地衣芽孢桿菌對鯽魚免疫功能、抗氧化能力及腸、肝組織結(jié)構(gòu)的影響

■ 么寶蘭 劉蕓娜 劉 佳 閆子豪 李月紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

近年來，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用引發(fā)出一系列耐藥性和環(huán)境問題，為了尋求更好的解決辦法，越來越多的學者嘗試將益生菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中。芽孢桿菌是益生菌中常見的菌種，其中地衣芽孢桿菌在芽孢桿菌中是最具應(yīng)用前途的菌種，因其安全、耐熱、能分泌多種酶和產(chǎn)酶量高等優(yōu)點而備受關(guān)注。地衣芽孢桿菌易形成孢子，比較適合于添加到飼料中，能夠降解飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，使其被水產(chǎn)動物的腸道更加充分的吸收和利用。有研究表明，地衣芽孢桿菌不僅能夠增強水產(chǎn)動物機體免疫力，預(yù)防水產(chǎn)動物的疾病，還可以有效分解水體中的有害物質(zhì)。最重要的是能夠平衡腸道菌群，抑制致病菌的生長繁殖[1]。

嗜水氣單胞菌是一種重要的革蘭氏陰性、能動的桿狀細菌，是一種生活在淡水中的人畜共患病細菌，可導致水生動物、陸生動物和人類感染，廣泛存在于各種水體中[2]。嗜水氣單胞菌會產(chǎn)生毒性很強的外毒素，進而引發(fā)魚類出血性敗血癥[3]。該菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了水產(chǎn)動物的健康發(fā)展，同時也對人類的生命健康構(gòu)成威脅。

試驗以鯽魚為對象，探討飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯽魚抗氧化能力、免疫功能及肝、腸組織結(jié)構(gòu)的影響，為地衣芽孢桿菌的進一步研究奠定基礎(chǔ)，也為鯽魚的健康養(yǎng)殖開辟新的思路。

1 材料

1.1 菌種和試驗動物

地衣芽孢桿菌菌種、嗜水氣單胞菌菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院水產(chǎn)實驗室于-80 ℃保存。試驗鯽魚360 尾，平均體重為（51.5±0.5） g，購自長春市新立城水庫，基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1，購自浙江澳華飼料有限公司。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.2 主要耗材

超氧化物歧化酶試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒、補體C3 檢測試劑盒、補體C4檢測試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、免疫球蛋白M測定試劑盒和酸性磷酸酶測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

2 方法

2.1 菌種的活化與擴增

將地衣芽孢桿菌菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基[pH（7.3±0.1）]中活化，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌液倒入10 mL EP 管中，離心，離心后棄上清液，用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，并重懸于無菌生理鹽水中，均勻噴灑在基礎(chǔ)日糧飼料上，使飼料中地衣芽孢桿菌的含量達到108CFU/g，攪拌均勻后放入烘箱，37 ℃烘干即可，現(xiàn)做現(xiàn)用。

2.2 飼養(yǎng)管理

試驗鯽魚在80 L的玻璃缸中暫養(yǎng)14 d，選擇健康鯽魚360 尾，分為空白對照組（CK 組）、地衣芽孢桿菌試驗組（DY 組）、嗜水氣單胞菌攻毒組（CKG 組）和地衣芽孢桿菌治療組（DYG 組），每組隨機分配3 個重復，每個重復30 尾魚。CK 組和CKG 組以基礎(chǔ)飼料投喂，DY 組和DYG 組將地衣芽孢桿菌添加到基礎(chǔ)飼料中投喂，每日10：00—10：30、16：00—16：30 進行投喂，按3%體重日糧飼喂，連續(xù)投喂6 周，2 d 換一次水，每次換水40 L。

2.3 生長指標檢測

試驗開始時，分別測定各組鯽魚初始體重，飼喂6 周后，稱重前停食24 h，空腹測定終末體重，計算各組試驗魚的相對增重率和特定生長率。

相對增重率（%）=（終末體重-初始體重）/初始體重×100

特定生長率（%/d）=（In 終末體重-In 初始體重）/飼養(yǎng)天數(shù)×100

2.4 樣品采集

6 周投喂試驗結(jié)束后，每個玻璃缸中隨機選取9 尾魚取樣，使用MS-222（200 mg/L）麻醉，從尾靜脈抽取血液，4 ℃靜置24 h 用以制備血清。取肝、腸組織固定在固定液中用于制備組織學切片。石蠟切片的制作由塞維爾生物公司完成。然后通過腹腔注射嗜水氣單胞菌的方式對剩余各組鯽魚進行攻毒試驗。每尾魚經(jīng)腹腔注射0.2 mL嗜水氣單胞菌，將嗜水氣單胞菌懸浮在1×PBS里，劑量為107CFU/mL。攻毒24 h后，從各組隨機選擇9 尾魚，其余操作同上。攻毒期間觀察鯽魚的狀態(tài)并及時記錄死亡情況，14 d后結(jié)束感染試驗并統(tǒng)計累積死亡率。

