可以作為T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的潛在生物標(biāo)志物。Yang等［22］利用核酸適配體靶向急性骨髓性白血病細(xì)胞系NB4并鑒定到Siglec-5蛋白，有望在臨床實踐中用于白血病細(xì)胞檢測和治療。Wu等［23-24］通過篩選獲得核酸適配體XQ-2d，并鑒定到CD71不僅在胰腺癌，而且在多種腫瘤中過度表達(dá)，為癌癥診斷和治療提供了有利輔助。Jia等［25］利用核酸適配體發(fā)現(xiàn)了鼻咽癌細(xì)胞系NPC5-8F過表達(dá)的CD109蛋白可作為鼻咽癌潛在的生物標(biāo)志物。Van Simaeys等［26］利用核酸適配體TOV6輔助發(fā)現(xiàn)了卵巢癌細(xì)胞系TOV-21G的標(biāo)志物STIP1。Wang等［27］基于亞細(xì)胞神經(jīng)突篩選到的核酸適配體yly12可以強烈結(jié)合神經(jīng)突，其分子靶標(biāo)被鑒定為L1CAM，是在正常神經(jīng)和各種癌癥中表達(dá)的一種表面抗原。Zhou等［28］基于篩選得到的核酸適配體發(fā)現(xiàn)了新的腫瘤驅(qū)動蛋白HDLBP，在小細(xì)胞肺癌特異性過表達(dá)，可以作為治療靶點。Zhang等［29］利用核酸適配體XQ-2d靶向葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞鑒定到CD71蛋白，其作為葡萄膜黑色素瘤的生物標(biāo)志物和治療靶點具有巨大潛力。類似地，Pan等［30］利用核酸適配體PZ-1靶向葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞鑒定到同樣有生物標(biāo)志物和治療靶點潛力的JUP蛋白。作為實現(xiàn)細(xì)胞膜生理功能的關(guān)鍵參與者，細(xì)胞膜蛋白占總蛋白質(zhì)的30%，而膜蛋白的類型和表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，核酸適配體本身作為核酸序列，更容易被應(yīng)用于基于高通量測序平臺的多組學(xué)研究中，從而為腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供新的策略。

Table 1 Representative biomarkers by Cell-SELEX表1 Cell-SELEX篩選的代表性的生物標(biāo)志物

2.2 基于核酸適配體的液體活檢

液體活檢能夠監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、評估療效，而且具有標(biāo)本易獲得、創(chuàng)傷性小、非侵入性、可反復(fù)采集等優(yōu)點。本節(jié)主要討論核酸適配體在液體活檢中對蛋白質(zhì)、細(xì)胞外囊泡、循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測。

2.2.1 核酸適配體與蛋白質(zhì)檢測

蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)承擔(dān)者，蛋白質(zhì)的檢測不僅可以揭示生命活動的發(fā)生規(guī)律，同樣對人類重大疾病發(fā)生發(fā)展的病理機制研究也有重要作用。MUC1是存在于上皮惡性腫瘤中的眾所周知的腫瘤標(biāo)志物，F(xiàn)erreira等［32］通過篩選到靶向MUC1的DNA核酸適配體進一步設(shè)計了核酸適配體-抗體-ELISA三明治結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)所構(gòu)建的傳感器可用于乳腺癌、膀胱腫瘤的早期診斷和其他上皮腫瘤的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性疾病檢測。正常條件下前列腺特異性抗原PSA主要存在于前列腺組織中，前列腺出現(xiàn)病變血清中的PSA濃度將升高，由此血清PSA可作為前列腺癌早期篩查的重要指標(biāo)，Min等［33-34］開發(fā)了基于核酸適配體電化學(xué)探針能同時檢測前列腺癌細(xì)胞的前列腺特異性膜抗原（PSMA）（+）和PSMA（-），并且可以用作前列腺癌早期診斷的工具。Qing等［35］基于核酸適配體構(gòu)建的電化學(xué)核酸適配體傳感器實現(xiàn)了對凝血酶的特異性和靈敏檢測，計算檢測限為1.26 fmol/L，為蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的靈敏檢測提供了范例。Zhang等［36］利用新開發(fā)的能特異性識別嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）野生型和變體刺突蛋白的二聚體DNA核酸適配體構(gòu)建了傳感器，用唾液樣本評估獲得了80.5%的臨床敏感性和100%的特異性，這是第一個報道的可以檢測SARS-CoV-2任何新變種的快速檢測方法。Curti等［37］基于核酸適配體構(gòu)建了檢測SARS-CoV-2刺突蛋白的電化學(xué)適配體傳感器，在不同的非目標(biāo)病毒蛋白沒有觀察到交叉反應(yīng)性，可擴展用于檢測其他可提供核酸適配體的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。因此，核酸適配體通過對蛋白質(zhì)的靈敏檢測幫助實現(xiàn)疾病早篩早診。