累積死亡率(%)=累積死亡數(shù)量/初始數(shù)量×100

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用Tukey 多重比較分析組間差異顯著性，若P＜0.05 表示組間差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯽魚生長性能的影響

從表2 可知，與CK 組相比，DY 組可顯著提高鯽魚終末體重、相對增重率和特定生長率（P＜0.05）。

表2 地衣芽孢桿菌對鯽魚生長性能的影響

3.2 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯽魚血清免疫指標的影響

由圖1可知，6周飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，與CK 組相比，DY 組顯著提高鯽魚血清中ACP活性和C3、C4、IgM 含量（P＜0.05），DY組AKP活性有升高趨勢組不顯著（P＞0.05）。但是攻毒后，受地衣芽孢桿菌的保護，與CKG組比，DYG 組鯽魚血清中AKP、ACP 活性及C4 含量顯著提高（P＜0.05），但C3和IgM含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 地衣芽孢桿菌對鯽魚血清非特異性免疫指標的影響

3.3 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯽魚血清抗氧化能力的影響

由圖2可知，6周飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，DY組的鯽魚血清中的CAT、SOD 活性顯著高于CK 組（P＜0.05），MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05）。攻毒后，與CKG 組相比，DYG組的SOD活性、MDA含量相比CKG組差異顯著（P＜0.05），但CAT活性差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 地衣芽孢桿菌對鯽魚血清抗氧化指標的影響

3.4 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯽魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖3 和表3 可以看出，DY 組腸絨毛高度、寬度及肌肉厚度均高于對照組，CK 組和DY 組腸絨毛細胞結(jié)構(gòu)完整，細長呈指狀，形態(tài)較好。攻毒后,CKG 組腸道出現(xiàn)損傷，腸絨毛發(fā)生斷裂，腸上皮細胞排列紊亂，紋狀緣排列不規(guī)則，腸上皮細胞出現(xiàn)空泡化。DYG組較CKG 組的損傷較輕，紋狀緣和上皮細胞排列整齊，細胞邊界明顯。

圖3 地衣芽孢桿菌對鯽魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

3.5 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯽魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖4 可知，經(jīng)顯微觀察后，CK 組肝細胞排列緊密，邊界清晰，細胞質(zhì)致密，細胞核均居于細胞的中間，肝血竇清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，DY 組肝細胞與CK 組相差不大。CKG 組肝細胞核遷移，肝血竇充血，肝細胞出現(xiàn)損傷，肝細胞核溶解，排列紊亂，界限模糊，DYG 組的肝細胞較CKG 組情況有所好轉(zhuǎn)，損傷減少，排列逐漸清晰，情況有所緩解。

圖4 地衣芽孢桿菌對鯽魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

3.6 攻毒感染試驗

含地衣芽孢桿菌飼料喂養(yǎng)鯽魚6 周后，進行嗜水氣單胞菌注射攻毒試驗，感染期間累積死亡率的統(tǒng)計結(jié)果見圖5。CKG 組第1 天即出現(xiàn)死亡情況，6 d 內(nèi)死亡率急劇增加，接下來幾天開始減緩，14 d 內(nèi)的累積死亡率達83.33%；而DYG 組在第2 天出現(xiàn)死亡，死亡率顯著低于CKG組（P＜0.05）。