2.2.2 核酸適配體與細(xì)胞外囊泡檢測

細(xì)胞外囊泡攜帶多種反映親本細(xì)胞的蛋白質(zhì)，研究其表面蛋白為癌癥診斷提供了有力手段。近年來一系列新興的細(xì)胞外囊泡捕獲技術(shù)被開發(fā)出來。例如，Jiang等［38］報道了一種通過核酸適配體組修飾的金納米顆粒實現(xiàn)了對細(xì)胞外囊泡表面蛋白的捕獲和分析平臺，細(xì)胞外囊泡表面蛋白和核酸適配體的競爭性結(jié)合會取代原納米顆粒的核酸適配體，導(dǎo)致納米顆粒聚集，這種聚集繼而導(dǎo)致溶液變色從而實現(xiàn)識別并產(chǎn)生用于鑒定細(xì)胞外囊泡表面上多種蛋白質(zhì)的模式。Liu等［39］利用激光照射微流控芯片產(chǎn)生熱泳，并通過核酸適配體特異性識別腫瘤細(xì)胞外囊泡表面腫瘤相關(guān)膜蛋白，獲得了多個細(xì)胞外囊泡膜蛋白的信息，該技術(shù)可用于6種癌癥的早期自動分型檢測，為基于細(xì)胞外囊泡的腫瘤液體活檢領(lǐng)域提供了新的研究思路。此外，多參數(shù)輸入型檢測策略得到廣泛報道［40］。Feng等［41］針對結(jié)直腸癌患者外周血來源的細(xì)胞外囊泡的臨床診斷問題，圍繞多參數(shù)分子識別策略，以核酸適配體作為識別基團，開發(fā)了一種基于邏輯門的用于細(xì)胞外囊泡表面蛋白的智能診斷方法（圖3），該方法不僅能準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，而且應(yīng)用于臨床樣本，實現(xiàn)了對結(jié)直腸癌細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡實現(xiàn)多參數(shù)的分子診斷，從而為結(jié)直腸癌的分子診斷提供新的診斷策略。

Fig.3 Schematic illustration of extracellular vesicles derived from colorectal cancer for logic diagnosis圖3 核酸適配體編碼結(jié)直腸癌來源的細(xì)胞外囊泡邏輯診斷