圖5 嗜水氣單胞菌感染 14 d 內(nèi)鯽魚累積死亡率

4 討論

水產(chǎn)養(yǎng)殖中益生菌的添加為魚類的健康生長提供了一種生態(tài)友好的預(yù)防措施。芽孢桿菌作為一種重要的益生菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用。王旭達等[4]投喂仿刺參含有不同濃度地衣芽孢桿菌的飼料，試驗結(jié)果表明投喂107CFU/g 和109CFU/g 地衣芽孢桿菌的仿刺參,不僅可以促進仿刺參的生長，顯著提高消化酶活性及免疫酶活性，還可以增強其對燦爛弧菌的抵抗能力。Peng 等[5]發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌T-1 的N-?；呓z氨酸乳糖YtnP 對鯽魚嗜水氣單胞菌感染具有抑制作用，可以通過減弱毒力因子的表達，增強對感染嗜水氣單胞菌的水生動物的保護作用，對嗜水氣單胞菌感染的最佳保護期在感染早期，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的早期預(yù)防。樊英等[6]在飼料中添加含活菌量達5×107CFU/g 和1×108CFU/g 的地衣芽孢桿菌投喂大瀧六線魚，研究發(fā)現(xiàn)兩種飼料對大瀧六線魚生長指標、腸道消化酶活性和非特異性免疫酶活性均有顯著提高。由于添加劑量不同，提高程度也有所不同。所以地衣芽孢桿菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖具有積極作用，能夠促進水產(chǎn)動物健康發(fā)展，并且具有作為水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防和控制的生物防治劑的潛力。

4.1 地衣芽孢桿菌對鯽魚生長性能的影響

在飼料中添加地衣芽孢桿菌可以促進動物生長。研究報道，添加地衣芽孢桿菌可以顯著提高草魚（Ctenopharyngodon idella）、羅非魚（Oreochromis spp）、肉雞、肉兔、斷奶仔豬等的生長性能。王佳昕等[7]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加地衣芽孢桿菌可以提高肉雞的生長性能，添加量為1.0×109CFU/kg 效果最佳。Elleithy等[8]研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中添加多種芽孢桿菌菌株顯著增加了體重。Qin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加地衣芽孢桿菌可以提高草魚的生長性能，可能是由于地衣芽孢桿菌分泌的消化酶，提高了飼料的消化和吸收。以上試驗結(jié)果與本試驗一致，因此飼料中添加適量的地衣芽孢桿菌可以提高魚的生長性能。

4.2 地衣芽孢桿菌對鯽魚血清免疫指標的影響

AKP作為一種重要的生物體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)酶，參與動物免疫反應(yīng)，能抵抗致病菌，殺死微生物和異物，加速物質(zhì)的吸收和運輸。AKP 和ACP 相互聯(lián)系，ACP是調(diào)控磷代謝的重要酶。補體是一種存在于脊椎動物血清和組織液中的多蛋白組分系統(tǒng)。激活后，它可以介導免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，導致病原微生物溶解或吞噬。IgM 具有殺菌、激活補體、免疫調(diào)節(jié)和凝集功能，并參與某些自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)的病理過程，在先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[10]。胡娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌HGcc-1 通過激活補體系統(tǒng)，增強鯉魚的非特異性免疫。Han 等[12]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌能夠增加羅非魚幼魚血清中補體C3 含量，提高溶菌酶的活性，添加的最佳濃度為4.4×106CFU/g。地衣芽孢桿菌不僅能夠促進羅非魚幼魚的生長，提高抗病性，還能促進前腸的發(fā)育，保持其完整性。Zhang 等[13]研究顯示飼喂1×107CFU/g 地衣芽孢桿菌和0.3%低聚果糖時三角鯛血清中的IgM 含量顯著增加。低聚果糖和地衣芽孢桿菌相互作用會更好地發(fā)揮作用，能顯著增強三角鯛的先天免疫、抗氧化能力并提高抗病性。以上研究結(jié)果與本試驗結(jié)果相似。本試驗中，DY 組鯽魚血清中AKP 活性有升高趨勢但并不顯著，攻毒后DYG 組中鯽魚血清中C3 和IgM 含量較CKG 組差異不顯著，可能是個體差異的原因。因此地衣芽孢桿菌對魚體的免疫機能具有積極作用。

4.3 地衣芽孢桿菌對鯽魚血清抗氧化能力的影響

SOD 和CAT 是魚體的抗氧化酶中的重要組成部分，可以保護魚類免受氧化損傷，SOD 被認為是抵御氧化應(yīng)激的第一道防線，能夠消除有害自由基以及減少氧化應(yīng)激發(fā)生[14]；CAT 是防止活性氧對細胞產(chǎn)生負面影響的主要抗氧化酶，可催化過氧化氫分解為水和氧[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，已被用作各種生物體氧化應(yīng)激的指標[16]，所以可以根據(jù)這些指標來評價魚體的抗氧化能力。高肖微等[17]的研究結(jié)果表明，飼料中添加地衣芽孢桿菌能夠顯著提高鯉魚SOD和CAT 的活性，說明在飼料里添加地衣芽孢桿菌，有利于提高鯉魚抗氧化能力，增強魚體免疫力，這與本研究結(jié)果相似。巴翠玉等[18]發(fā)現(xiàn)將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌進行組合可以提高鯽魚抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)GSH 和T-AOC 的含量，降低MDA 的含量。以上結(jié)果均顯示，地衣芽孢桿菌有助于保護魚類免受氧化應(yīng)激，提高魚體抗氧化能力。