2.2.3 核酸適配體與腫瘤循環(huán)細(xì)胞檢測

通過測量特定細(xì)胞的水平，臨床醫(yī)生可以預(yù)測疾病發(fā)生的風(fēng)險或者判斷患者對治療的反應(yīng)。以循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）為例，在成年男性血液中，大多數(shù)實體瘤細(xì)胞的平均細(xì)胞密度約為200/ml（占血液細(xì)胞總數(shù)的0.004%）［42-43］，需要高特異探針才能準(zhǔn)確檢測脫落到血液中的腫瘤細(xì)胞［44］。傳統(tǒng)的細(xì)胞分離方法，如介質(zhì)電泳和沉淀法、熒光活化細(xì)胞、基于PCR的細(xì)胞檢測靈敏度和特異性都難以用于CTC檢測。基于核酸適配體開發(fā)了一系列的電化學(xué)傳感器能實現(xiàn)高靈敏度CTC的檢測，例如，開發(fā)對癌癥細(xì)胞無需光學(xué)檢測系統(tǒng)的超靈敏檢測方法［45］、高效檢測罕見循環(huán)癌癥細(xì)胞的高靈敏度比色法［46］、無標(biāo)記的基于核酸適配體的化學(xué)發(fā)光生物傳感器［47］、與納米材料如量子點或單壁碳納米管結(jié)合［48］等。外周血中極其罕見的CTC的無損分離和富集以及可靠檢測對于腫瘤精準(zhǔn)診斷和治療具有相當(dāng)重要的意義，但目前仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。Song等［49］基于金納米的多價核酸適配體修飾技術(shù)以及巰基、谷胱甘肽的交換反應(yīng)，可以提高核酸適配體對靶細(xì)胞捕獲效率同時保證CTC無損釋放，在41例臨床樣本的盲測中對腫瘤患者的檢出率可以達(dá)到100%，在腫瘤分期和監(jiān)測等方面有重要應(yīng)用前景。Li等［50］基于臨床樣本的SELEX開發(fā)了胎兒有核紅細(xì)胞特異性的核酸適配體，能夠從母體細(xì)胞中高效富集靶細(xì)胞進行染色體分析，這是第一個開發(fā)用于有核紅細(xì)胞富集的核酸適配體報道，對胎兒無創(chuàng)產(chǎn)前診斷具有廣泛應(yīng)用潛力。Li等［51］基于核酸適配體識別實現(xiàn)了對血液中EpCAM陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞的無損分離和富集，并且可以滾環(huán)放大靈敏計數(shù)，有望為分析復(fù)雜外周血中極其罕見的CTC進行液體活檢提供有力工具。

2.3 基于核酸適配體的分子成像

分子成像是指在分子水平上對細(xì)胞或體內(nèi)功能生物分子進行非侵入性可視化、表征和測量［52］。分子成像可在影像檢查中點亮病灶，在深入了解生物過程、疾病的早期診斷、疾病評估等方面發(fā)揮著重要的作用。通過核酸適配體的分子靶向能力結(jié)合影像基團成像可以實現(xiàn)細(xì)胞和亞細(xì)胞中分子水平的可視化，為癌癥的早期篩查和診斷提供有力的分子工具。例如，Yan等［53］基于核酸適配體設(shè)計了單壁碳納米管的多功能可激活平臺，用于癌癥細(xì)胞成像大大減少了背景信號和增強對比成像。Wu等［24］利用核酸適配體XQ-2d對胰腺導(dǎo)管腺癌成像，臨床樣本的識別率為82.5%。Yang等［54］通過G四鏈體和球型核酸構(gòu)建了用于活細(xì)胞K+成像的熒光納米探針，當(dāng)K+存在時，G四鏈體序列從球形核酸上解離，從而使兩種熒光染料產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)K+的特異性檢測。Yuan等［55］利用轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞系核酸適配體J3實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)移性癌癥的組織成像，檢出率達(dá)73.9%。核酸適配體結(jié)合分子影像能用于早期腫瘤微小病灶的發(fā)現(xiàn)，可顯著提高對小病灶的診斷能力，相對抗體探針更安全通用、成本低廉。目前，基于核酸適配體的活體成像包括磁共振成像、氧化鐵或釓基納米顆粒造影劑、正電子斷層掃描和單光子發(fā)射轉(zhuǎn)換斷層掃描、放射性標(biāo)記成像。Ding等［56］對PTK7靶向的核酸適配體sgc8進行化學(xué)修飾和放射性標(biāo)記構(gòu)建了68Ga［Ga］-NOTA-SGC8偶聯(lián)物，并應(yīng)用于患者的全身正電子發(fā)射斷層顯像（PET）/計算機斷層掃描術(shù)（CT）動態(tài)掃描（圖4），這項研究中核酸適配體sgc8結(jié)合PET/CT在人體內(nèi)首次成像顯示出在腫瘤部位的積聚和血液的快速清除，是核酸適配體的首例人體全身動態(tài)藥代學(xué)PET/CT影像應(yīng)用。該研究不僅啟發(fā)未來開發(fā)更多基于核酸適配體的PET成像探針，也為核酸相關(guān)的醫(yī)學(xué)臨床轉(zhuǎn)化奠定了堅實的基礎(chǔ)，同時論證了在全景PET指導(dǎo)下新藥開發(fā)方式的可行性。

3 核酸適配體在藥物治療中的應(yīng)用研究

由于核酸適配體的高特異性、分子靈活性，且可靶向抗體無法結(jié)合的位點，近年來核酸適配體已被廣泛用于抑制劑開發(fā)、靶向藥物和納米藥物合成等多個領(lǐng)域（圖5）。

Fig.5 Schematic diagram of aptamer application in drug therapy圖5 核酸適配體應(yīng)用于藥物治療示意圖

3.1 基于核酸適配體的抑制劑

核酸適配體具有高選擇性、高親和力、易細(xì)胞內(nèi)化、快速的組織積累能力和良好的組織滲透能力等獨特優(yōu)勢，使其在新藥研發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的市場前景。早在2005年，Eyetech和Pfizer公司開發(fā)了基于靶向血管內(nèi)皮生長因子的核酸適配體，被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療新生血管年齡相關(guān)性黃斑變性，稱為“Macugen”（Pegaptanib sodium），該藥物是第一個獲批的用于眼部疾病抗血管生成的核酸適配體藥物，開啟了核酸適配體藥物治療的里程碑，引發(fā)一系列關(guān)注和研究［57-63］。之后，AS1411和NOX-A12等核酸適配體先后進入了臨床研究和臨床實驗［64］。另外，Yu等［65］研發(fā)的靶向硬骨抑素的長效修飾的核酸適配體候選藥物Apc001OA可以顯著促進成骨不全動物模型的骨形成，同時不會有抗體藥物的心血管風(fēng)險，已經(jīng)通過美國FDA兒童罕見病藥物認(rèn)定和孤兒藥認(rèn)定。還有很多具有診斷或治療潛力的核酸適配體，如Gelinas等［66］報道的抑制SARS-CoV-2刺突蛋白與其細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2結(jié)合、能在體外中和病毒的核酸適配體，Chu等［67］發(fā)現(xiàn)的與TNFR1結(jié)合并精確阻斷TNFR1活性以抑制潛在的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的核酸適配體。今年8月5日，Iveric Bio的核酸適配體藥物Avacincaptad Pegol被FDA批準(zhǔn)上市，這是一款阻斷C5的核酸適配體藥物，商品名為Izervay，用于治療地圖樣萎縮［68］。自1990年來首次報道核酸適配體，經(jīng)過30多年的發(fā)展，目前已經(jīng)有兩款核酸適配體上市，基于核酸適配體的抑制劑將是未來生物醫(yī)藥潛在的機遇。