4.4 地衣芽孢桿菌對鯽魚腸、肝組織結(jié)構(gòu)的影響

魚類腸道由黏膜層、黏膜下肌層和漿膜層四部分組成，是魚類消化和吸收功能的主要器官，對魚體的健康起著至關(guān)重要的作用[19]。Qin 等[9]研究發(fā)現(xiàn)在草魚的日糧中添加105CFU/g 和106CFU/g 地衣芽孢桿菌，絨毛高度和肌肉厚度顯著增加，因為地衣芽孢桿菌分泌的消化酶能夠促進腸道絨毛的增加，提高飼料利用率。Zhang 等[20]在鯉魚的養(yǎng)殖中，將地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑，各試驗組鯉魚腸道絨毛顯著高于對照組，表明其促進了腸絨毛的發(fā)育。邱燕等[21]在飼料中添加枯草芽孢桿菌投喂草魚，結(jié)果顯示微絨毛寬度和密度均顯著提高，說明枯草芽孢桿菌能夠促進草魚腸道微絨毛的生長發(fā)育，從而增加腸道的吸收面積，提高了飼料的消化率和吸收率。以上結(jié)果與本試驗一致，均表明地衣芽孢桿菌可以提高腸絨毛的長度，在改善魚類腸道健康方面發(fā)揮重要的作用。肝臟是魚類主要的代謝和解毒器官[22]。在其他的動物模型中，地衣芽孢桿菌已被證明對肝損傷具有保護作用，如Zhao 等[23]研究在膳食中添加地衣芽孢桿菌提高肉雞的生長性能、小腸和肝臟的形態(tài)以及對產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導的亞臨床壞死性腸炎的抗氧化能力中，亞臨床壞死性腸炎感染組的肝細胞嚴重腫脹，脂肪變性，飼喂地衣芽孢桿菌組的肝臟只有輕微的充血和細胞變性，得到了明顯的改善。與本研究結(jié)果一致，說明在飼料中添加地衣芽孢桿菌能夠預(yù)防肝損傷。

4.5 地衣芽孢桿菌對鯽魚抵抗嗜水氣單胞菌感染的影響

嗜水氣單胞菌作為引起水產(chǎn)動物病害的主要病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了極大的困擾[24]。通過腹腔注射的攻毒方式使試驗動物感染病原體，能夠清晰明確的看到試驗動物的狀態(tài)，從而直面的反映益生菌制劑的保護作用[25]。本試驗經(jīng)過嗜水氣單胞菌攻毒發(fā)現(xiàn)，日糧中添加地衣芽孢桿菌能夠有效提高鯽魚的抗病能力，降低鯽魚的累積死亡率。Chen 等[26]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌T-1 是一種安全的群體猝滅細菌、是一種潛在的益生菌。地衣芽孢桿菌T-1 顯著降低了感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚的死亡率，并將存活率提高到70%。Gobi 等[27]發(fā)現(xiàn)將濃度為107CFU/g 的地衣芽孢桿菌應(yīng)用至日糧中，結(jié)果顯示喂食地衣芽孢桿菌的魚類的累積死亡率顯著低于喂食對照飼料的魚類，表明其可以改善羅非魚養(yǎng)殖的健康狀況和對嗜水氣單胞菌的抗性。同本試驗結(jié)果相似。以上結(jié)果均表明，地衣芽孢桿菌可以提高水產(chǎn)動物對嗜水氣單胞菌的抗性，但具體的機制還有待進一步研究。

5 結(jié)論

綜上所述，研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌可以有效增強鯽魚對嗜水氣單胞菌的抵抗力，能夠替代抗生素作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌制劑，有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色可持續(xù)發(fā)展，保障水產(chǎn)品的食品安全，為魚類的養(yǎng)殖提供一種有前景的策略。