3.2 基于核酸適配體的藥物偶聯(lián)物

核酸適配體藥物偶聯(lián)物（aptamer-drug conjugate，ApDC）通過簡單高效的精準(zhǔn)偶聯(lián)方法實現(xiàn)核酸適配體與天然藥物分子的連接，是實現(xiàn)精準(zhǔn)治療的分子利器。例如，PSMA是前列腺癌癥腫瘤標(biāo)志物，在前列腺癌癥上皮細(xì)胞上過表達(dá)并組成性地內(nèi)吞到胞內(nèi)，研究人員利用靶向PMSA胞外域的2'-氟嘧啶RNA核酸適配體［69］遞送藥物如化療劑［70］、毒素［71］或siRNA［72］治療前列腺癌癥，能夠有效地減少藥物用量并實現(xiàn)靶向治療。PTK7特異性結(jié)合急性淋巴細(xì)胞白血病T細(xì)胞的核酸適配體sgc8c可以內(nèi)化進入細(xì)胞［73］，Huang 等［74］和Shangguan等［75］將阿霉素與sgc8c共價偶聯(lián)，該偶聯(lián)物顯示出優(yōu)異的靶向毒性，對細(xì)胞CCRF-CEM的毒性增加了6.7倍。Castano等［76］和Mallikaratchy等［19］利用核酸適配體TD05與光敏劑偶聯(lián)，被激發(fā)的光敏劑與環(huán)境氧氣的相互作用來產(chǎn)生活性氧使惡性細(xì)胞凋亡或者壞死，核酸適配體靶向遞送顯著增強了效果。類似地，Taghdisi等［77］通過核酸適配體非共價連接柔紅霉可特異遞送至T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞并有效減少副作用。

目前，ApDC在活體應(yīng)用領(lǐng)域仍面臨諸多挑戰(zhàn)：a.由于血液中存在豐富的核酸酶，導(dǎo)致核酸適配體容易降解，核酸適配體的穩(wěn)定性亟待提高；b.由于核酸適配體的尺寸、親水性、極性等理化特性，易被腎臟清除，導(dǎo)致體內(nèi)半衰期短；c.由于核酸適配體受體內(nèi)溫度、離子濃度、特定組織器官和腫瘤微環(huán)境等因素的干擾，亟待解決核酸適配體在復(fù)雜環(huán)境中維持高親和力和構(gòu)象穩(wěn)定。普遍的解決策略主要為核酸適配體的化學(xué)修飾以及ApDC連接子的開發(fā)。目前，研究人員開發(fā)了一系列精準(zhǔn)的核酸適配體與抗癌藥物的偶聯(lián)策略，如根據(jù)藥物量身定制生物偶聯(lián)策略，常見的藥物分子雷公藤甲素、青蒿素、康普瑞汀、絲裂霉素、美登素、紫杉醇活性位點的定點偶聯(lián)，在乳腺癌和三陰性乳腺癌靶向治療效果顯著［78-80］。另外，根據(jù)自動化編程策略可精準(zhǔn)調(diào)控藥物分子的數(shù)量和位置，結(jié)果顯示，不同連接子的核酸適配體藥物偶聯(lián)物對藥物釋放和細(xì)胞毒性會產(chǎn)生作用影響，在靶向治療中取得了顯著效果［81］?；贏pDC組裝形成的多價ApDC納米結(jié)構(gòu)可以大幅提升實體瘤穿透能力和治療效果［82］。核酸適配體-蛋白質(zhì)降解靶向嵌合體（PROTAC）偶聯(lián)方法也被開發(fā)為一種新策略，可以提高常規(guī)PROTAC的腫瘤特異性靶向能力和體內(nèi)抗腫瘤效力，已經(jīng)在乳腺癌取得效果［83］。此外，通過核酸適配體延伸序列與核酸藥物的雜交可實現(xiàn)其靶向遞送，如短干擾RNA、小激活RNA、microRNA和反義寡核苷酸，以及基于環(huán)形RNA嵌入核酸適配體序列實現(xiàn)RNA的靶向遞送，擴展了核酸適配體藥物偶聯(lián)的應(yīng)用［84］。

3.3 核酸適配體納米藥物

納米藥物容易滲透進入腫瘤組織（和正常組織相比）并長期滯留的現(xiàn)象，使納米藥物有腫瘤治療效果。但是納米藥物的藥物富集容易受到新生血管結(jié)構(gòu)的差異、血壓、腫瘤病理類型和腫瘤位置的影響，不同個體療效會存在明顯差異。提高療效和減少非靶點副作用是納米藥物設(shè)計的關(guān)注點［85-86］。核酸適配體能夠選擇性地增加治療劑在癌癥細(xì)胞中的積累或保留，并減少正常細(xì)胞的死亡［84，87］?；诤怂徇m配體的功能化納米藥物，已被證實具有顯著促進藥物在腫瘤病灶富集的潛力，其對藥物內(nèi)化方式的改變甚至能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤的化療抗性，也在高分子材料偶聯(lián)表現(xiàn)出來顯著的優(yōu)勢［5］。一系列基于不同無機或有機納米材料的核酸適配體納米靶向藥已經(jīng)被構(gòu)建。例如，Zhang等［88］利用PSMA的核酸適配體偶聯(lián)聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米材料表現(xiàn)出比單一藥物明顯提高的腫瘤殺傷活性。Wang等［89］將PTK7的核酸適配體與金納米棒、Ce6光敏劑偶聯(lián)構(gòu)建了光熱和光動力聯(lián)合治療模式，顯著提高了對腫瘤的特異殺傷能力。Huang等［90］利用PTK7的核酸適配體構(gòu)建PEG-PLGA共聚物作為藥物載體共投遞用于淋巴細(xì)胞白血病的靶向協(xié)同治療。Shi等［91］利用靶向肺癌A549細(xì)胞的構(gòu)象可變型核酸適配體偶聯(lián)Au@Ag/Au雜合納米顆粒構(gòu)成的熒光成像和光熱治療的雙功能納米藥物，可以實現(xiàn)影像指導(dǎo)的實時治療。Wang等［92］構(gòu)建了核酸適配體Sgc8c與廣譜微管蛋白抑制劑康普瑞玎偶聯(lián)物，由DNA八面體框架程序化地裝載，DNA納米結(jié)構(gòu)的強滲透性和滯留效應(yīng)以及Sgc8c核酸適配體的主動靶向能力可以實現(xiàn)高選擇性的化學(xué)藥物輸送和有效的體內(nèi)成像，在小鼠原位腫瘤模型顯示優(yōu)良的生物安全性和抗癌功效（圖6）。核酸適配體作為能特異識別腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物的靶向配體，可以提高藥物分子在腫瘤組織中的富集來提高藥物的治療效果，該策略有望成為疾病治療中最有吸引力的靶向藥物之一。

Fig.6 DNA nanoframework structures loaded with aptamer-drug conjugate for targeted therapy of colorectal cancer圖6 DNA納米框架結(jié)構(gòu)裝載核酸適配體藥物偶聯(lián)物用于結(jié)直腸癌的靶向治療

3.4 核酸適配體介導(dǎo)的免疫治療

化療和放療是大多數(shù)癌癥的主要治療選擇，但在殺死高度增殖的癌細(xì)胞時，會對正常細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。免疫治療已成為攻克腫瘤的一種新療法。癌癥免疫治療方法現(xiàn)有的成功臨床結(jié)果大多是由針對免疫檢查點的抗體引領(lǐng)的，核酸適配體作為免疫原性小的靶向分子可以實現(xiàn)與單克隆抗體相同的治療效果［93-94］。例如，Xiong等［95］利用c-Met核酸適配體和CD16核酸適配體偶聯(lián)構(gòu)建的雙特異性核酸適配體可以將表達(dá)CD16的NK細(xì)胞招至表達(dá)c-Met的腫瘤細(xì)胞，從而增強對腫瘤細(xì)胞的特異殺傷效率。Herrmann等［96］利用靶向CTLA-4的核酸適配體偶聯(lián)基因藥物STAT3 siRNA可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，為免疫檢查點抑制療法提供了一個新思路。Prodeus等［97］利用PD1的核酸適配體可以特異性阻斷PD1和PDL1的結(jié)合從而激活抗腫瘤免疫，在PD1陽性荷瘤小鼠中能顯著抑制腫瘤生長，與抗體治療效果類似。Chen等［98］通過核酸適配體改造的NK細(xì)胞在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了對三陰性乳腺癌的靶向免疫治療，展示了三陰性乳腺癌免疫治療的新方法。FDA的雙特異性核酸適配體免疫療法，可以誘導(dǎo)人工免疫突觸，促進T細(xì)胞活化和隨后的腫瘤細(xì)胞裂解［99］，F(xiàn)u 等［100］利用靶向PD-1 的核酸適配體和核仁素的核酸適配體構(gòu)成免疫檢查點封鎖和腫瘤歸巢功能的雙特異性藥物。Zhang等［101］開發(fā)了基于PD-L1核酸適配體的納米球形核酸實現(xiàn)了高效且安全的腫瘤免疫治療，核酸適配體可以阻斷腫瘤細(xì)胞表面PD-L1蛋白表達(dá)，隨后近紅外光照射產(chǎn)生活性氧，同時釋放藥物，共同誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，該方法提高了腫瘤免疫療法的響應(yīng)及治療效果，有望為提高臨床腫瘤免疫治療療效、解決治療過程中出現(xiàn)的免疫相關(guān)不良反應(yīng)等提供新策略。

4 總結(jié)與展望

核酸適配體是通過模擬自然進化人工篩選獲得的核酸分子探針，作為能與靶標(biāo)高特異性、高親和力結(jié)合的識別分子，核酸適配體為分子醫(yī)學(xué)發(fā)展個性化的預(yù)測、診斷和治療模式提供了極佳的工具。核酸適配體的主要優(yōu)勢包括：與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和力強、合成簡單快速、容易化學(xué)修飾、靶標(biāo)范圍廣、組織穿透性好、免疫原性小，有望直接用于活體分子成像和靶向藥物。本文主要總結(jié)核酸適配體篩選技術(shù)及其在疾病診斷和腫瘤治療中的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用。

目前基于核酸適配體的分子醫(yī)學(xué)研究整體仍處于初期，從基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究走向臨床診療和產(chǎn)業(yè)化之前，仍存在一系列難題。首先，基于細(xì)胞和活體篩選獲得的核酸適配體與其靶標(biāo)的鑒定過程耗時長，而且基于應(yīng)用場景的篩選還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，從而限制了核酸適配體的實際應(yīng)用。第二，由于核酸適配體與蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)表征復(fù)雜，對核酸適配體與靶標(biāo)高親和力的機制以及構(gòu)效關(guān)系認(rèn)知不足，限制了對核酸適配體優(yōu)化改造及精準(zhǔn)調(diào)控。第三，核酸適配體作為寡聚核苷酸在活體內(nèi)容易被酶降解，半衰期短，從而限制了核酸適配體藥物偶聯(lián)物在靶向治療藥物開發(fā)中的應(yīng)用。盡管諸多研究報道可通過官能團修飾（人工堿基、膽固醇、聚乙二醇、磷酸骨架的硫代、溴、氨基、氟、甲基化等）、穩(wěn)定分子構(gòu)象或引入納米載體用于提高核酸適配體在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，但大多數(shù)研究仍處于實驗階段，而且實驗室開發(fā)使用的核酸適配體靶標(biāo)僅覆蓋臨床上少數(shù)靶分子如上皮細(xì)胞黏附分子、凝血酶，走向臨床應(yīng)用還有一段路。近期，基于核酸適配體的側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)在體外診斷領(lǐng)域得到應(yīng)用，譬如通過篩選得到的核酸適配體可實現(xiàn)對SARS-CoV-2核衣殼蛋白的檢測。隨著篩選技術(shù)的發(fā)展和核酸適配體性能的進一步提升，以及核酸適配體作為核酸分子的可測序性，相對抗體具備高通量、高靈敏檢測的能力，未來在分子醫(yī)學(xué)中核酸適配體將得到更廣泛的應(yīng)用，成為保障公眾健康的重要武器。